Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att testa glomerulär permeabilitet hos möss med en mycket känslig, icke-radioaktivt spårämne. Denna metod möjliggör repetitiva urin analyser med små urin volymer.
Abstract
Förlusten av albumin i urinen (albuminuri) förutspår kardiovaskulära resultat. Under fysiologiska förhållanden, små mängder av albumin filtreras av Glomerulus och återabsorberas i det tubulära systemet upp tills Absorptionsgränsen uppnås. Tidiga ökningar i patologisk albumin filtrering kan därför missas genom att analysera albuminuri. Därför förefaller det fördelaktigt att använda spårämnen för att testa glomerulär permselektivitet. Fluorescent märkt Tracer fluorescein isotiocyanat (FITC)-polysackaros (dvs FITC-Ficoll), kan användas för att studera glomerulär permselektivitet. FITC-polysackaromolekyler filtreras fritt av Glomerulus men inte återabsorberas i det rörformiga systemet. Hos möss och råttor har FITC-polysackaros undersökts i modeller av glomerulär permeabilitet genom att använda tekniskt komplexa procedurer (dvs. radioaktiva mätningar, vätskekromatografi med hög prestanda [HPLC], gelfiltrering). Vi har modifierat och underlättat en FITC-polysackarospårningsbaserade protokoll för att testa tidiga och små ökningar i glomerulär permeabilitet för FITC-polysackaros 70 (storlek av albumin) hos möss. Denna metod möjliggör repetitiva urin analyser med små urin volymer (5 μL). Detta protokoll innehåller information om hur tracerfitc-polysackaros 70 appliceras intravenöst och urin samlas in via en enkel urinkateter. Urin analyseras via en fluorescens-Plattläsare och normaliseras till en urin koncentrations markör (kreatinin), vilket undviker tekniskt komplicerade procedurer.
Introduction
Funktionella eller strukturella defekter inom den glomerulära filtrerings barriären ökar glomerulär permeabilitet för albumin, vilket resulterar i detektion av albumin i urinen (albuminuri). Albuminuria förutspår kardiovaskulära resultat och är en viktig markör för glomerulär skada1. Även låga nivåer av albuminuri, liggande inom det normala intervallet, är förknippade med en ökad kardiovaskulär risk1.
Under fysiologiska förhållanden, albumin filtreras genom Glomerulus och är nästan helt återabsorberas i det rörformiga systemet2,3. Hos möss utförs detekteringen av albumin i urinen vanligen genom ett albuminenzymlänkat immunosorbent-test (ELISA) från 24 timmar urin uppsamling. Om urin från en 24 h urin insamling eller plats urin används, små skillnader i albuminkoncentrationer kan missas på grund av assay känslighet problem. De flesta forskare, därför, använda djurmodeller där albuminuri induceras av robust njurskada på grund av toxiner, droger, och njur kirurgi.
Därför är konstaterandet av en känslig metod för att upptäcka små och övergående förändringar i glomerulär permeabilitet mycket viktigt för området. Rippe et al. har presenterat en råtta-modell för att testa glomerulär permeabilitet genom att tillämpa en Fluorescent märkt Tracer, nämligen FITC-polysackaros 70 (dvs FITC-Ficoll 70), i storlek med albumin4. Tracerapplikationen möjliggör testning av kortsiktiga förändringar i glomerulär permeabilitet (inom några minuter) och är mycket känslig4. Två studier har använt spår metoden i möss5,6. Trots dess fördelar, denna metod, tyvärr, har nackdelar: det är tekniskt mycket komplexa, radioaktiva, och invasiva. Ytterligare analys av urinen är endast åstadkommas med hjälp av gelfiltrering eller storlek-uteslutning HPLC5,6.
I detta dokument presenterar vi en alternativ, känslig, icke-radioaktiv och snabb metod för att mäta glomerulär permeabilitet hos möss med hjälp av fluorescerande märkt FITC-polysackaros 70. Genom att införa en transuretral kateter, urin insamling är mindre invasiv än urinblåsan punktering, urethrotomy, och suprapubisk kateter ansökan, och tillåter urin insamling minst var 30 min. urinanalys utförs från små mängder (5 μl) med hjälp av en fluorescerande Plattläsare. Spårningskoncentrationer i urinen normaliseras till kreatininkoncentrationer i urinen med hjälp av en enzymatisk kreatininhalt.
Därför, denna nya metod erbjuder ett känsligt verktyg för att studera tidig glomerulär skada med ökad glomerulär permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utredningarna genomfördes enligt de riktlinjer som beskrivs i handledningen för vård och användning av försöksdjur (US National Institutes of Health publikation nr 85-23, reviderad 1996). Alla djurförsök utfördes i enlighet med relevanta institutionella godkännanden (delstatsregeringen Landesamt für natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] referensnummer 84-02.04.2012. A397).
1. beredning av instrument, lösningar och utrustning
- Rekonstituera FITC-polysackaros 70 med 0,9% steril natriumklorid (NaCl) till en slutlig koncentration på 10 mg/mL (dvs. 100 mg i 10 mL NaCl).
- Dialyze FITC-polysackaros 70 lösning för att avlägsna fria FITC molekyler över natten vid 4 ° c (molekylvikt cut-off [MWCO] vid 10 000). Använd 1 L 0,9% steril NaCl per 10 mL FITC-polysackaros 70 under ständig omrörning. Skyddas mot ljus. Aliquot den dialyserade FITC-polysackaros 70 och förvara den vid-20 ° c.
- För FITC-polysackaros 70 bolus, tillsätt 4 μL 10 mg/mL FITC-polysackaros 70 lösning till 996 μL av 0,9% NaCl (den slutliga koncentrationen av FITC-polysackaros 70:40 μg/mL).
- Tillsätt 20 μl av en lösning med 10 mg/ml FITC-polysackaros 70 till 9,98 ml 0,9% steril NaCl som ger en slutlig koncentration på 20 μg/ml för lösningen för jämvikts.
- För den experimentella lösningen, tillsätt läkemedel eller substanser till infusionslösningen (t. ex. för angiotensin II [ang II] [100 ng/kg/min] för en 25 g mus, tillsätt 3 μL ang II av en 1 mM lösning).
- För operationen, Förbered en rakapparat, två kirurgiska klämmor, ett par kirurgiska saxar, två pincetter, två fina pincetter, ett par fin sax, och kompresser. Förbered 2 10 cm silke trådar (4-0 till 6-0) för ligering förfaranden.
- För placering av en central venkateter, Förbered en 10 mL spruta med en 21 G nål. Placera nålspetsen i en 30 cm lång kateter (med en innerdiameter [ID] på 0,58 mm). Anslut 0,58 mm katetern till en 10 cm kateter (med ett ID på 0,28 mm). Skär spetsen på den mindre katetern sned för att skapa en skarp spets som förs in i halsvenen.
- Förbered anestesi (dvs., intraperitoneal anestesi ketamin, 100 mg/kg kroppsvikt, och xylazin, 5 mg/kg kroppsvikt).
- Bered en 22 G angiocatheter genom att kasta nålen och markera katetern 1 cm från spetsen. Värm värmeplattan till 37 ° c.
- Förbered en blodtrycksmätare och Byt vid behov blodtrycks mätnings membranet.
2. förberedelsefasen
- Urinkateter
Anmärkning: avsnitt 2,1 följer det protokoll som beskrivs av Reis et al.7. Figur 1 och kompletterande figur 1 visar placeringen av en urinkateter hos honmöss.- Anesthetize musen med ketamin/xylazin (se steg 1,8). Använd Toe-Pinch test för att bekräfta ordentlig anestesi. För att bibehålla anestesi, upprepa anestesi (t. ex., med halva dosen) efter 60 min. ordentlig anestesi bekräftas om tå nypa test inte resulterar i reflex uttag.
Anmärkning: kvinnliga FVB-möss används i detta protokoll. - Placera musen i dorsala vilo på en 37 ° c värmedyna. Dra åt nedre delen av buken och hitta uretral ostium (t. ex. under Mikroskop).
- Använd plast delen av katetern i en 22 G angiocatheter och smörj den med Xylocain gel. Introducera den försiktigt 3 mm i uretral ostium medan parallellkoppling den distala Urethral axeln (figur 1a).
- Vrid toppen av angiocatheter 180 ° genom att hålla spetsen inom uretral ostium och bibehålla axeln i urinröret (figur 1b).
- Introducera katetern 7 mm längre in i musen så att den placeras i urinblåsan (figur 1c). Tvinga inte katetern bortom resistens. Korrigera kateterns position från början om motståndet känns. Notera att om positionen för urin katetern är korrekt, urin kan redan visas inom katetern.
- Placera en 1,5 mL brunt rör över toppen av angiocatheter att samla in urinen. Applicera 1 mL 0,9% NaCl subkutant för att öka urinproduktionen.
- Anesthetize musen med ketamin/xylazin (se steg 1,8). Använd Toe-Pinch test för att bekräfta ordentlig anestesi. För att bibehålla anestesi, upprepa anestesi (t. ex., med halva dosen) efter 60 min. ordentlig anestesi bekräftas om tå nypa test inte resulterar i reflex uttag.
- Central venkateter
- Raka halsen på musen och placera den i vilo med huvudet mot kirurgen. Hyperextend huvudet på musen med ett band.
- Desinficera halsen med 70% isopropanol. Gör ett litet hudsnitt (5 mm) under Käs linjen, med hjälp av en pincett och ett par sax. Skär huden ca 1 cm i riktning mot bröstbenet tills mitten av bröstbenet är nådd.
- Försiktigt dissekera huden på höger sida av halsen, med hjälp av ett par sax. Gör ett rektangulärt snitt av huden till höger sida av musen för att exponera den mjuka vävnaden i nacken. Använd ett par sax och en pincett. Fixera hudklaffarna med två klämmor.
Anmärkning: den våldsam attack venen löper längs den vänstra sidan av sköldkörteln eller är något täckt av den högra LOB i sköldkörteln. Efter detta steg, Använd ett mikroskop för kirurgi. - Noggrant exponera halsvenen genom trubbig förberedelse, med spetsen av den fina pincett. Undvik skador på ven grenar.
Obs: det kan vara nödvändigt att ta bort vävnad med fin sax. Var försiktig när du använder sax för att ta bort vävnad eftersom det ökar risken för blödning. - Placera och Stäng en ligatur med en silkestråd (4-0 till 6-0) vid den distala delen av den synliga halsvenen (mot huvudet av musen). Sätt spänningen på ligatur genom att fastställa silkes tråden med ett band för att säkerställa en liten spänning på halsvenen. Förbered en ligatur runt den proximala delen av våldsam attack ven.
- Fyll katetern med jämvikts infusionslösning (se steg 1,4) och fixera katetern med ett band så att katetern justerar halsvenen. Kontroll för bubblor för att undvika luftemboli.
- Lyft halsvenen med fin pincett på platsen för insättning (insättningspunkten är 1 – 2 mm proximala av ligatur). Rikta slangen parallellt till halsvenen. Punktera halsvenen, siktar på lumen, och skär för ca 2 – 4 mm, parallellerande axeln av halsvenen. Undvik alla Rask rörelser.
- Stäng ligatur för att fixera katetern. Kontroll för täthet av ligatur genom att noggrant Titta igenom mikroskopet. Sätt en fuktig Svabb över platsen för kirurgi.
- Blodtrycksmätning
- Placera svansen-manschetten på botten av musen svans medan musen lägger i dorsala recumbency. Starta mätningarna och upprepa dem 10X per tidspunkt. Bygg ett medelvärde från mätningarna.
- Justera stjärtmanschettens position om blodtrycksmätningar inte verkar korrekta och falska data produceras.
3. jämnings fas
- Byt urin uppsamlings röret innan jämnings fasen börjar och placera det på isen.
- Introducera en 10 mL spruta fylld med FITC-equilibrationfaslösning (se steg 1,4) med en 21 G nål och den större katetern (med ett ID på 0,58 mm) och placera den i sprutpumpen.
- Vik en pinne och placera den runt små kärl katetern (med ett ID på 0,28 mm) som förs in i halsvenen. Lägg katetern inuti pinnen. Placera en klämma över pinnen för att avskaffa retrograd blodflödet eller luftemboli. Anslut en 27 G nål med en 1 mL spruta fylld med FITC bolus till slutet av små kärl katetern.
- Öppna klämman och applicera FITC bolus (100 μL). Stäng klämman igen och Anslut den större katetern med den mindre katetern. Starta sprutpumpen med 0,008 mL/min (0,480 mL/h). Fortsätt infusionen under 60 min.
4. experimentell fas
Anmärkning: i denna fas kan effekten av läkemedel på glomerulär permselektivitet undersökas.
- Ändra urinröret (tid punkt 0 min) till en annan 1,5 mL brunt rör. Sätt en pinne runt den lilla kärlet katetern och Stäng en klämma som anges i steg 3,3.
- Koppla bort den stora katetern från den lilla kärl katetern. Byt sprutor till experiment fas lösningarna (se steg 1,5). Låt infusionspumpen köras så att den stora katetern fylls med en jämvikt lösning.
- Återanslut katetrar samtidigt undvika luftemboli och öppna klämman. Starta sprutpumpen på 0,008 mL/min.
- Fortsätt att köra sprutpumpen för 60 min och samla urinen i urinröret därefter (urin 60 min). Placera urinröret på is.
- Offra musen genom livmoderhalscancer dislokation under anestesi. Före kassering observeras musen i 5 minuter för att säkerställa att den är död.
5. urinanalys
-
Fluorescens-mätning
- Tina urin bassängen och späd den 1:10 med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
Obs: urinvägarna är en pool av urin som har samlats in från friska möss i en 12-24 h urin samling i en metabolisk bur. - Bered standarder för fluorescensmätningen. Ta 10 bruna 1,5 mL rör och märk dem för tomma (1:10 utspädd urin pool) och följande FITC-polysackaros 70 koncentrationer (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, och 160 μg/mL).
- Pipet 246 μL av utspädd urin pool i en 1,5 mL brunt rör och tillsätt 4 μL av FITC-polysackaros 70 lager koncentration (se steg 1,1) för att få en slutlig koncentration av 160 μg/mL FITC-polysackaros 70. Pipet 100 μL av den utspädda urin bassängen i alla andra rör.
- Späd ut 1:2 genom att Pipettera 100 μL av 160 μg/mL FITC-polysackaros 70 rör i 80 μg/mL-röret och fortsätta med de andra koncentrationerna. Säkerställa en korrekt blandning av de utspädda koncentrationerna (t. ex. genom att vortexera röret innan du fortsätter).
- Späd musens urinprov (0 min, 60 min) 1:10 med utspädd urinpool.
- Pipettera över 5 μl av varje standard FITC-polysackaros 70 koncentration och av musens urinprov som tripletter i en svart 384-brunn tallrik. Centrifugera plattan vid 1 000 x g i 15 s för att undvika bubblor.
- Analysera 384-brunnen plattan i en Plattläsare. Utför excitation vid 496 nm och mät fluorescensen vid 525 nm.
- Tina urin bassängen och späd den 1:10 med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
-
Kreatinin-mätning
- Följ tillverkarens anvisningar. I korthet, Förbered kreatinin-standarder genom att späda 10 μL av 100 mM kreatinin standardlösning med 990 μL kreatinin-analysbuffert för att bereda en 1 mM standardlösning.
- Tillsätt 0, 2, 4, 6, 8 och 10 μL av 1 mM kreatininstandardlösningen i en 96-brunn-platta för att generera 0, 2, 4, 6, 8 och 10 nmol/well-standarder. Lägg till kreatininanalysbufferten i varje brunn för att få volymen 50 μL.
- Bered reaktions blandningarna genom att tillsätta 42 – 44 μL kreatininanalysbuffert, 2 μl creatinase, 2 μL creatininas, 2 μL kreatinin-Enzymblandning och 2 μL kreatininsond. För det tomma, Använd 44 μL kreatininanalysbuffert, 2 μL creatinase, 2 μL kreatinin-Enzymblandning och 1 – 2 μL kreatinin-sond.
- Tillsätt 50 μL av lämplig reaktionsblandning till varje brunn i 96-brunnen plattan och inkubera den för 60 min på en horisontell shaker vid 37 ° c. Skydda plattan från ljus under inkubationen. Mät absorbansen vid 570 nm på en Plattläsare.
- Beräkna kreatininkoncentrationerna genom att subtrahera det tomma värdet från alla avläsningar. Resultatet kommer att ha enheten nanomoles/mikroliter. Multiplicera koncentrationen av kreatinin med molekylvikt av kreatinin (113,12 ng/nmol) att ta emot enheten nanogram/mikroliter.
6. analys av data
- Beräkna den FITC-polysackaros 70 urin koncentrationen från standardkurvan.
- Referera till FITC-polysackaros 70 urin koncentrationen till kreatininkoncentrationer i det representativa urinprovet.
- Referens urinen 60 min prover till urin 0 min prover av kontroller och behandlade möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som avbildas i figur 2, är metoden för att testa glomerulär permeabilitet hos möss byggs upp i tre faser. Den första fasen kallas förberedelsefasen, där en urinkateter och en central venkateter placeras. Den andra fasen kallas jämvikts fas, börjar med en intravenös bolus injektion av FITC-polysackaros 70 och följt av kontinuerlig infusion av FITC-polysackaros 70 för 60 min. Den sista fasen kallas experimentfasen. I denna fas, infusion av FITC-polysackaros 70 fortsätter och droger eller andra ämnen kan testas för att påverka glomerulär permeabilitet. Urin samlas i slutet av varje fas.
För att undersöka glomerulär permeabilitet inom denna Tracer modell, är det viktigt att placera en urinkateter ordentligt och utan att skada slemhinnan. Placeringen av en urinkateter i en kvinnlig mus blåsa visas i figur 1. Katetern är placerad 3 mm in i uretral ostium, parallellt med kraniocaudal uretral axeln (figur 1a). Katetern är vriden 180 ° mot svans av musen (figur 1b) och infördes 7 mm längre in i urinblåsan, parallellt med murina ryggraden (figur 1c, D).
Som beskrivits ovan, tidigare metoder för att testa glomerulär permeabilitet hos möss som används HPLC för att rena FITC-polysackaros 70 signaler från urinprov5,6. Eftersom denna metod använder fluorescensmätning utan en tidigare rening av spårämne, PBS, mus urin, och FITC-polysackaros 70 i mus urin analyserades. Figur 3a visar fluorescensskanningen av PBS med en fluorescenstopp vid 325 nm, vilket verkar vara en effekt av exciteringsblixten vid 290 Nm. Fluorescensskanningen av infödda mus urin visar en fluorescens maximum vid 395 nm (figur 3b). FITC-polysackaros 70 upplöst i mus urin visar en fluorescens maximum vid 525 nm (figur 3c, D). Figur 3c visar att mus urin inte stör fluorescensmätningen av FITC-polysackaros 70 i mus urin. Ökande koncentrationer av FITC-polysackaros 70 uppvisar en ökad fluorescensintensitet (figur 3E).
För att bevisa att denna metod är kapabel att upptäcka skillnader i glomerulär permeabilitet, Ang II tillämpades i den experimentella fasen av modellen. Ang II ökade den glomerulära permeabiliteten hos möss 60 min efter en kontinuerlig administrering i icke-blodtrycksrelevanta doser (figur 4a, B). Ökningen av glomerulär permeabilitet på grund av ang II kan blockeras av en ang II-receptorblockerare (ARB), nämligen candesartan (figur 4a). Ang II Wash-out minskade glomerulär permeabilitet (figur 4a). Blodtrycket mättes via svansen-manschetten metoden och visade inte signifikanta skillnader mellan grupperna (figur 4b). Polysackaros 70-och FITC-polysackaros 70-infunderade djur fungerar som kontroller för FITC-polysackaros 70-och ang II-behandlade djur (figur 4c).
Figur 1: placering av en urinkateter hos honmöss. Lateral visning av musen buken. (A) den märkta och smorda katetern introduceras 3 mm i den yttre Urethral ostium av en kvinnlig mus. Den kraniocaudal axeln av urinröret är parallellt med katetern. Noggrann spänning på nedre delen av buken med vänster pekfinger underlättar införandet av katetern i den yttre uretral ostium. (B) katetern är vriden 180 ° mot svans av musen. Spetsen på katetern förblir 3 mm inom den yttre uretral ostium. (C) katetern introduceras nu 7 mm längre in i urinblåsan. Kateterns riktning är i linje med den murina ryggraden. (D) ventrala syn på mus buken. Katetern placeras 10 mm i musen. (E) urin visas med en korrekt insättning i urinblåsan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk illustration av experimentella procedurer på en tidslinje. Efter narkos av musen, en urinkateter är placerad. Central venös kateter implanteras och baslinje urin erhålls (0 min). Efteråt appliceras FITC-polysackaros 70 bolus via den centrala ven katetern och en kontinuerlig infusion av FITC-polysackaros 70 påbörjas. Jämnings fasen för FITC-polysackaros 70 varar 60 min. urin samlas in efter jämnings fasen (0 min) och innan försöksfasen inleds. Inom denna fas kan läkemedel eller andra substanser (som angiotensin II) appliceras. I slutet av experimentfasen erhålls urin för analys (60 min). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: fluorescens av PBS och mus urin med och utan FITC-polysackaros 70. (A) fluorescensfrekvens Scan (excitation av 290 Nm, emission av 325-700 nm) av PBS visar en signal vid 325 nm, vilket verkar vara en effekt av excitation blixten vid 290 Nm. (B) i frekvens skanning av mus infödda urin (urin pool utspädd vid 1:10 och 1:20), det finns en signal med ett maximum på 395 nm, troligen orsakad av urin protein autofluorescence. (C) mus urin innehållande FITC-polysackaros 70 (40 μg/ml) visar en signal topp vid 525 nm som inte stör mätningen av urin autofluorescence. Dförstoring av den FITC-polysackaros 70 fluorescenstoppen beroende på emissionsvåglängden. Olika koncentrationer av FITC-polysackaros 70 (1,25, 2,5, 5, 10, 20 och 40 μg/mL) visas. (E) ökande FITC-polysackaros 70-koncentrationer uppvisar en ökning av fluorescensintensiteten vid emission av 525 nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: ANGIOTENSIN II (ang II) ökar glomerulär permeabilitet. (A) ang II ökar signifikant den glomerulära permeabiliteten hos möss, mätt med FITC-polysackaros 70-detektion i mössen urin (medelvärde + SEM; n = 5; p < 0,004, testad av Kruskal-Wallis test). FITC-polysackaros 70 koncentrationer i urinen refererade till urin kreatininkoncentrationer. De vita kolumnerna (0 min) representerar FITC-polysackaros 70 nivåer före starten av ang II stimulering, de svarta kolumnerna (60 min) representerar FITC-polysackaros 70 nivåer 60 min efter starten av ang II stimulering, och de grå kolumnerna (120 min eller + 60 min) efter en ytterligare 60 min av ang II stimulering eller 60 min av ang II Wash-out. (B) systoliskt blodtryck övervakades med svansen-manschettmetoden (medelvärde + SEM). Inga signifikanta blodtrycks skillnader mellan de kontroll-och ang II-behandlade grupperna noterades. (C) polysackaros 70 och FITC-polysackaros 70 förändrar inte glomerulär permeabilitet hos möss signifikant. Ang II ökar glomerulär permeabilitet hos möss signifikant (medelvärde + SEM; n = 7, p < 0,005). Denna siffra har modifierats från Konigshausen et al.8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Schematiskt diagram över placeringen av en urinkateter hos honmöss. Lateral visning av musen buken. (A) den märkta och smorda katetern introduceras 3 mm i den yttre Urethral ostium av en kvinnlig mus. Den kraniocaudal axeln av urinröret är parallellt med katetern. Noggrann spänning på nedre delen av buken med vänster pekfinger underlättar införandet av katetern i den yttre uretral ostium. (B) katetern är vriden 180 ° mot svans av musen. Spetsen på katetern förblir 3 mm inom den yttre uretral ostium. (C) katetern introduceras nu 7 mm längre in i urinblåsan. Kateterns riktning är i linje med den murina ryggraden. (D) ventrala syn på mus buken. Katetern introduceras 3 mm i den yttre uretral ostium av en kvinnlig mus. (E) efter att katetern har vridit 180 °, introduceras den 7 mm längre in i mus blåsan. Kateterns riktning är i linje med den murina ryggraden. Denna siffra har modifierats från Reis et al.7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade metoden gör det möjligt för prövaren att testa glomerulär permeabilitet hos möss på ett mycket känsligt sätt med hjälp av en Tracer. Med denna metod, kortsiktiga ökningar i glomerulär permeabilitet kan diagnostiseras med endast små mängder av urin. De mest kritiska stegen för att framgångsrikt bemästra denna teknik är 1) utveckla manuell expertis i mus kirurgi, särskilt i kanyleringen av en central ven, 2) Placera urin katetern utan att skada slemhinnan, och 3) manuell expertis vid hantering 384-bra tallrikar med små mängder av prover.
Vid placering av central venkateter, är det viktigt att katetern inte penetrerar halsvenen. För att undvika penetration, rekommenderar vi att sätta spänningar på halsvenen med en distala ligatur (se steg 2.2.7) och att lyfta halsvenen med fin pincett att förlänga lumen av halsvenen. För att hålla insättningsstället liten, försök att undvika grov rörelser medan du sätter in katetern och alltid säkerställa den bästa utsikten över det kirurgiska fältet genom att ta bort extra vävnad. Det mest kritiska steget i placeringen av urin katetern är den sista insättning i urinblåsan. Om motståndet känns, rekommenderar vi att börja om från början för att inte orsaka falska spår och skador på slemhinnan. Kateter rotation, smörjning och milda rörelser, samt utbildning, hjälp i svåra fall7.
FITC-polysackaros 70 är en Fluorescent märkt, grenade, och tvärbunden polymer av sackaros och epiklorhydrin9. Den beter sig i lösning som en globulära molekyl med en sfärisk form och med en låg form asymmetri men med en molekylär deformerbarhet9. Liksom andra sackaros molekyler, FITC-polysackaros 70 filtreras av Glomerulus och inte återabsorberas i det tubulära systemet4. För att undvika fria FITC molekyler i infusionen, dialyserade vi FITC-polysackaros 70 lösning innan applicering på möss. Det är möjligt att förvara dialyserade FITC-polysackaros 70 molekyler vid-20 ° c i månader. Som FITC-polysackaros 70 appliceras intravenöst i detta och andra protokoll, är det viktigt att inget blod förorenar urinprover. Därför, urin katetern måste placeras med försiktighet och antikoagulantia ämnen inom experimentet bör undvikas. Standardkurvan för FITC-polysackaros 70 är upplöst i mus urin pool för att få de mest exakta resultaten. På grund av koncentrations skillnader i urinen vid olika experimentella tidpunkter och mellan grupper, FITC-polysackaros 70 koncentrationer måste refereras till en markör i urinen som återspeglar urin koncentration (t. ex., kreatinin). Störningar av FITC-polysackaros 70 fluorescens med mätning av kreatinin i en enzymatisk analys är osannolikt.
Analysen av FITC-polysackaros 70 fluorescens bör utföras i svart 384-well plattor som små urin volymer på 5 μL kan mätas i dessa plattor. Vi rekommenderar inte att återanvända samma brunnar inom 384-brunn plattor, även efter tvättning plattorna, som fluorescens är fortfarande mätbara. Eftersom bubblor stör fluorescensbehandlingen bör plattorna centrifugeras före analysen. Alternativt kan bubblor förstöras manuellt med spetsen på en pipett.
Användningen av polysucroses för att testa glomerulär permselektivitet beskrevs nästan 40 år sedan10. Fluorescent märkt polysackaros har undersökts i glomerulär skada studier nästan uteslutande hos råttor under de senaste åren4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Detta kan ha anatomiska skäl på grund av enklare kirurgiska ingrepp hos råttor än hos möss. Hos råttor, urethrotomy används för att få urinprov4,5,9,12,13,14,21. För att analysera plasma-och urinprov utsätts sonderna för uteslutnings kromatografi med hög prestanda4,5,9,12,13,14 ,21. Dessutom mäts den glomerulära filtrationshastigheten (GFR) med radioaktivt 51CR-etylendiamin tetraättiksyra (EDTA)4,5,9,12,13 ,14,21. Två tidigare studier har applicerat FITC-polysackaros 70 i möss5,6. Hos möss introduceras en suprapubisk urinkateter i urinblåsan6,20. Urin-och plasma sonder utsätts för gelfiltrering före analysen av FITC-polysackaros 70 fluorescens. Liknande som hos råttor analyserades GFR via radioaktivitet6,20. Den andra publikationen om tillämpningen av FITC-polysackaros 70 i möss använder en modell av peritonealdialys permeabilitet och, därför, inte analysera mus urin för FITC-polysackaros 70 fluorescens22. Den presenterade metoden ändrades därför för att underlätta provtagning och analys av urin. Urinprov kan lätt erhållas genom en noninvasiv transuretral urinkateter. Urinanalys för FITC-polysackaros 70 fluorescens utförs utan någon tidigare högpresterande uteslutnings kromatografi eller gelfiltrering. Genom att referera FITC-polysackaros 70 fluorescens till mus urin kreatinin, mätning av GFR med en radioaktiv analys behövs inte.
Förhöjt blodtryck förbättrar glomerulär permeabilitet. Därför, blodtrycksövervakning är viktigt samtidigt undersöka glomerulär permeabilitet. De mest exakta blodtrycksmätningar i möss utförs via en central arteriell kateter23 behöver heparinization av katetern för att förhindra koagulering. Vi har upplevt problem med hematuri efter lågdos heparinisering och urinkateter placering. Därför bestämde vi oss för att utföra svans-manschetten teknik för att mäta blodtryck, som är noninvasiv och behöver inte heparinization. Beroende på djupet av anestesi, blodtrycksövervakning med svans-manschetten metoden är ibland utmanande. Blodtrycks membran måste kontrolleras i förväg och placeringen av musen bör optimeras före blodtrycks registrering.
Förutom utmaningar i blodtrycksmätning, denna teknik är också begränsad genom att producera godtyckliga enheter av FITC-polysackaros 70. Hittills har denna teknik endast undersökts hos djur och därför är dess relevans för det humana glomerulära filtret fortfarande okänt. Tidsintervaller för att undersöka ökningar i glomerulär permeabilitet beror på mus urinproduktion. Därför, mycket kortsiktiga ökningar i glomerulär permeabilitet (i minuter) kan missas på grund av bristen på mus urinproduktion. I detta protokoll, FITC-polysackaros 70 är normaliserad till urin kreatinin, som avlägsnas från blodet främst via glomerulär filtrering, men också av proximala tubulär sekretion. Detta kommer att introducera ett fel vid uppskattning av glomerulär permeabilitet med hjälp av denna metod, minska den uppmätta fraktionerad clearance av polysackaros24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Christina Schwandt, blanka Duvnjak och Nicola Kuhr för deras exceptionella tekniska stöd och Dr Dennis Sohn för hans hjälp med fluorescens Scan. Denna forskning stöddes av ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 till L.C.R. och L.S. Finansiär hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
