Summary
Burada, farelerde çok hassas, radyoaktif olmayan bir izleyici kullanarak glomerüler geçirgenliği test etmek için bir protokol sıyoruz. Bu yöntem küçük idrar hacimleri ile tekrarlayan idrar analizleri sağlar.
Abstract
İdrarda albumin kaybı (albuminüri) kardiyovasküler sonucu tahmin eder. Fizyolojik koşullar altında, az miktarda albumin glomerulus tarafından süzülür ve emme sınırına ulaşıncaya kadar tübüler sistemde tekrar emilir. Patolojik albumin filtrasyonundaki erken artışlar albuminüri analiz edilerek gözden kaçabilir. Bu nedenle, glomerüler permselectivity test etmek için izleyicilerin kullanımı avantajlı görünür. Floresan etiketli tracer fluorescein izotiyoyanat (FITC)-polissökroz (yani, FITC-Ficoll), glomerüler permselectivity çalışma için kullanılabilir. FITC-polissucrose molekülleri glomerulus tarafından serbestçe süzülür, ancak boru sisteminde emilir. Fare ve sıçanlarda FITC-poliskroz, teknik olarak karmaşık prosedürler (yani radyoaktif ölçümler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi [HPLC], jel filtrasyon) kullanılarak glomerüler geçirgenlik modellerinde araştırılmıştır. Farelerde FITC-polysucrose 70 (albumin boyutu) glomerüler geçirgenlikte erken ve küçük artışları test etmek için FITC-polissucrose tracer tabanlı protokolü modifiye ettik ve kolaylaştırdık. Bu yöntem, küçük idrar hacimleri (5 μL) ile tekrarlayan idrar analizleri sağlar. Bu protokol, fitc-polisökroz 70'in intravenöz olarak nasıl uygulandığı ve basit bir idrar kateteri ile idrarın nasıl toplandığı hakkında bilgi içermektedir. İdrar bir floresan levha okuyucu ile analiz edilir ve bir idrar konsantrasyonu belirteci normalize (kreatinin), bu şekilde teknik olarak karmaşık prosedürler kaçınarak.
Introduction
Glomerüler filtrasyon bariyerindeki fonksiyonel veya yapısal bozukluklar glomerüler geçirgenliği arttırarak albümine (albuminüri) albumin saptanır. Albuminüri kardiyovasküler sonucu tahmin eder ve glomerüler yaralanma için önemli bir belirteçtir1. Hatta düşük albuminüri düzeyleri, normal aralıkta yalan, artmış kardiyovasküler risk ile ilişkilidir1.
Fizyolojik koşullar altında, albumin glomerulus yoluyla süzülür ve neredeyse tamamenboru sistemi 2,3emilir . Farelerde, idrarda albumin tespiti genellikle idrar toplama 24 saat bir albumin enzim bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) tarafından yapılır. 24 saat idrar toplama veya spot idrardan idrar kullanılırsa, taht hassasiyeti problemleri nedeniyle albümin konsantrasyonlarında küçük farklılıklar gözden kaçabilir. Çoğu araştırmacı, bu nedenle, hangi albuminüri toksinler, ilaçlar ve böbrek cerrahisi nedeniyle sağlam böbrek hasarı ile indüklenen hayvan modelleri kullanın.
Bu nedenle glomerüler geçirgenlikteki küçük ve geçici değişiklikleri saptamak için hassas bir yöntemin bulunması alan için çok önemlidir. Rippe ve ark. bir floresan etiketli tracer uygulayarak glomerüler geçirgenliği test etmek için bir sıçan modeli sunduk, yani FITC-polysucrose 70 (yani, FITC-Ficoll 70), albumin boyutunda4. Tracer uygulaması glomerüler geçirgenlik kısa vadeli değişikliklerin test sağlar (dakika içinde) ve çok hassas4. İki çalışmada farelerde izleme yöntemi kullanılmıştır5,6. Faydalarına rağmen, bu yöntem, ne yazık ki, dezavantajları vardır: teknik olarak çok karmaşık, radyoaktif, ve invaziv. İdrar ın daha fazla analizi sadece jel filtrasyon veya boyut dışlama HPLC5,6kullanılarak gerçekleştirilir.
Bu yazıda, floresan fitc-polissucrose 70 etiketli farelerde glomerüler geçirgenliği ölçmek için alternatif, hassas, radyoaktif olmayan ve hızlı bir yöntem salıyoruz. Transüretral kateter getirilerek, idrar toplama mesane delinmesi, üretrotomi ve suprapubik kateter uygulamasına göre daha az invazivdir ve idrar ın en az her 30 dakikada bir (5°L) kullanılarak idrar toplamasına izin verir. floresan plaka okuyucu. İdrarda tracer konsantrasyonları enzimatik kreatinin testi kullanılarak idrardaki kreatinin konsantrasyonlarına normalleşir.
Bu nedenle, bu yeni yöntem artmış glomerüler geçirgenlik ile erken glomerüler yaralanma çalışma için hassas bir araç sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Araştırmalar, Laboratuvar Hayvanlarının Bakım ve Kullanımı Rehberi'nde (ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Yayın No. 85-23, revize 1996) belirtilen esaslara göre yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri ilgili kurumsal onaylara uygun olarak yapılmıştır (devlet hükümeti Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] referans numarası 84-02.04.2012.A397).
1. Alet, çözeltin ve ekipmanların hazırlanması
- FITC-polissucrose 70'i %0,9 steril sodyum klorür (NaCl) ile 10 mg/mL (yani 10 mL NaCl'de 100 mg) son konsantrasyona yeniden oluşturun.
- Diyaliz FITC-polisökroz 70 çözeltisi 4 °C'de bir gecede serbest FITC moleküllerini çıkarın (molekül ağırlığı kesme [MWCO] 10.000). FitC-polysucrose 70'in 10 mL'si başına %0,9 steril NaCl'nin 1 L'sini sürekli karıştırma altında kullanın. Işıktan koruyun. Aliquot diyaliz FITC-polysucrose 70 ve -20 °C'de saklayın.
- FITC-polissucrose 70 bolus için, 4 μL 10 mg/mL FITC-polissucrose 70 çözeltisini %0,9 NaCl'nin 996 μL'sine ekleyin (FITC-polissucrose 70 son konsantrasyonu: 40 g/mL).
- Denge infüzyon çözeltisi için, 10 mg/mL FITC-polisucrose 70 çözeltisinin 20 μL'sini 9,98 mL'lik steril NaCl'nin %0,9'luk son konsantrasyonuna ve20 g/mL'ye ekleyin.
- Deneysel çözüm için, infüzyon çözeltisine ilaç veya madde ekleyin (örneğin, anjiyotensin II [Ang II] [100 ng/kg/dk] için 25 g fare için, 1 mM'lik bir çözeltinin 3 μL Ang II'sini ekleyin).
- Ameliyat için, bir tıraş, iki cerrahi kelepçe, bir çift cerrahi makas, iki cımbız, iki ince cımbız, bir çift ince makas ve bez hazırlayın. Ligasyon işlemleri için iki adet 10 cm ipek iplik (4-0-6-0) hazırlayın.
- Merkezi venöz kateterin yerleştirilmesi için 21 G iğneli 10 mL'lik bir şırınga hazırlayın. İğneucunu 30 cm uzunluğunda bir katetere (iç çapı 0,58 mm olan ) yerleştirin. 0,58 mm kateteri 10 cm'lik bir katetere bağlayın (0,28 mm kimlikle). Juguler ven içine tanıtılan keskin bir ipucu oluşturmak için küçük kateter eğik ucunu kesin.
- Anestezihazırlamak (yani, intraperitoneal anestezi ketamin, vücut ağırlığı 100 mg /kg, ve ksilazin, vücut ağırlığı 5 mg /kg).
- İğneyi atarak ve kateteri ucundan 1 cm uzakta işaretleyerek 22 G anjiyokateter hazırlayın. Isıtma yastığını 37 °C'ye Önceden ısıtın.
- Bir kan basıncı cihazı hazırlayın ve gerekirse kan basıncı ölçüm zarını değiştirin.
2. Hazırlık aşaması
- İdrar kateteri
NOT: Bölüm 2.1, Reis ve ark.7tarafından açıklanan protokolü izler. Şekil 1 ve Ek Şekil 1 dişi farelerde idrar kateterinin yerleştirisini göstermektedir.- Ketamin/xylazine ile fareyi anesthetize edin (bkz. adım 1.8). Uygun anesteziyi onaylamak için parmak ucutu testini kullanın. Anesteziyi korumak için, 60 dk.dan sonra anesteziyi (örneğin, yarım dozla) tekrarlayın.
NOT: Bu protokolde dişi FVB fareler kullanılmaktadır. - Fareyi 37 °C'lik bir ısıtma yastığıüzerinde dorsal recumbency'ye yerleştirin. Alt karın sıkın ve üretral ostium bulmak (örneğin, bir mikroskop altında).
- 22 G anjiyokateterkatenin kateterinin plastik kısmını kullanın ve ksikolosain jeli ile yağlatın. Distal üretral eksene paralel olarak üretral ostiuma 3 mm dikkatlice tanıtılar (Şekil1A).
- Ucu üretral ostium içinde tutarak ve üretra eksenini koruyarak anjiyokateterin üst kısmını 180° çevirin (Şekil1B).
- Kateteri 7 mm daha fazla farenin içine tanıtılar, böylece mesanenin içine yerleştirilir (Şekil1C). Kateteri direncin ötesine zorlamayın. Direnç hissedilirse kateterin konumunu baştan düzeltin. İdrar kateterinin pozisyonu doğruysa, idrarın kateter içinde görünebileceğini unutmayın.
- İdrar toplamak için anjiyokateterin üstüne 1,5 mL kahverengi bir tüp yerleştirin. İdrar üretimini artırmak için 1 mL %0.9 NaCl deri altı uygulayın.
- Ketamin/xylazine ile fareyi anesthetize edin (bkz. adım 1.8). Uygun anesteziyi onaylamak için parmak ucutu testini kullanın. Anesteziyi korumak için, 60 dk.dan sonra anesteziyi (örneğin, yarım dozla) tekrarlayın.
- Santral venöz kateter
- Farenin boynunu tıraş edin ve baş Cerraha doğru baş ile recumbency yerleştirin. Farenin başını bir bantla genişletin.
- % 70 isopropanol ile boyun dezenfekte. Bir cızırtı ve makas kullanarak çene çizgisinin altında küçük bir deri kesi (5 mm) yapın. Sternumun ortasına ulaşınakadar deriyi göğüs kafesi yönünde yaklaşık 1 cm kesin.
- Dikkatle boynun sağ tarafında deri incelemek, bir makas kullanarak. Boyun yumuşak doku ortaya çıkarmak için farenin sağ tarafına deri dikdörtgen bir kesi olun. Bir makas ve cızırtıcı kullan. Deri kapaklarını iki kelepçeyle düzeltin.
NOT: Juguler ven tiroid bezinin sol tarafı boyunca çalışır veya hafif tiroid bezinin sağ lob ile kaplıdır. Bu adımdan sonra, ameliyat için bir mikroskop kullanın. - İnce cızırtının ucunu kullanarak, künt hazırlıkla juguler damarı dikkatlice ortaya çıkar. Damar dallarının yaralanmasını önleyebilirsiniz.
NOT: İnce makaslı dokuların çıkarılması gerekebilir. Kanama riskini artırır gibi doku kaldırmak için makas kullanırken dikkatli olun. - Görünür şah damarının distal kısmına (farenin başına doğru) ipek iplikle (4-0-6-0) bir bağ yerleştirin ve kapatın. Şah damarı üzerinde hafif bir gerginlik sağlamak için bir bant ile ipek iplik sabitleme ile ligatür üzerinde gerginlik koyun. Juguler venin proksimal kısmı etrafında bir bağ hazırlayın.
- Kateteri denge infüzyon çözeltisi ile doldurun (bkz. adım 1.4) ve kateterin şah damarını hizalaması için kateteri bir bantla düzeltin. Hava embolisi önlemek için kabarcıklar için kontrol.
- Ekleme yerinde ince cımbız ile juguler ven kaldırın (ekleme sitesi ligatür 1-2 mm proksimal). Boruyu şah damarına paralel hizala. Lümeni hedefleyen juguler veni delin ve yaklaşık 2-4 mm boyunca, juguler ven eksenine paralel olarak yerleştirin. Herhangi bir tempolu hareketleri kaçının.
- Kateteri onarmak için bağı kapatın. Mikroskop üzerinden dikkatlice inceleyerek bağın sıkılığını kontrol edin. Ameliyat mahallinin üzerine nemli bir bez koy.
- Kan basıncı ölçümü
- Fare sırt recumbency yatıyor ise fare kuyruk alt kısmında kuyruk-manşet yerleştirin. Ölçümleri başlatın ve zaman noktası başına 10x tekrarlayın. Ölçümlerden bir ortalama oluşturun.
- Kan basıncı ölçümleri doğru görünmüyorsa ve yanlış veri üretiliyorsa kuyruk manşetinin pozisyonunu ayarlayın.
3. Denklik aşaması
- Denge fazı başlamadan önce idrar toplama tüpünü değiştirin ve buz üzerine yerleştirin.
- FITC denge fazı çözeltisi ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga (bkz. adım 1.4) 21 G iğne ve daha büyük kateter (0,58 mm kimlikli) ile şırınga pompasına yerleştirin.
- Kat bir bez ve juguler ven içine tanıtıldı küçük damar kateter (0,28 mm bir kimlik ile) etrafında koyun. Kateteri bezin içine koy. Retrograd kan akışını veya hava embolizmini ortadan kaldırmak için bezin üzerine bir kelepçe yerleştirin. 27 G'lık bir iğneyi FITC bolus ile doldurulmuş 1 mL şırınga ile küçük damar kateterin in sonuna bağlayın.
- Kelepçeyi açın ve FITC bolus (100 μL) uygulayın. Kelepçeyi tekrar kapatın ve daha büyük kateteri daha küçük kateterle bağlayın. Şırınga pompasını 0,008 mL/dk (0,480 mL/h) ile çalıştırın. 60 dk boyunca infüzyona devam edin.
4. Deneysel faz
NOT: Bu aşamada ilaçların glomerüler permselectivity üzerindeki etkisi araştırılabilir.
- İdrar tüpünü (zaman noktası 0 dk) başka bir 1,5 mL kahverengi tüpe çevirin. Küçük damar kateterinin etrafına bir bez koyun ve adım 3.3'te belirtildiği gibi bir kelepçeyi kapatın.
- Büyük kateteri küçük kap kateterinden ayırın. Şırıngaları deneysel faz çözümleriyle değiştirin (bkz. adım 1.5). İnfüzyon pompası, büyük kateterin denge çözeltisi ile doldurulması için çalıştırın.
- Hava embolisi kaçınırken kateterleri yeniden bağlayın ve kelepçeyi yeniden açın. Şırınga pompasını 0,008 mL/dk'dan başlatın.
- 60 dakika boyunca şırınga pompası çalıştırmaya devam edin ve bundan sonra idrar tüpü içinde idrar toplamak (idrar 60 dk). İdrar tüpünü buza yerleştirin.
- Anestezi sırasında servikal çıkığı ile fareyi kurban edin. Farenin bertaraf edilmeden önce 5 dakika boyunca ölü olduğundan emin olmak için gözlemlenir.
5. İdrar analizi
-
Floresan ölçümü
- İdrar havuzunu eritin ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1:10 seyreltin.
NOT: İdrar havuzu, metabolik bir kafeste 12-24 saat idrar toplama sağlıklı farelerden toplanan bir idrar havuzudur. - Floresan ölçümü için standartlar hazırlayın. 10 kahverengi 1,5 mL tüp alın ve boş (1:10 seyreltilmiş idrar havuzu) ve aşağıdaki FITC-polysucrose 70 konsantrasyonları (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 ve 160 μg/mL) için etiketleyin.
- Pipet 246 μL seyreltilmiş idrar havuzu 1,5 mL kahverengi tüp içine ve 4 μL FITC-polysucrose 70 stok konsantrasyonu (bkz. adım 1.1) 160 μg/mL FITC-polysucrose 70 son konsantrasyonelde etmek için ekleyin. Seyreltilmiş idrar havuzunun 100°L'lik kısmını diğer tüm tüplere yerleştirin.
- 160 μg/mL FITC-polisuçoz 70 borunun 100 μL'sini 80 μg/mL tüpe dönüştürerek 1:2 seyreltin ve diğer konsantrasyonlarla devam edin. Seyreltilmiş konsantrasyonların uygun karışımını temin edin (örneğin, devam etmeden önce tüpü girdaplayarak).
- Seyreltilmiş idrar havuzu ile fare idrar örnekleri (0 dk, 60 dk) 0:10 seyreltin.
- Pipet 5 μL her standart FITC-polysucrose 70 konsantrasyonu ve siyah 384-iyi plaka triplicates olarak fare idrar örnekleri. Kabarcıkları önlemek için 15 s için 1.000 x g plaka santrifüj.
- Bir tabak okuyucu384-iyi plaka analiz edin. 496 nm'de uyarma yapın ve floresan'ı 525 nm'de ölçün.
- İdrar havuzunu eritin ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1:10 seyreltin.
-
Kreatinin ölçümü
- Üreticinin talimatlarına uyun. Kısacası, 1 mM standart bir çözüm hazırlamak için 990 μL kreatinin test tamponu ile 100 mM kreatinin standart çözeltisinin 10 μL'sini seyrelterek kreatinin standartlarını hazırlayın.
- 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 μL 1 mM kreatinin standart çözeltiyi 96 kuyulu bir tabağa ekleyerek sırasıyla 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 nmol/well standartları oluşturun. Hacmi 50 μL'ye çıkarmak için her kuyuya kreatinin istine arabelleği ekleyin.
- 42-44 μL kreatinin gutaraffer, 2 μL kreatinase, 2 μL kreatininaz enzim karışımı ve 2 μL kreatinin probu ekleyerek reaksiyon karışımlarını hazırlayın. Boş lar için 44 μL kreatinin çıktırıcı tamponu, 2 μL kreatinase, 2 μL kreatinin enzim karışımı ve 1-2 μL kreatinin probu kullanın.
- 96 kuyulu plakadaki her kuyuya uygun reaksiyon karışımından 50 μL ekleyin ve 37 °C'de yatay bir çalkalayıcı üzerinde 60 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında plakayı ışıktan koruyun. Bir plaka okuyucu üzerinde 570 nm de absorbans ölçün.
- Tüm okumalardan boş değeri çıkararak kreatinin konsantrasyonlarını hesaplayın. Sonuç birim nanomoles / mikrolitre olacaktır. Molekülnanogram/mikrolitreyi almak için kreatinin in moleküler ağırlığıyla (113,12 ng/nmol) kreatinin konsantrasyonu çarpın.
6. Veri analizi
- FitC-polisökroz 70 idrar konsantrasyonu standart eğriden hesaplayın.
- Fitc-polisökroz 70 idrar konsantrasyonlarını temsili idrar örneğindeki kreatinin konsantrasyonlarına başvurun.
- Referans idrar 60 dk örnekleri idrar 0 dk kontrolleri ve tedavi fareler örnekleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil2'de de belirtildiği gibi, farelerde glomerüler geçirgenliği test etme yöntemi üç aşamada oluşturulmuştur. İlk evre, üriner kateter ve santral venöz kateterin yerleştirildiği hazırlık evresi olarak adlandırılır. İkinci faz, FITC-polissucrose 70'in intravenöz bolus enjeksiyonu ile başlayıp 60 dk boyunca FITC-polissucrose 70'in sürekli infüzyonu ile başlayan denge fazı olarak adlandırılır. Son aşamaya deneysel faz denir. Bu aşamada, FITC-polisökroz 70 infüzyonu devam eder ve ilaçlar veya diğer maddeler glomerüler geçirgenliği etkilemek için test edilebilir. İdrar her fazın sonunda toplanır.
Bu tracer modeli nde glomerüler geçirgenliği araştırmak için, bir idrar kateteri düzgün ve mukoza zarar vermeden yerleştirmek esastır. İdrar kateterinin kadın fare mesanesine yerleştirilmesi Şekil1'de gösterilmiştir. Kateter, kraniyoaudal üretral eksene paralel olarak üretral ostiuma 3 mm yerleştirilir (Şekil 1A). Kateter farenin kuyruğuna doğru 180° döndürülür (Şekil1B) ve mesaneye 7 mm daha fazla sokulur, minör omurgaya paralel olarak (Şekil 1C,D).
Yukarıda açıklandığı gibi, farelerde glomerüler geçirgenliği test etmek için önceki yöntemler idrar örnekleri5,6FITC-polissucrose 70 sinyalleri arındırmak için HPLC kullanılır. Bu yöntemde daha önce arınma yapılmadan floresan ölçümü yapılan farz, PBS, fare idrarı ve fare idrarında FITC-polissucrose 70 analiz edildi. Şekil 3A, PBS'nin floresan tayini 325 nm'de floresan pik ile gösterir, bu da 290 nm'de uyarma flaşının bir etkisi gibi görüner. Yerli fare idrarFloresan tarası 395 nm (Şekil3B)bir floresan maksimum gösterir. FARE idrarında çözünmüş 70 FITC-polisökrozu, 525 nm'de maksimum floresan görüntüler (Şekil 3C,D). Şekil 3C, fare idrarının fare idrarında FITC-polissucrose 70 floresan ölçümünü rahatsız etmediğini göstermektedir. FITC-polisökroz 70 konsantrasyonlarının artması floresan yoğunluğunu gösterir(Şekil 3E).
Bu yöntemin glomerüler geçirgenlik farklılıklarını tespit edebildiğini kanıtlamak için modelin deneysel aşamasında Ang II uygulanmıştır. Ang II, kan basıncı ile ilgili olmayan dozlarda sürekli bir uygulamadan sonra farelerde glomerüler geçirgenliği 60 dk artırmıştır (Şekil4A,B). Ang II'ye bağlı glomerüler geçirgenlik artışı Ang II-reseptör blokecisi (ARB), yani kandesartan (Şekil4A)tarafından bloke edilebilir. Ang II yıkama glomerüler geçirgenliği azaldı (Şekil 4A). Kuyruk-manşet yöntemi ile kan basıncı ölçüldü ve gruplar arasında anlamlı fark lar yoktu (Şekil4B). Polisoz 70 ve FITC-polisökroz 70-infüzyon hayvanlar FITC-polissucrose 70- ve Ang II-tedavi hayvanlar için kontrol olarak hizmet vermektedir (Şekil4C).
Şekil 1: Dişi farelerde idrar kateterinin yerleştirilmesi. Fare nin karın ın yanal görünümü. (A) İşaretli ve yağlanmış kateter, dişi bir farenin dış üretral ostiumuna 3 mm sokulur. Üretranın kraniyoaudal ekseni kateter ile paraleldir. Sol işaret parmağı ile alt karın üzerinde dikkatli gerginlik dış üretral ostium içine kateter giriş kolaylaştırır. (B) Kateter farenin kuyruğuna doğru 180° döndürülür. Kateterin ucu dış üretral ostium içinde 3 mm kalır. (C) Kateter artık mesaneiçine 7 mm daha fazla sokularak sokulsun. Kateterin yönü murine omurga ile hizalanır. (D) Fare nin karının ventral görünümü. Kateter farenin içine 10 mm yerleştirilir. (E) İdrar mesaneiçine doğru bir ekleme ile görünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir zaman çizelgesi üzerinde deneysel prosedürlerin şematik illüstrasyon. Farenin narkozundan sonra idrar kateteri yerleştirilir. Santral venöz kateter implante edilir ve temel idrar elde edilir (0 dk). Daha sonra, FITC-polissucrose 70 bolus merkezi venöz kateter ile uygulanır ve FITC-polisökroz 70 sürekli infüzyon ubaşlatılır. FITC-polissucrose 70 için denge fazı 60 dk. İdrar, denge fazı (0 dk) sonra ve deneysel faz başlamadan önce toplanır. Bu aşamada ilaçlar veya diğer maddeler (anjiyotensin II gibi) uygulanabilir. Deney evresinin sonunda analiz için idrar elde edilir (60 dk). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: FITC-polissucrose 70 ile ve olmadan PBS ve fare idrar Floresan. (A) Floresan frekans tayini (290 nm uyarma, 325-700 nm emisyon) PBS 325 nm bir sinyal gösterir, hangi 290 nm uyarma flaş bir etkisi gibi görünüyor. (B) Fare yerli idrar frekanstanında (idrar havuzu 1:10 ve 1:20 seyreltilmiş), muhtemelen idrar proteini otofloresans nedeniyle 395 nm maksimum bir sinyal vardır. (C) FITC-polysucrose 70 (40 μg/mL) içeren fare idrarı, 525 nm'de idrar otofloresansının ölçümüne engel olmayan bir sinyal tepe noktasını gösterir. (D) Emisyon dalga boyuna bağlı olarak FITC-polysucrose 70 floresan tepe büyütme. Farklı FITC-polissucrose 70 (1.25, 2.5, 5, 10, 20 ve 40 μg/mL) konsantrasyonları görüntülenir. (E) Artan FITC-polisökroz 70 konsantrasyonları 525 nm emisyonfloresan yoğunluğunda bir artış göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Anjiyotensin II (Ang II) glomerüler geçirgenliği artırır. (A) Ang II, farelerin idrarında FITC-polysucrose 70 tespiti ile ölçülen farelerde glomerüler geçirgenliği önemli ölçüde artırır (ortalama + SEM; n = 5; p < 0.004, Kruskal-Wallis testi ile test edilmiştir). Fitc-polisökroz 70 idrarda konsantrasyonları idrar kreatinin konsantrasyonları için başvuruldu. Beyaz sütunlar (0 dk) Ang II stimülasyon başlamadan önce FITC-polysucrose 70 seviyeleri temsil, siyah sütunlar (60 dk) Ang II stimülasyon başladıktan sonra FITC-polysucrose 70 seviyeleri 60 dk temsil eder ve gri sütunlar (120 dk veya +60 dk) sonra bir ek 60 dakika Ang II stimülasyon veya Ang II yıkama 60 dakika. (B) Sistolik kan basıncı kuyruk-manşet yöntemi (ortalama + SEM) ile izlendi. Kontrol ve Ang II tedavi edilen gruplar arasında anlamlı bir kan basıncı farkı belirtildi. (C) Polisoz 70 ve FITC-polysucrose 70 farelerde glomerüler geçirgenliği önemli ölçüde değiştirmez. Ang II farelerde glomerüler geçirgenliği önemli ölçüde artırır (ortalama + SEM; n = 7, p < 0.005). Bu rakam Konigshausen ve ark.8'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Dişi farelerde idrar kateterinin yerleştirilmesinin şematik diyagramı. Fare nin karın ın yanal görünümü. (A) İşaretli ve yağlanmış kateter, dişi bir farenin dış üretral ostiumuna 3 mm sokulur. Üretranın kraniyoaudal ekseni kateter ile paraleldir. Sol işaret parmağı ile alt karın üzerinde dikkatli gerginlik dış üretral ostium içine kateter giriş kolaylaştırır. (B) Kateter farenin kuyruğuna doğru 180° döndürülür. Kateterin ucu dış üretral ostium içinde 3 mm kalır. (C) Kateter artık mesaneiçine 7 mm daha fazla sokularak sokulsun. Kateterin yönü murine omurga ile hizalanır. (D) Fare nin karının ventral görünümü. Kateter bir dişi farenin dış üretral ostiumuna 3 mm sokularak sokular. (E) Kateter 180°döndükten sonra fare mesanesine 7 mm daha fazla sokularak getirilir. Kateterin yönü murine omurga ile hizalanır. Bu rakam Reis ve ark.7'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan yöntem, araştırmacının farelerde glomerüler geçirgenliği çok hassas bir şekilde bir izleyici kullanarak test etmesini sağlar. Bu yöntemle glomerüler geçirgenlikte kısa süreli artışlar sadece az miktarda idrar kullanılarak teşhis edilebilir. Bu tekniği başarılı bir şekilde ustalaşmak için en kritik adımlar 1) fare cerrahisinde manuel uzmanlık geliştirmek, özellikle merkezi bir damarın kanülasyonunda, 2) idrar kateterini mukozaya zarar vermeden yerleştirmek ve 3) elle işleme de manuel uzmanlık Küçük hacimli numunelerle 384 kuyulu plaka.
Merkezi venöz kateteri yerleştirirken kateterin juguler vene nüfuz etmemeleri esastır. Penetrasyonu önlemek için, bir distal ligature ile juguler ven üzerinde gerginlik koyarak öneririz (adım 2.2.7 bakınız) ve juguler ven lümen uzatmak için ince cımbız ile juguler ven kaldırmak için. Ekleme bölgesini küçük tutmak için kateteri takarak brüt hareketlerden kaçınmaya çalışın ve ekstra dokuyu çıkararak her zaman cerrahi alanın en iyi görünümünü sağlayın. İdrar kateterinin yerleştirilmesinde en kritik adım mesaneye son yerleştirilmesidir. Direnç hissedilirse, mukozada yanlış izler ve yaralanmalara neden olmamak için baştan başlamanızı öneririz. Kateter rotasyonu, yağlama ve nazik hareketlerin yanı sıra eğitim, zordurumlarda7 yardımcı olur.
FITC-polysucrose 70 floresan etiketli, dallı ve sakaroz ve epiklorohydrin 9 çaprazbağlı polimer. Küresel şekilli ve düşük şekilli asimetrisi olan ancak moleküler deformeedilebilirlik9 ile küresel bir molekül olarak çözelti halinde direniriz. Diğer sakaroz molekülleri gibi, FITC-polysucrose 70 glomerulus tarafından süzülür veboru sisteminde reabsorbe edilmez 4. İnfüzyonda fitc moleküllerinin serbest olmasını önlemek için, farelere uygulanmadan önce FITC-polysucrose 70 çözeltisini diyalize sokacağız. Diyalizfit FITC-polissucrose 70 moleküllerini -20 °C'de aylarca saklamak mümkündür. FITC-polysucrose 70 bu ve diğer protokollerde intravenöz olarak uygulandığından, idrar örneklerini kirleten kanın olmaması esastır. Bu nedenle idrar kateteri dikkatli bir şekilde yerleştirilmeli ve deneyde antikoagülan maddelerden kaçınılmalıdır. FITC-polysucrose 70 için standart eğri fare idrar havuzunda en doğru sonuçları elde etmek için çözülür. Farklı deneysel zaman noktalarında ve gruplar arasında idrardaki konsantrasyon farklılıkları nedeniyle, FITC-polissucrose 70 konsantrasyonu idrar konsantrasyonu yansıtan idrarda bir belirteç referans olması gerekir (örneğin, kreatinin). Enzimatik bir testte kreatinin ölçümü ile FITC-polissucrose 70 floresan girişim olası değildir.
FITC-polysucrose 70 floresan analizi siyah 384-iyi plakalar içinde yapılmalıdır ve bu plakalarda 5°L'lik küçük idrar hacimleri ölçülebilir. Floresan hala ölçülebilir olduğu için, tabakları yıkadıktan sonra bile 384 kuyulu plakalar içinde aynı kuyuları yeniden kullanmanızı önermiyoruz. Kabarcıklar floresan okumaile müdahale gibi, plakalar analiz önce santrifüj edilmelidir. Alternatif olarak, kabarcıklar bir pipet ucu ile el ile yok edilebilir.
Glomerüler permselectivity test etmek için polisukros kullanımı yaklaşık 40 yıl önce10tanımlanmıştır. Floresan etiketli polisucoz glomerüler yaralanma çalışmalarında neredeyse sadece son yıllarda sıçanlarda araştırılmıştır4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Bu farelerde daha kolay cerrahi işlemler nedeniyle anatomik nedenler olabilir farelerde daha. Sıçanlarda idrar örnekleri elde etmek için üretrotomi4,5,9,12,13,14,21kullanılır. Plazma ve idrar örneklerini analiz etmek için problar yüksek performanslı boyutlu dışlama kromatografisi4,5,9,12,13,14 ,21. Buna ek olarak, glomerüler filtrasyon hızı (GFR) radyoaktif 51Cr-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA)4,5,9,12,13 ile ölçülür ,14,21. İki önceki çalışmalarda FITC-polysucrose uygulanmıştır 70 farelerde5,6. Farelerde, bir suprapubik idrar kateteri mesane içine tanıtıldı6,20. FitC-polissucrose 70 floresan analizi nden önce üriner ve plazma probları jel filtrasyonuna tabi tutulur. Sıçanlarda olduğu gibi, GFR radyoaktivite6,20ile analiz edildi. Farelerde FITC-polysucrose 70 uygulaması ile ilgili ikinci yayın periton geçirgenliği bir model kullanır ve bu nedenle, FITC-polysucrose 70 floresan22için fare idrar analiz etmedi . Bu nedenle sunulan yöntem idrar örneklemesi ve analizini kolaylaştırmak için modifiye edilmiştir. İdrar örnekleri noninvaziv bir transüretral üriner kateter ile kolayca elde edilebilir. FITC-polysucrose 70 floresan için idrar analizi daha önce yüksek performanslı boyutlu dışlama kromatografisi veya jel filtrasyon olmadan yapılır. FITC-polissucrose 70 floresan fare idrar kreatininine atıfta bulunarak, radyoaktif bir tahlili ile GFR ölçümü gerekli değildir.
Kan basıncındaki artışlar glomerüler geçirgenliği artırır. Bu nedenle glomerüler geçirgenliği araştırırken kan basıncı takibi esastır. Farelerde en doğru kan basıncı ölçümleri pıhtılaşmayı önlemek için kateterheparinizasyonu gerektiren merkezi arteriyel kateter23 ile yapılır. Düşük doz heparinizasyon ve üriner kateter yerleştirilmesi sonrası hematüri ile ilgili sorunlar yaşadık. Bu nedenle, noninvaziv ve heparinizasyon gerekmez kan basıncını ölçmek için kuyruk-manşet tekniği yapmaya karar verdi. Anestezinin derinliğine bağlı olarak, kuyruk-manşet yöntemi ile kan basıncı takibi bazen zordur. Kan basıncı zarlarının önceden kontrol edilmesi ve kan basıncı kaydından önce farenin pozisyonunun optimize edilmesi gerekir.
Kan basıncı ölçümündeki zorluklara ek olarak, bu teknik fitc-polisökroz 70'in keyfi birimleri üretilerek de sınırlıdır. Şimdiye kadar, bu teknik sadece hayvanlarda araştırılmış ve bu nedenle, insan glomerüler filtre ile alaka hala bilinmemektedir. Glomerüler geçirgenlik artışlarını araştırmak için zaman aralıkları fare idrar üretimine bağlıdır. Bu nedenle fare idrar üretiminin yetersizliği nedeniyle glomerüler geçirgenlikte (dakikalar içinde) çok kısa süreli artışlar gözden kaçabilir. Bu protokolde FITC-polisökroz 70, esas olarak glomerüler filtrasyon yoluyla kandan çıkarılan idrar kreatininine normalleşir, aynı zamanda proksimal tübüler sekresyon ile de. Bu yöntemle glomerüler geçirgenlik tahmin ederken bir hata ortaya çıkaracaktır, polysucrose ölçülen fraksiyonel açıklık azaltarak24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Christina Schwandt, Blanka Duvnjak ve Nicola Kuhr onların olağanüstü teknik yardım ve Dr Dennis Sohn floresan tarama ile yaptığı yardım için teşekkür ederiz. Bu araştırma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18'in L.C.R. ve L.S. için verdiği bir hibe ile desteklenmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
