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Medicine

फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट-पॉलीसुक्रोस 70 के साथ चूहे में ग्लोमेरुलर पर्गमेबिलिटी का अत्यधिक संवेदनशील मापन

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59064
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

Summary

यहाँ, हम एक अत्यंत संवेदनशील, nonradioactive अनुरेखक का उपयोग कर चूहों में glomerular पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस विधि छोटे मूत्र की मात्रा के साथ दोहराव मूत्र विश्लेषण की अनुमति देता है.

Abstract

मूत्र में एल्बुमिन की हानि (एल्बुमिनुरिया) हृदय परिणाम की भविष्यवाणी करती है। शारीरिक स्थितियों के तहत, एल्बुमिन की छोटी मात्रा glomerulus द्वारा फ़िल्टर कर रहे हैं और अवशोषण सीमा तक पहुँच गया है जब तक ट्यूबलर प्रणाली में reabsorbed. रोग अल्बुमिन निस्पंदन में जल्दी बढ़ जाती है, इस प्रकार, एल्बुमिनुरिया का विश्लेषण करके याद किया जा सकता है। इसलिए, ग्लोमेरुलर permselectivity का परीक्षण करने के लिए अनुरेखकों का उपयोग लाभप्रद प्रतीत होता है। फ्लोरोसेंटलेबल ट्रेसर फ्लोरोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी)-पॉलीसुक्रोज (यानी, FITC-फिकॉल), ग्लोमेरुलर पर्मसेल्वरिटी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। FITC-polysucrose अणुओं को स्वतंत्र रूप से ग्लोमेरुलस द्वारा फ़िल्टर किया जाता है लेकिन ट्यूबलर सिस्टम में फिर से अवशोषित नहीं किया जाता है। चूहों और चूहों में, FITC-polysucrose तकनीकी रूप से जटिल प्रक्रियाओं का उपयोग करके glomerular पारगम्यता के मॉडल में जांच की गई है (यानी, रेडियोधर्मी माप, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी [HPLC], जेल निस्पंदन). हमने चूहों में FITC-polysucrose 70 (एल्बुमिन के आकार) के लिए ग्लोमेरूलर पारगम्यता में जल्दी और छोटी वृद्धि का परीक्षण करने के लिए एक FITC-polysucrose अनुरेखक-आधारित प्रोटोकॉल को संशोधित और सुविधा प्रदान की है। इस विधि के छोटे मूत्र की मात्रा के साथ दोहराव मूत्र विश्लेषण की अनुमति देता है (5 $L). इस प्रोटोकॉल ट्रेसर FITC-polysucrose 70 नसों में लागू किया जाता है और मूत्र एक साधारण मूत्र कैथेटर के माध्यम से एकत्र की है पर जानकारी शामिल है। मूत्र एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर के माध्यम से विश्लेषण किया है और एक मूत्र एकाग्रता मार्कर (creatininine) के लिए सामान्यीकृत, जिससे तकनीकी रूप से जटिल प्रक्रियाओं से परहेज.

Introduction

ग्लोमेरूलर निस्पंदन बाधा के भीतर कार्यात्मक या संरचनात्मक दोष एल्बुमिन के लिए ग्लोमेरूलर पारगम्यता में वृद्धि करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप मूत्र (एल्बुमिनुरिया) में एल्बुमिन का पता लगाया जाता है। Albuminuria हृदय परिणाम की भविष्यवाणी की है और glomerular चोट1के लिए एक महत्वपूर्ण मार्कर है. यहां तक कि एल्बुमिनुरिया के निम्न स्तर, सामान्य सीमा के भीतर झूठ बोल रही है, एक वृद्धि हुई हृदय जोखिम1के साथ जुड़े रहे हैं.

शारीरिक स्थितियों के अंतर्गत एल्बुमिन को ग्लोमेरुलस के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है और ट्यूबलर प्रणाली2,3में लगभग पूरी तरह से पुन: अवशोषित किया जाता है। चूहों में, मूत्र में एल्बुमिन का पता लगाने आमतौर पर मूत्र संग्रह के 24 एच से एक एल्बुमिन एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा किया जाता है। यदि मूत्र से एक 24 एच मूत्र संग्रह या हाजिर मूत्र का उपयोग किया जाता है, तो परख संवेदनशीलता समस्याओं के कारण एल्बुमिन सांद्रता में छोटे अंतर को याद किया जा सकता है। अधिकांश शोधकर्ताओं, इसलिए, पशु मॉडल जिसमें एल्बुमिनुरिया विषाक्त पदार्थों, दवाओं, और गुर्दे की सर्जरी के कारण मजबूत गुर्दे की चोट से प्रेरित है का उपयोग करें।

इसलिए, ग्लोमेरूलर पारगम्यता में छोटे और क्षणिक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील विधि का निष्कर्ष क्षेत्र के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। Rippe एट अल एक फ्लोरोसेंट लेबल अनुरेखक, अर्थात् FITC-polysucrose 70 (यानी, FITC-Ficoll 70) को लागू करने से glomerular पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए एक चूहा मॉडल प्रस्तुत किया है4. अनुरेखक अनुप्रयोग ग्लोमेरुलर पारगम्यता (मिनट के भीतर) में अल्पकालिक परिवर्तनों के परीक्षण की अनुमति देता है और बहुत संवेदनशील4होता है। दो अध्ययनों में चूहों में ट्रेसर विधि का प्रयोग किया गयाहै 5,6. इसके लाभों के बावजूद, इस विधि, दुर्भाग्य से, नुकसान है: यह तकनीकी रूप से बहुत जटिल है, रेडियोधर्मी, और आक्रामक. मूत्र का आगे विश्लेषण केवल जेल निस्पंदन या आकार-निष्कर्ष HPLC5,6 का उपयोग करके पूरा कियाजाताहै।

इस पेपर के भीतर, हम एक वैकल्पिक, संवेदनशील, nonradioactive, और तेजी से विधि fluorcently लेबल FITC-polysucrose 70 का उपयोग कर चूहों में glomerular पारगम्यता को मापने के लिए प्रस्तुत करते हैं. एक transurethral कैथेटर शुरू करने से, मूत्र संग्रह मूत्राशय पंचर की तुलना में कम इनवेसिव है, मूत्र throtomy, और suprapubic कैथेटर आवेदन, और मूत्र संग्रह की अनुमति देता है कम से कम हर 30 मिनट. मूत्र विश्लेषण छोटी मात्रा से किया जाता है (5 डिग्री एल) का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर. मूत्र में अनुरेखक सांद्रता एक एंजाइमी क्रिएटिनिन परख का उपयोग कर मूत्र में क्रिएटिनिन सांद्रता के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं।

इसलिए, इस उपन्यास विधि वृद्धि हुई glomerular पारगम्यता के साथ जल्दी glomerular चोट का अध्ययन करने के लिए एक संवेदनशील उपकरण प्रदान करता है.

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Protocol

ये जांच प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड (यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ पब्लिकेशन नंबर 85-23, संशोधित 1996) में उल्लिखित दिशानिर्देशों के अनुसार की गई थी। सभी पशु प्रयोगों प्रासंगिक संस्थागत अनुमोदन के अनुसार प्रदर्शन किया गया (राज्य सरकार Landesamt f]r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] संदर्भ संख्या 84-02.04.2012.A397).

1. उपकरणों, समाधान, और उपकरणों की तैयारी

  1. FITC-polysucrose 70 का पुनर्गठन 0.9% बाँझ सोडियम क्लोराइड (NaCl) के साथ एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 mg/mL (यानी, 100 मिलीग्राम NaCl के 10 एमएल में).
  2. डायलेज़ FITC-पॉलीसुक्रोस 70 समाधान मुक्त FITC अणुओं को हटाने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (आण्विक वजन में कटौती [MWCO] 10,000 पर). लगातार हलचल के तहत FITC-polysucrose 70 के 10 एमएल प्रति 0.9% बाँझ NaCl के 1 एल का प्रयोग करें। प्रकाश से रक्षा करें। अलीकोट डायलीज़्ड FITC-पॉलीसुक्रोस 70 और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. FITC-polysucrose 70 bolus के लिए, जोड़ें 4 $L 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 समाधान करने के लिए 996 $L के 0.9% NaCl (FITC-polysucrose 70 के अंतिम एकाग्रता: 40 g/
  4. तुल्यता जलसेक समाधान के लिए, एक 10 मिलीग्राम/एमएल FITC-पॉलीसुक्रोस 70 समाधान के 20 डिग्री एल को 0.98 एमएल के लिए जोड़ें 0.98 एमएल के लिए 20 g/mL की अंतिम सांद्रता के लिए उपज।
  5. प्रायोगिक समाधान के लिए, जलसेक समाधान में दवाओं या पदार्थों को जोड़ें (उदाहरण के लिए, एंजियोटेन्सिन II के लिए [अंग II] [100 एनजी/किलोग्राम/मिन] 25 ग्राम माउस के लिए, 1 एम एम समाधान के अंग II के 3 L जोड़ें)।
  6. सर्जरी के लिए, एक शेवर, दो सर्जिकल clamps, शल्य कैंची की एक जोड़ी, दो चम्भल, दो ठीक tweezers, ठीक कैंची की एक जोड़ी, और swabs तैयार करते हैं. लिगेशन प्रक्रियाओं के लिए दो 10 सेमी रेशम के धागे (4-0 से 6-0) तैयार की।
  7. एक केंद्रीय शिरापरक कैथेटर की नियुक्ति के लिए, एक 21 जी सुई के साथ एक 10 एमएल सिरिंज तैयार करते हैं। एक 30 सेमी लंबी कैथेटर में सुई की नोक प्लेस (एक आंतरिक व्यास के साथ [आईडी] 0.58 मिमी). एक 10 सेमी कैथेटर के लिए 0.58 मिमी कैथेटर कनेक्ट (की एक आईडी के साथ 0.28 मिमी). जुगल नस में पेश किया जाता है कि एक तेज टिप बनाने के लिए छोटे कैथेटर तिरछा की नोक कट।
  8. संज्ञाहरण तैयार करें (यानी, इंट्रापेरिटोनल संज्ञाहरण केटामाइन, शरीर के वजन के 100 मिलीग्राम/किलोग्राम, और xylazine, 5 मिलीग्राम/
  9. सुई को हटाकर और टिप से कैथेटर 1 सेमी को चिह्नित करके 22 जी एंजियोकैथेटर तैयार करें। हीटिंग पैड को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें।
  10. एक रक्तचाप डिवाइस तैयार करें और यदि आवश्यक हो तो रक्त-दाब मापने वाली झिल्ली बदलें।

2. तैयारी चरण

  1. मूत्र कैथेटर
    नोट: अनुभाग 2.1 प्रोटोकॉल के रूप में Reis एट अल द्वारा वर्णित इस प्रकारहै. चित्र ाााल1 और पूरक चित्रा 1 मादा चूहों में मूत्र कैथेटर की नियुक्ति दर्शाता है।
    1. केटामाइन/xylazine के साथ माउस Anesthetize (चरण 1.8 देखें). उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करने के लिए टो-पिंच परीक्षण का उपयोग करें। संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए, संज्ञाहरण दोहराने (जैसे, आधा खुराक के साथ) 60 मिनट के बाद. उचित संज्ञाहरण की पुष्टि की है अगर टो चुटकी परीक्षण पलटा रिनिकालेल में परिणाम नहीं है.
      नोट: महिला FVB चूहों इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड पर पृष्ठीय पुनर्नवीनीकरण में माउस को रखें। निचले पेट को कसें और मूत्रमार्ग ऑस्टियम (उदा., माइक्रोस्कोप के नीचे) पाते हैं।
    3. एक 22 जी एंजियोकैथेटर के कैथेटर के प्लास्टिक भाग का उपयोग करें और यह xylocaine जेल के साथ चिकनाई. दूरस्थ मूत्रमार्ग अक्ष (चित्र 1क) को समांतर करते समय इसे 3 उउ मूत्रमार्ग में सावधानीपूर्वक 3 उउ का परिचय दें।
    4. मूत्रमार्ग ऑस्टियम के भीतर टिप रखने और मूत्रमार्ग की धुरी को बनाए रखने के द्वारा एंजियोकैथेटर 180 डिग्री के शीर्ष को चालू करें (चित्र 1 ख)।
    5. कैथेटर का परिचय 7 मिमी आगे माउस में करें ताकि इसे मूत्राशय के भीतर रखा जा सके (चित्र 1ब्) । कैथेटर को प्रतिरोध से परे बाध्य न करें। यदि प्रतिरोध महसूस किया जाता है तो प्रारंभ से कैथेटर की स्थिति को सही करें। ध्यान दें कि अगर मूत्र कैथेटर की स्थिति सही है, मूत्र पहले से ही कैथेटर के भीतर प्रकट हो सकता है.
    6. मूत्र इकट्ठा करने के लिए एंजियोकैथेटर के शीर्ष पर 1.5 एमएल ब्राउन ट्यूब रखें। मूत्र उत्पादन बढ़ाने के लिए 0.9% NaCl के 1 एमएल को लागू करें।
  2. सेंट्रल शिरापरक कैथेटर
    1. माउस की गर्दन दाढ़ी और सर्जन की ओर सिर के साथ recumbency में जगह है. एक टेप के साथ माउस के सिर का हाइपरविस्तार करें।
    2. 70% आइसोप्रोपेनोल के साथ गर्दन को संक्रमित करें। एक नभक और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर, जबड़े के नीचे एक छोटी सी त्वचा चीरा (5 मिमी) बनाओ। स्टर्नम की दिशा में लगभग 1 सेमी त्वचा को काटें जब तक कि स्टर्नम के मध्य तक पहुंच न जाए।
    3. सावधानी से गर्दन के दाईं ओर त्वचा विच्छेदन, कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर. गर्दन के कोमल ऊतक को बेनकाब करने के लिए माउस के दाईं ओर त्वचा का एक आयताकार चीरा बनाएं। कैंची और एक tweezer की एक जोड़ी का प्रयोग करें. दो clamps के साथ त्वचा फ्लैप को ठीक करें.
      नोट: जुगल नस थायराइड ग्रंथि के बाईं ओर चलाता है या थोड़ा थायराइड ग्रंथि के सही पालि द्वारा कवर किया जाता है। इस कदम के बाद, सर्जरी के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    4. ध्यान से ठीक tweezer की नोक का उपयोग कर कुंद तैयारी से जुगल नस बेनकाब. नस शाखाओं को चोट से बचें।
      नोट: यह ठीक कैंची के साथ ऊतक को दूर करने के लिए आवश्यक हो सकता है. ऊतक को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करते समय सावधान रहें क्योंकि इससे रक्तस्राव का खतरा बढ़ जाता है।
    5. दृश्य जुगल नस (माउस के सिर की ओर) के दूरस्थ भाग पर रेशम के धागे (4-0 से 6-0) के साथ एक लिगेचर रखें और बंद करें। जुगल नस पर थोड़ा तनाव सुनिश्चित करने के लिए एक टेप के साथ रेशम के धागे फिक्सिंग द्वारा लिगेचर पर तनाव रखो। जुगल नस के निकट भाग के चारों ओर एक लिगेचर तैयार करें।
    6. कैथेटर को साम्य जलसेक समाधान के साथ भरें (चरण 1-4 देखें) और कैथेटर को टेप के साथ ठीक करें ताकि कैथेटर जुगल नस को संरेखित कर सके। बुलबुले के लिए नियंत्रण हवा एम्बोलिज्म से बचने के लिए।
    7. प्रविष्टि के स्थल पर ठीक छट्न के साथ जुगल नस लिफ्ट (प्रवेश स्थल लिगेचर के 1-2 मिमी आसन्न है).। जुगल नस के समानांतर ट्यूबिंग को संरेखित करें। जुगल नस पंचर, लुमेन के लिए लक्ष्य, और लगभग 2-4 मिमी के लिए डालने, जुगल नस की धुरी समानांतर. किसी भी तेज आंदोलनों से बचें।
    8. कैथेटर को ठीक करने के लिए लिगेचर को बंद करें। सूक्ष्मदर्शी के माध्यम से सावधानी से देखने के द्वारा लिगेचर की जकड़न के लिए नियंत्रण। सर्जरी के स्थल पर एक नम झाड़ू रखो.
  3. रक्तचाप माप
    1. माउस की पूंछ के नीचे पूंछ कफ रखें, जबकि माउस पृष्ठीय भार में देता है। माप शुरू और उन्हें समय बिंदु प्रति 10x दोहराएँ. माप से एक माध्य बनाएँ.
    2. यदि रक्तचाप माप सही नहीं लगते हैं और गलत डेटा का उत्पादन कर रहे हैं पूंछ कफ की स्थिति को समायोजित करें।

3. समानीकरण चरण

  1. समसंबंध चरण शुरू होने से पहले मूत्र संग्रह ट्यूब बदलें और इसे बर्फ पर रखें।
  2. एक 10 एमएल सीरिंज FITC समानता चरण समाधान के साथ भरा परिचय (चरण 1.4 देखें) एक 21 जी सुई और बड़ा कैथेटर के साथ (0.58 मिमी की एक आईडी के साथ) और यह सिरिंज पंप में जगह है.
  3. एक झाड़ू मोड़ और यह छोटे-वेसेल कैथेटर के चारों ओर डाल दिया ( 0.28 मिमी की एक आईडी के साथ) कि जुगल नस में पेश किया जाता है. झाड़ू के अंदर कैथेटर रखना. प्रतिगामी रक्त प्रवाह या वायु एम्बोलिज्म को समाप्त करने के लिए झाड़ू पर एक शिकंजा रखें। एक 27 जी सुई छोटे-वेसेल कैथेटर के अंत करने के लिए FITC बोलस से भरा एक 1 एमएल सिरिंज के साथ कनेक्ट करें।
  4. क्लैम्प खोलें और FITC बोलस (100 $L) लागू करें। फिर से दबाना बंद करें और छोटे कैथेटर के साथ बड़ा कैथेटर कनेक्ट. 0.008 एमएल/मिनट (0.480 एमएल/h) के साथ सिरिंज पंप शुरू करें। 60 मिनट के लिए जलसेक जारी रखें.

4. प्रायोगिक चरण

नोट: इस चरण में, ग्लोमेरूलर permselectivity पर दवाओं के प्रभाव की जांच की जा सकती है।

  1. मूत्र ट्यूब (समय बिंदु 0 मिनट) को एक और 1.5 एमएल ब्राउन ट्यूब में बदलें। छोटे-वेसेल कैथेटर के चारों ओर एक झाड़ू रखो और एक दबाना बंद के रूप में चरण 3.3 में संकेत दिया.
  2. छोटे-वेसेल कैथेटर से बड़े कैथेटर डिस्कनेक्ट करें। सीरिंज को प्रयोगात्मक चरण समाधानों में बदलें (चरण 1.5 देखें). जलसेक पंप चलाने के लिए इतना है कि बड़े कैथेटर संतुलन समाधान से भर जाता है चलो।
  3. कैथेटर को फिर से कनेक्ट करें, जबकि हवा एम्बोलिज्म से बचने और क्लैम्प को फिर से खोलें। 0.008 एमएल/मिनट पर सिरिंज पंप शुरू करें।
  4. 60 मिनट के लिए सिरिंज पंप चलाने जारी रखें और उसके बाद मूत्र ट्यूब (मूत्र 60 मिनट) के भीतर मूत्र इकट्ठा। मूत्र ट्यूब बर्फ पर रखें.
  5. संज्ञाहरण के दौरान गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस बलिदान. निपटान से पहले माउस 5 मिनट के लिए मनाया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए मर चुका है.

5. मूत्र विश्लेषण

  1. फ्लुओरेसेंट माप
    1. मूत्र पूल को थपथपाकर इसे फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ पतला कर दें।
      नोट: मूत्र पूल मूत्र का एक पूल है कि एक चयापचय पिंजरे में एक 12-24 एच मूत्र संग्रह में स्वस्थ चूहों से एकत्र किया गया है.
    2. फ्लोरोसेंट माप के लिए मानक तैयार करें। 10 ब्राउन 1.5 एमएल ट्यूब लें और उन्हें खाली (1:10 पतला मूत्र पूल) और निम्नलिखित FITC-पॉलीसुक्रोस 70 सांद्रता (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, और 160 g/
    3. एक 1.5 एमएल ब्राउन ट्यूब में पतला मूत्र पूल के 246 डिग्री एल और FITC-polysucrose 70 स्टॉक एकाग्रता के 4 डिग्री एल जोड़ें (चरण 1.1 देखें) 160 ग्राम/ अन्य सभी ट्यूबों में पतला मूत्र पूल के 100 डिग्री सेल्सियस पाइप्ट।
    4. 160 ग्राम/एमएल फिटसी-पॉलीसुक्रोस 70 ट्यूब में 80 डिग्री ग्राम/एमएल ट्यूब में 100 डिग्री सेल्सियल पाइप करके पतला करें और अन्य सांद्रता के साथ जारी रखें। पतला सांद्रता के उचित मिश्रण का आश्वासन (उदा., जारी रखने से पहले ट्यूब भंवर द्वारा)।
    5. पतला मूत्र पूल के साथ माउस मूत्र के नमूने (0 मिनट, 60 मिनट) 1:10 पतला.
    6. Pipette 5 प्रत्येक मानक FITC-polysucrose 70 एकाग्रता और एक काले 384 अच्छी तरह से थाली में triplicates के रूप में माउस मूत्र के नमूने के एल. बुलबुले से बचने के लिए 15 s के लिए 1,000 x ग्राम पर प्लेट सेंट्रीफ्यूज।
    7. एक थाली पाठक में 384 अच्छी तरह से थाली का विश्लेषण करें. 496 एनएम पर उत्तेजना प्रदर्शन और 525 एनएम पर फ्लोरोसेंट को मापने।
  2. Creatinine माप
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करें. संक्षेप में, एक 1 एम एम मानक समाधान तैयार करने के लिए क्रिएटिनिन परख बफर के 990 $L के साथ 100 मीटर क्रिएटिनिन मानक समाधान के 10 डिग्री एल को कम करके क्रिएटिनिन मानकों को तैयार करें।
    2. क्रमशः 0, 2, 4, 6, 8, और 10 $L को 96-वेल प्लेट में 0, 2, 4, 6, 8, और 10 nmol/well मानक उत्पन्न करने के लिए 1 m creatinine मानक समाधान के 0, 2, 4, 6, 8, और 10 nmol / प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए creatinine परख बफर जोड़ें करने के लिए मात्रा लाने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस.
    3. क्रिएटिनिन परख बफर के 42-44 डिग्री सेल्सियस जोड़कर प्रतिक्रिया घोला जा सकता है तैयार करें, क्रिएटिनेस के 2 डिग्री एल, क्रिएटिनिन एंजाइम मिश्रण के 2 डिग्री एल, और क्रिएटिनिन जांच के 2 डिग्री सेल्सियस। रिक्त के लिए, क्रिएटिनिन परख बफर के 44 डिग्री एल का उपयोग करें, क्रिएटिनाज़ के 2 $L, क्रिएटिनिन एंजाइम मिश्रण के 2 $L, और क्रिएटिनिन जांच के 1-2 $L.
    4. 96-वेल प्लेट में प्रत्येक के लिए उपयुक्त प्रतिक्रिया मिश्रण के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर एक क्षैतिज शेकर पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ऊष्मायन के दौरान प्लेट को प्रकाश से सुरक्षित रखें। एक प्लेट रीडर पर 570 एनएम पर अवशोषण उपाय.
    5. सभी रीडिंग से रिक्त मान घटाकर क्रिएटिनिन सांद्रता की गणना करें। परिणाम इकाई नैनोमोल्स/माइक्रोलीटर होगा। एकांकी नैनोग्राम/माइक्रोलीटर प्राप्त करने के लिए क्रिएटिनिन के आण्विक भार (113.12 एनजी/nmol) द्वारा क्रिएटिनिन की सांद्रता को गुणा करें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. मानक वक्र से FITC-polysucrose 70 मूत्र एकाग्रता की गणना.
  2. संदर्भ FITC-polysucrose 70 मूत्र सांद्रता प्रतिनिधि मूत्र नमूने में क्रिएटिनिन सांद्रता के लिए.
  3. नियंत्रण और इलाज चूहों के मूत्र 0 मिनट के नमूनों के लिए मूत्र 60 मिनट के नमूने का संदर्भ.

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Representative Results

जैसा कि चित्र 2में दर्शाया गया है, चूहों में ग्लोमेरिलर पारगम्यता का परीक्षण करने की विधि तीन चरणों में बनाई गई है। पहले चरण को तैयारी चरण कहा जाता है, जिसमें मूत्र कैथेटर और एक केंद्रीय शिरापरक कैथेटर रखा जाता है। दूसरे चरण को समभन चरण कहा जाता है, FITC-पॉलीसुक्रोस 70 के अंतःशिरा बोलस इंजेक्शन के साथ शुरू होता है और इसके बाद 60 मिनट के लिए FITC-पॉलीसुक्रोज़ 70 के निरंतर जलसेक के बाद। अंतिम चरण को प्रायोगिक अवस्था कहते हैं। इस चरण में, FITC-polysucrose 70 के अर्क जारी है और दवाओं या अन्य पदार्थों glomerular पारगम्यता को प्रभावित करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है. मूत्र प्रत्येक चरण के अंत में एकत्र किया जाता है।

इस अनुरेखक मॉडल के भीतर ग्लोमेलर पारगम्यता की जांच करने के लिए, एक मूत्र कैथेटर को ठीक से और श्लेष्म को घायल किए बिना रखना आवश्यक है। मादा माउस मूत्राशय में मूत्र कैथेटर की नियुक्ति चित्र 1में प्रदर्शित की जाती है. कैथेटर को 3 मिमी मूत्रमार्ग ऑस्टियम में रखा गया है, जो क्रैनियोऑडुल मूत्रमार्ग अक्ष के समानांतर है (चित्र 1क)। कैथेटर को माउस की पूंछ की ओर 180 डिग्री कर दिया जाता है (चित्र 1 ख) और मूत्राशय में 7 मिमी आगे की शुरुआत की, मयूरी रीढ़ के समानांतर ( चित्र1ब्, डी) .

जैसा कि ऊपर बताया गया है, चूहों में ग्लोमेरुलर पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए पिछले तरीकों का उपयोग एचपीएलसी ने मूत्र के नमूनों से FITC-पॉलीसुक्रोज 70 संकेतों को शुद्ध करने के लिए किया5,6. इस विधि के रूप में अनुरेखक के पिछले शुद्धि के बिना फ्लोरोसेंट माप का उपयोग करता है, पीबीएस, माउस मूत्र, और FITC-polysucrose 70 माउस मूत्र में विश्लेषण किया गया. चित्र ाा्वित 3क, पीबीएस के फ्लोरोसेंट स्कैन को 325 एनएम पर फ्लोरोसेंट पीक के साथ दिखाया गया है, जो 290 एनएम पर उत्तेजना फ्लैश का प्रभाव प्रतीत होता है। देशी माउस मूत्र का फ्लोरोसेंट स्कैन 395 एनएम पर एक फ्लोरोसेंट अधिकतम दिखाता है (चित्र 3ख)। FITC-पॉलीसुक्रोज 70 माउस मूत्र में भंग 525 एनएम पर एक फ्लोरोसेंट अधिकतम प्रदर्शित करता है (चित्र 3C, डी)। चित्रा 3सी से पता चलता है कि माउस मूत्र माउस मूत्र में FITC-पॉलीसुक्रोज 70 के फ्लोरोसेंट माप को परेशान नहीं करता है। FITC-पॉलीसुक्रोज 70 की बढ़ती सांद्रता एक बढ़ी हुई फ्लोरोसेंट तीव्रता को दर्शाती है (चित्र 3E)।

यह सिद्ध करने के लिए कि यह विधि ग्लोमेरूलर पारगम्यता में अंतरों का पता लगाने में सक्षम है, अंग II को मॉडल के प्रायोगिक चरण में लागू किया गया था। अंग द्वितीय ने गैर-रक्त-दाब-संबंधित खुराकों में निरंतर प्रशासन के बाद चूहों में ग्लोमेरूलर पारगम्यता में वृद्धि की (चित्र 4क, बी)। आंग द्वितीय के कारण ग्लोमेलर पारगम्यता में वृद्धि को आंग द्वितीय-रिसेप्टर अवरोधक (एआरबी) द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, अर्थात् कैन्डेसरन (चित्र 4क) । अंग-II धुलाई में कमी हुई ग्लोमेरुलर पारगम्यता (चित्र 4ए) रक्तचाप को टेल-कफ विधि के माध्यम से मापा जाता था और समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया गया था (चित्र 4ख) । पॉलीसुक्रोस 70- और FITC-polysucrose 70-infused जानवरों FITC-polysucrose 70- और अंग द्वितीय उपचार जानवरों के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा (चित्र 4C)।

Figure 1
चित्रा 1: मादा चूहों में मूत्र कैथेटर की नियुक्ति। माउस पेट का पार्श्व दृश्य. (ए) चिह्नित और चिकनाईयुक्त कैथेटर एक मादा माउस के बाहरी मूत्रमार्ग ऑस्टियम में 3 मिमी पेश किया जाता है। मूत्रमार्ग की कपालक अक्ष कैथेटर के साथ समांतर होता है। बाईं तर्जनी के साथ निचले पेट पर सावधान तनाव बाहरी मूत्रमार्ग ऑस्टियम में कैथेटर की शुरूआत की सुविधा. (ख) कैथेटर को माउस की पूंछ की ओर 180 डिग्री की ओर मुड़ जाता है। कैथेटर की नोक बाहरी मूत्रमार्ग ऑस्टियम के भीतर 3 मिमी बनी हुई है। (ग) कैथेटर को अब 7 मिमी आगे मूत्राशय में पेश किया गया है। कैथेटर की दिशा murine रीढ़ के साथ गठबंधन किया है. (डी) माउस पेट का वेंट्रल व्यू। कैथेटर माउस में 10 मिमी रखा गया है. (ई) मूत्राशय में सही प्रविष्टि के साथ मूत्र प्रकट होता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक समय रेखा पर प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का योजनाबद्ध चित्रण. माउस के narcosis के बाद, एक मूत्र कैथेटर रखा जाता है. केंद्रीय शिरापरक कैथेटर प्रत्यारोपित किया जाता है और आधारभूत मूत्र प्राप्त किया जाता है (0 मिनट). इसके बाद, FITC-polysucrose 70 बोलस केंद्रीय शिरापरक कैथेटर के माध्यम से लागू किया जाता है और FITC-polysucrose 70 की एक सतत जलसेक शुरू कर दिया है। FITC-polysucrose 70 के लिए तुल्यता चरण 60 मिनट रहता है. मूत्र तुल्यता चरण (0 मिनट) के बाद एकत्र किया जाता है और प्रयोगात्मक चरण शुरू होने से पहले। इस चरण के भीतर, दवाओं या अन्य पदार्थों (एंजियोटेन्सिन द्वितीय की तरह) लागू किया जा सकता है। प्रयोगात्मक चरण के अंत में, मूत्र विश्लेषण (60 मिनट) के लिए प्राप्त किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: के साथ और FITC-पॉलीसुक्रोज 70 के बिना पीबीएस और माउस मूत्र के फ्लोरोसेंट। (ए) पीबीएस के फ्लोरोसेंट आवृत्ति स्कैन (290 एनएम की उत्तेजना, 325-700 एनएम का उत्सर्जन) 325 एनएम पर एक संकेत दिखाता है, जो 290 एनएम पर उत्तेजना फ्लैश का प्रभाव प्रतीत होता है। (बी) माउस देशी मूत्र की आवृत्ति स्कैन में (मूत्र पूल 1:10 और 1:20 पर पतला), वहाँ 395 एनएम पर एक अधिकतम के साथ एक संकेत है, शायद मूत्र प्रोटीन autofluorscence के कारण. (ग) फिटीसी-पॉलीसुक्रोज युक्त माउस मूत्र 525 एनएम पर एक संकेत शिखर दिखाता है जो मूत्र स्व-प्रवाह की माप में हस्तक्षेप नहीं करता है। (घ) उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के आधार पर FITC-पॉलीसुक्रोज 70 फ्लोरोसेंट शिखर का आवर्धन। FITC-पॉलीसुक्रोस 70 (1.25, 2.5, 5, 10, 20, और 40 g/mL) की विभिन्न सांद्रता प्रदर्शित की जाती हैं। (ई) FITC-पॉलीसुक्रोज 70 सांद्रता में वृद्धि से पता चलता है कि 525 दउ के उत्सर्जन में फ्लोरोसेंट तीव्रता में वृद्धि हुई है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एंजियोटेन्सिन II (अंग द्वितीय) ग्लोमेरुलर पारगम्यता को बढ़ाता है। (ए) आंग II चूहों में ग्लोमेरुलर पारगम्यता को काफी बढ़ाता है, जो कि चूहों के मूत्र में FITC-पॉलीसुक्रोस 70 का पता लगाने से मापा जाता है (मतलब + SEM; द ] 5; p और 0.004, Kruskal-Wallis परीक्षण द्वारा परीक्षण किया). FITC-polysucrose मूत्र में 70 सांद्रता मूत्र क्रिएटिनिन सांद्रता के लिए संदर्भित किया गया. सफेद कॉलम (0 मिनट) अंग द्वितीय उत्तेजना की शुरुआत से पहले FITC-polysucrose 70 के स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं, काले कॉलम (60 मिनट) अंग द्वितीय उत्तेजना की शुरुआत के बाद 60 मिनट के स्तर 60 मिनट का प्रतिनिधित्व करते हैं, और ग्रे कॉलम (120 मिनट या +60 मिनट) एक के बाद अंग द्वितीय उत्तेजना के अतिरिक्त 60 मिनट या अंग द्वितीय washout के 60 मिनट. (ख) सिस्टोलिक रक्तचाप की निगरानी टेल-कफ विधि (मतलब ़ SEM) द्वारा की गई थी। नियंत्रण और आंग द्वितीय उपचार समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण रक्तचाप मतभेद नोट किया गया. (ग) पॉलीसुक्रोज 70 और FITC-पॉलीसुक्रोस 70 चूहों में ग्लोमेरूलर पारगम्यता में महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं करते हैं। आंग द्वितीय चूहों में glomerular पारगम्यता काफी बढ़ जाती है (मतलब + SEM; द , च और 0.005)। यह आंकड़ा Konigshausen एट अल से संशोधित किया गया है8. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: मादा चूहों में मूत्र कैथेटर की नियुक्ति का योजनाबद्ध आरेख. माउस पेट का पार्श्व दृश्य. (ए) चिह्नित और चिकनाईयुक्त कैथेटर एक मादा माउस के बाहरी मूत्रमार्ग ऑस्टियम में 3 मिमी पेश किया जाता है। मूत्रमार्ग की कपालक अक्ष कैथेटर के साथ समांतर होता है। बाईं तर्जनी के साथ निचले पेट पर सावधान तनाव बाहरी मूत्रमार्ग ऑस्टियम में कैथेटर की शुरूआत की सुविधा. (ख) कैथेटर को माउस की पूंछ की ओर 180 डिग्री की ओर मुड़ जाता है। कैथेटर की नोक बाहरी मूत्रमार्ग ऑस्टियम के भीतर 3 मिमी बनी हुई है। (ग) कैथेटर को अब 7 मिमी आगे मूत्राशय में पेश किया गया है। कैथेटर की दिशा murine रीढ़ के साथ गठबंधन किया है. (डी) माउस पेट का वेंट्रल व्यू। कैथेटर एक महिला माउस के बाहरी मूत्रमार्ग ऑस्टियम में 3 मिमी शुरू की है. (ई) कैथेटर 180 डिग्री हो जाने के बाद, इसे माउस मूत्राशय में 7 मिमी आगे पेश किया जाता है। कैथेटर की दिशा murine रीढ़ के साथ गठबंधन किया है. यह आंकड़ा रीस एट अल से संशोधित किया गया है7. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रस्तुत विधि अन्वेषक एक अनुरेखक का उपयोग कर एक बहुत ही संवेदनशील तरीके से चूहों में glomerular पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है। इस विधि के साथ, ग्लोमेरूलर पारगम्यता में अल्पकालिक वृद्धि का निदान मूत्र की केवल छोटी मात्रा का उपयोग करके किया जा सकता है। सफलतापूर्वक इस तकनीक में माहिर के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं 1) माउस सर्जरी में मैनुअल विशेषज्ञता विकसित कर रहे हैं, विशेष रूप से एक केंद्रीय नस के cannulation में, 2) mucosa को नुकसान पहुँचाए बिना मूत्र कैथेटर रखने, और 3) से निपटने में मैनुअल विशेषज्ञता 384-वेल प्लेट्स नमूनों की छोटी मात्रा के साथ.

जब केंद्रीय शिरापरक कैथेटर रखने, यह आवश्यक है कि कैथेटर जुगल नस घुसना नहीं है. प्रवेश से बचने के लिए, हम एक डिटेल लिगेचर के साथ जुगल नस पर तनाव डालने की सलाह देते हैं (चरण 2.2.7 देखें) और जुगल नस के लुमेन का विस्तार करने के लिए महीन चने के साथ जुगल नस को उठाएं। सम्मिलन साइट को छोटा रखने के लिए, कैथेटर डालने के दौरान सकल आंदोलनों से बचने की कोशिश करें और हमेशा अतिरिक्त ऊतक को हटाकर सर्जिकल क्षेत्र का सबसे अच्छा दृश्य सुनिश्चित करें। मूत्र कैथेटर की नियुक्ति में सबसे महत्वपूर्ण कदम मूत्राशय में अंतिम प्रविष्टि है। यदि प्रतिरोध महसूस किया जाता है, तो हम सुझाव देते हैं कि मुकामो के लिए झूठी पटरियों और चोट का कारण न होने के लिए शुरुआत से अधिक शुरू करें। कैथेटर रोटेशन, स्नेहन, और कोमल आंदोलनों, साथ ही प्रशिक्षण, मुश्किल मामलों में मदद7.

FITC-polysucrose 70 एक फ्लोरोसेंट लेबल, शाखा, और सुक्रोज और एपिक्लोरोहाइड्रिन9के पार से जुड़े बहुलक है। यह गोलकार आकार के गोलाकार अणु के रूप में तथा निम्न आकार की विषमता के साथ तथा आण्विक विकृति 9केसाथ विलयन में व्यवहार करता है। अन्य सुक्रोज अणुओं की तरह, FITC-polysucrose 70 ग्लोमेरुलस द्वारा फ़िल्टर किया जाता है और ट्यूबलर सिस्टम4में पुन: अवशोषित नहीं होता है। जलसेक में मुक्त FITC अणुओं से बचने के लिए, हम चूहों के लिए आवेदन करने से पहले FITC-polysucrose 70 समाधान dialyzed. यह महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर dilyzed FITC-polysucrose 70 अणुओं को स्टोर करने के लिए संभव है। के रूप में FITC-polysucrose 70 इस और अन्य प्रोटोकॉल में नसों में लागू किया जाता है, यह आवश्यक है कि कोई रक्त मूत्र के नमूने contaminates. इसलिए, मूत्र कैथेटर सावधानी और प्रयोग के भीतर anticoagulant पदार्थों के साथ रखा जाना चाहिए से बचा जाना चाहिए. FITC-polysucrose 70 के लिए मानक वक्र माउस मूत्र पूल में भंग कर दिया है सबसे सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए. विभिन्न प्रयोगात्मक समय अंक पर और समूहों के बीच मूत्र में एकाग्रता मतभेद के कारण, FITC-polysucrose 70 सांद्रता मूत्र में एक मार्कर है कि मूत्र एकाग्रता को दर्शाता है के लिए संदर्भित किया जाना चाहिए (उदा., creatinine). एक एंजाइमी परख में क्रिएटिनिन की माप के साथ FITC-पॉलीसुक्रोज 70 फ्लोरोसेंट के हस्तक्षेप की संभावना नहीं है।

FITC-polysucrose 70 फ्लोरोसेंट का विश्लेषण काले 384-वेल प्लेटों में किया जाना चाहिए क्योंकि इन प्लेटों में 5 डिग्री सेल्सियस के छोटे मूत्र की मात्रा को मापा जा सकता है। हम 384-वेल प्लेटों के भीतर एक ही कुओं का पुन: उपयोग करने की सिफारिश नहीं करते हैं, यहां तक कि प्लेटों को धोने के बाद भी, क्योंकि फ्लोरोसेंट अभी भी औसत दर्जे का है। बुलबुले फ्लोरोसेंट पढ़ने के साथ हस्तक्षेप के रूप में, प्लेटें विश्लेषण से पहले centrifuged किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, बुलबुले एक पिपेट की नोक के साथ मैन्युअल रूप से नष्ट किया जा सकता है।

ग्लोमेरुलर पर्मसेल्वरता का परीक्षण करने के लिए पॉलीसुक्रोस का उपयोग लगभग 40 वर्ष पहले10वर्ष पहले वर्णित किया गया था . पिछले वर्षों में लगभग विशेष रूप से चूहों में ग्लोमेरूलर चोट अध्ययनों में फ्लोरोसेंटलेबल पॉलीसुक्रोस की जांच की गई है4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. यह चूहों की तुलना में चूहों में आसान शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के कारण शारीरिक कारण हो सकता है. चूहों में मूत्रके नमूने4,5,9,12,13,14,21प्राप्त करने के लिए मूत्र का प्रयोग किया जाता है . प्लाज्मा और मूत्र के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए, जांच उच्च प्रदर्शन आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी4,5,9,12,13,14 के अधीन हैं ,21. इसके अलावा, ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर (जीएफआर) रेडियोधर्मी 51करोड़ एथिलीनडिएमिन टेट्राऐसीटिक एसिड (EDTA)4,5,9,12,13 द्वारा मापा जाता है ,14,21. पिछले दो अध्ययनों में FITC-polysucrose 70 चूहों में लागू किया गया है5,6. चूहों में, एक अधिपुबिक मूत्र कैथेटर को मूत्राशय6,20में पेश किया जाता है। मूत्र और प्लाज्मा जांच FITC-पॉलीसुक्रोज 70 फ्लोरोसेंट के विश्लेषण से पहले जेल निस्पंदन के अधीन हैं। चूहों की तरह ही जीएफआरका रेडियोसक्रियता 6,20के माध्यम से विश्लेषण किया गया। चूहों में FITC-polysucrose 70 के आवेदन से संबंधित दूसरा प्रकाशन peritoneal पारगम्यता के एक मॉडल का उपयोग करता है और इसलिए, FITC-polysucrose 70 फ्लोरोसेंट22के लिए माउस मूत्र का विश्लेषण नहीं किया. इसलिए, प्रस्तुत विधि को मूत्र नमूने और विश्लेषण की सुविधा के लिए संशोधित किया गया था। मूत्र के नमूने आसानी से एक noninvasive transurethral मूत्र कैथेटर के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. FITC-पॉलीसुक्रोज 70 फ्लोरोसेंट के लिए मूत्र विश्लेषण किसी भी पिछले उच्च प्रदर्शन आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी या जेल निस्पंदन के बिना किया जाता है। FITC-polysucrose 70 फ्लोरोसेंट माउस मूत्र creatininine को संदर्भित करके, एक रेडियोधर्मी परख के साथ GFR की माप की जरूरत नहीं है.

रक्तचाप में वृद्धि ग्लोमेरुलर पारगम्यता को बढ़ाती है। इसलिए, ग्लोमेरूलर पारगम्यता की जांच करते हुए रक्तचाप की निगरानी आवश्यक है। चूहों में सबसे सटीक रक्तचाप माप एक केंद्रीय धमनी कैथेटर के माध्यम से प्रदर्शन कर रहे हैं23 के थक्के को रोकने के लिए कैथेटर के heparinization की जरूरत है. हम कम खुराक heparinization और मूत्र कैथेटर प्लेसमेंट के बाद hematuria के साथ समस्याओं का अनुभव किया है. इसलिए, हमने रक्तचाप को मापने के लिए टेल-कफ तकनीक का प्रदर्शन करने का फैसला किया, जो गैर-आक्रामक है और हेपरिनाइजेशन की आवश्यकता नहीं है। संज्ञाहरण की गहराई पर निर्भर करता है, पूंछ कफ विधि के साथ रक्तचाप की निगरानी कभी कभी चुनौतीपूर्ण है. रक्तचाप झिल्ली अग्रिम में जाँच की जरूरत है और माउस की स्थिति रक्तचाप रिकॉर्डिंग से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए.

रक्तचाप माप में चुनौतियों के अलावा, इस तकनीक को भी FITC-polysucrose 70 की मनमाने ढंग से इकाइयों के उत्पादन के द्वारा सीमित है. अब तक, इस तकनीक केवल जानवरों में जांच की गई है और, इसलिए, मानव glomerular फिल्टर करने के लिए अपनी प्रासंगिकता अभी भी अज्ञात है. समय अंतराल glomerular पारगम्यता में वृद्धि की जांच करने के लिए माउस मूत्र उत्पादन पर निर्भर करते हैं. इसलिए, बहुत अल्पकालिक glomerular पारगम्यता में वृद्धि (मिनट में) माउस मूत्र उत्पादन की कमी के कारण याद किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, FITC-polysucrose 70 मूत्र creatininine, जो मुख्य रूप से glomerular निस्पंदन के माध्यम से रक्त से हटा दिया जाता है के लिए सामान्यीकृत है, लेकिन यह भी समीपस्थ ट्यूबलर स्राव द्वारा. यह एक त्रुटि का परिचय होगा जब इस विधि का उपयोग कर glomerular पारगम्यता का आकलन, polysucrose24की मापा आंशिक निकासी को कम करने.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों क्रिस्टीना Schwandt, Blanka Duvnzak, और निकोला Kuhr उनके असाधारण तकनीकी सहायता और डॉ डेनिस सोहन फ्लोरोसेंट स्कैन के साथ उनकी मदद के लिए धन्यवाद. इस शोध के लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था L.C.R. और L.S. funder अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for neck cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery 
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
BD Insyte Autoguard BD 381823  urinary catheter
Multimode Detector DTX 880 Beckman Coulter plate reader
384 well microtiterplate Nunc 262260 384 well platte
Creatinine Assay Kit Sigma-Aldrich MAK080 to measure creatinine concentration
96 well plate Nunc 260836 for creatinine assay 
FITC-labeled polysuccrose 70 TBD Consultancy FP70 FITC-ficoll
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525 used to test glomerular permeability
BP-98A Softron for blood pressure measurement
OTS 40.3040 Medite 01-4005-00 heating plate for mouse surgery
Instillagel 6mL Farco-Pharma GmbH for urinary catheter
Exacta Aesculap GT415 shaver

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References

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चिकित्सा अंक 150 Glomerular पारगम्यता polysucrose अनुरेखक एल्बुमिनुरिया माउस मूत्र कैथेटर माउस केंद्रीय शिरापरक कैथेटर भट्ठा डायाफ्राम glomerulus
फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट-पॉलीसुक्रोस 70 के साथ चूहे में ग्लोमेरुलर पर्गमेबिलिटी का अत्यधिक संवेदनशील मापन
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Königshausen, E., Potthoff, S.… More

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Woznowski, M., Stegbauer, J., Rump, L. C., Sellin, L. Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70. J. Vis. Exp. (150), e59064, doi:10.3791/59064 (2019).

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