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Medicine

Mesure très sensible de la perméabilité glomerulaire chez les souris avec fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59064
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour tester la perméabilité glomerulaire chez les souris à l'aide d'un traceur hautement sensible et non radioactif. Cette méthode permet des analyses d'urine répétitives avec de petits volumes d'urine.

Abstract

La perte d'albumine dans l'urine (albuminurie) prédit les résultats cardiovasculaires. Dans des conditions physiologiques, de petites quantités d'albumine sont filtrées par le glomerulus et réabsorbées dans le système tubulaire jusqu'à ce que la limite d'absorption soit atteinte. Les premières augmentations de la filtration pathologique de l'albumine peuvent, par conséquent, être manquées en analysant l'albuminurie. Par conséquent, l'utilisation de traceurs pour tester la permsélectivité glomerulaire semble avantageuse. L'isothiocyanate de fluorescéine étiqueté fluorescent (FITC)-polysucrose (c.-à-d., FITC-Ficoll), peut être employé pour étudier la permselectivité glomerulaire. Les molécules de FITC-polysucrose sont librement filtrées par le glomerulus mais ne sont pas réabsorbées dans le système tubulaire. Chez la souris et le rat, fitC-polysucrose a été étudié dans des modèles de perméabilité glomerulaire en utilisant des procédures techniquement complexes (c.-à-d., mesures radioactives, chromatographie liquide haute performance [HPLC], filtration de gel). Nous avons modifié et facilité un protocole basé sur le traceur FITC-polysucrose pour tester les augmentations précoces et petites de la perméabilité glomerulaire à FITC-polysucrose 70 (taille de l'albumine) chez les souris. Cette méthode permet des analyses d'urine répétitives avec de petits volumes d'urine (5 L). Ce protocole contient des informations sur la façon dont le traceur FITC-polysucrose 70 est appliqué par voie intraveineuse et l'urine est recueillie par l'intermédiaire d'un cathéter urinaire simple. L'urine est analysée par un lecteur de plaque de fluorescence et normalisée à un marqueur de concentration d'urine (créatinine), évitant ainsi des procédures techniquement complexes.

Introduction

Les défauts fonctionnels ou structurels dans la barrière de filtration glomerulaire augmentent la perméabilité glomerulaire à l'albumine, ayant pour résultat la détection de l'albumine dans l'urine (albuminuria). L'albuminurie prédit les résultats cardio-vasculaireset est un marqueur important pour des dommages glomerular 1. Même de faibles niveaux d'albuminurie, se trouvant dans la plage normale, sont associés à un risque cardio-vasculaire accru1.

Dans des conditions physiologiques, l'albumine est filtrée à travers le glomerulus et est presque entièrement réabsorbée dans le système tubulaire2,3. Chez la souris, la détection de l'albumine dans l'urine est habituellement effectuée par un essai immunosorbent lié à l'enzyme d'albumine (ELISA) à partir de 24 h de collecte d'urine. Si l'urine d'une collecte d'urine de 24 h ou de l'urine spot est utilisée, de petites différences dans les concentrations d'albumine peuvent être manquées en raison de problèmes de sensibilité à l'analyse. La plupart des chercheurs, par conséquent, utilisent des modèles animaux dans lesquels l'albuminurie est induite par des dommages rénaux robustes dus aux toxines, aux drogues, et à la chirurgie rénale.

Par conséquent, la découverte d'une méthode sensible pour détecter les changements petits et transitoires dans la perméabilité glomerulaire est très importante pour le domaine. Rippe et coll. ont présenté un modèle de rat pour tester la perméabilité glomerulaire en appliquant un traceur étiqueté fluorescent, à savoir FITC-polysucrose 70 (c.-à-d., FITC-Ficoll 70), à la taille de l'albumine4. L'application de traceur permet de tester les changements à court terme de la perméabilité glomerulaire (en quelques minutes) et est très sensible4. Deux études ont utilisé la méthode traceur chez les souris5,6. Malgré ses avantages, cette méthode présente malheureusement des inconvénients : elle est techniquement très complexe, radioactive et invasive. Une analyse plus approfondie de l'urine n'est effectuée qu'en utilisant la filtration de gel ou la taille-exclusion HPLC5,6.

Dans cet article, nous présentons une méthode alternative, sensible, non radioactive, et rapide pour mesurer la perméabilité glomerular chez les souris utilisant fluorescently étiqueté FITC-polysucrose 70. En introduisant un cathéter transurétral, la collecte d'urine est moins invasive que la perforation de la vessie, l'urérotomie et l'épétére suprapubienne, et permet la collecte d'urine au moins toutes les 30 min. L'analyse d'urine est effectuée à partir de petites quantités (5 l) à l'aide d'un lecteur de plaques fluorescentes. Les concentrations de traceurs dans l'urine sont normalisées aux concentrations de créatinine dans l'urine à l'aide d'un test de créatinine enzymatique.

Par conséquent, cette nouvelle méthode offre un outil sensible pour étudier les dommages glomerulaires tôt avec la perméabilité glomerular accrue.

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Protocol

Les enquêtes ont été menées conformément aux lignes directrices décrites dans le Guide for Care and Use of Laboratory Animals (US National Institutes of Health Publication No. 85-23, révisé en 1996). Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux approbations institutionnelles pertinentes (gouvernement de l'État Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] numéro de référence 84-02.04.2012.A397).

1. Préparation d'instruments, de solutions et d'équipements

  1. Reconstituer FITC-polysucrose 70 avec 0,9% de chlorure de sodium stérile (NaCl) à une concentration finale de 10 mg/mL (c.-à-d., 100 mg dans 10 ml de NaCl).
  2. Dialyze FITC-polysucrose 70 solution pour enlever les molécules libres fitC pendant la nuit à 4 oC (coupure de poids moléculaire [MWCO] à 10 000). Utilisez 1 L de 0,9% de NaCl stérile par 10 ml de FITC-polysucrose 70 en mouvement constant. Protégez-vous de la lumière. Aliquot le FITC-polysucrose dialysé 70 et le stocker à -20 oC.
  3. Pour le FITC-polysucrose 70 bolus, ajouter 4 'L de 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 solution à 996 'L de 0,9% NaCl (la concentration finale de FITC-polysucrose 70: 40 'g/mL).
  4. Pour la solution d'infusion d'équilibre, ajouter 20 oL d'une solution de 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 à 9,98 ml de NaCl stérile de 0,9 % donnant à une concentration finale de 20 g/mL.
  5. Pour la solution expérimentale, ajouter des médicaments ou des substances à la solution d'infusion (p. ex., pour l'angiotensine II [Ang II] [100 ng/kg/min] pour une souris de 25 g, ajouter 3 oL d'Ang II d'une solution de 1 mM).
  6. Pour l'opération, préparez un rasage, deux pinces chirurgicales, une paire de ciseaux chirurgicaux, deux pinces à épiler, deux pincettes fines, une paire de ciseaux fins et des écouvillons. Préparer deux fils de soie de 10 cm (4-0 à 6-0) pour les procédures de ligature.
  7. Pour le placement d'un cathéter veineux central, préparer une seringue de 10 ml avec une aiguille de 21 G. Placez la pointe de l'aiguille dans un cathéter de 30 cm de long (avec un diamètre intérieur [ID] de 0,58 mm). Connectez le cathéter de 0,58 mm à un cathéter de 10 cm (avec un ID de 0,28 mm). Couper la pointe de la plus petite oblique cathéter pour créer une pointe pointue qui est introduit dans la veine jugulaire.
  8. Préparer l'anesthésie (c.-à-d. la kétamine d'anesthésie intrapéritone, 100 mg/kg de poids corporel, et la xylazine, 5 mg/kg de poids corporel).
  9. Préparer un angiocatheter de 22 G en jetant l'aiguille et en marquant le cathéter à 1 cm de la pointe. Préchauffer le coussin chauffant à 37 oC.
  10. Préparez un dispositif de tension artérielle et changez la membrane de mesure de la pression artérielle si nécessaire.

2. Phase de préparation

  1. Cathéter urinaire
    REMARQUE : La section 2.1 suit le protocole tel que décrit par Reis et coll.7. La figure 1 et la figure 1 supplémentaire montrent le placement d'un cathéter urinaire chez des souris femelles.
    1. Anesthésiez la souris à la kétamine/xylazine (voir l'étape 1.8). Utilisez le test de pincement des orteils pour confirmer une anesthésie appropriée. Pour maintenir l'anesthésie, répétez l'anesthésie (p. ex., avec la moitié de la dose) après 60 min. Une bonne anesthésie est confirmée si le test de pincement des orteils n'entraîne pas de retrait réflexe.
      REMARQUE : Des souris FVB femelles sont utilisées dans ce protocole.
    2. Placez la souris dans un recumbency dorsal sur un coussin chauffant de 37 oC. Resserrer le bas-ventre et trouver l'ostium urétral (p. ex., au microscope).
    3. Utilisez la partie plastique du cathéter d'un angiocathéter 22 G et lubrifiez-la avec du gel de xyloïne. Introduisez-le soigneusement 3 mm dans l'ostium urétral tout en parallèle à l'axe urétral distal (Figure 1A).
    4. Tourner le haut de l'angiocatheter à 180 degrés en gardant la pointe dans l'ostium urétral et en maintenant l'axe de l'urètre (Figure 1B).
    5. Introduire le cathéter 7 mm plus loin dans la souris afin qu'il soit placé dans la vessie (Figure 1C). Ne forcez pas le cathéter au-delà de la résistance. Corriger la position du cathéter dès le début si la résistance est ressentie. Notez que si la position du cathéter urinaire est correcte, l'urine peut déjà apparaître dans le cathéter.
    6. Placer un tube brun de 1,5 ml sur le dessus de l'angiocatheter pour recueillir l'urine. Appliquer 1 ml de 0,9 % De NaCl sous-cutanée pour améliorer la production d'urine.
  2. Cathéter veineux central
    1. Raser le cou de la souris et le placer en recumbency avec la tête vers le chirurgien. Hyperétendre la tête de la souris avec un ruban adhésif.
    2. Désinfecter le cou avec 70% d'isopropanol. Faire une petite incision cutanée (5 mm) sous la mâchoire, à l'aide d'une pince à épiler et d'une paire de ciseaux. Couper la peau d'environ 1 cm dans la direction du sternum jusqu'à ce que le milieu du sternum soit atteint.
    3. Disséquer soigneusement la peau sur le côté droit du cou, à l'aide d'une paire de ciseaux. Faire une incision rectangulaire de la peau sur le côté droit de la souris pour exposer les tissus mous du cou. Utilisez une paire de ciseaux et une pince à épiler. Fixer les rabats de la peau avec deux pinces.
      REMARQUE : La veine jugulaire court le long du côté gauche de la glande thyroïde ou est légèrement couverte par le lobe droit de la glande thyroïde. Après cette étape, utilisez un microscope pour la chirurgie.
    4. Exposer soigneusement la veine jugulaire par une préparation émoussée, à l'aide de la pointe de la pince fine. Éviter les blessures aux branches veineuses.
      REMARQUE : Il pourrait être nécessaire d'enlever le tissu avec des ciseaux fins. Soyez prudent lorsque vous utilisez des ciseaux pour enlever les tissus, car il augmente le risque de saignement.
    5. Placer et fermer une ligature avec un fil de soie (4-0 à 6-0) à la partie distale de la veine jugulaire visible (vers la tête de la souris). Mettre la tension sur la ligature en fixant le fil de soie avec un ruban adhésif pour assurer une légère tension sur la veine jugulaire. Préparer une ligature autour de la partie proximale de la veine jugulaire.
    6. Remplissez le cathéter avec la solution d'infusion d'équilibre (voir l'étape 1.4) et fixez le cathéter avec un ruban adhésif de sorte que le cathéter aligne la veine jugulaire. Contrôle des bulles pour éviter l'embolie de l'air.
    7. Soulevez la veine jugulaire avec de fines pinces à épiler sur le site de l'insertion (le site d'insertion est de 1 à 2 mm proximal de la ligature). Aligner le tube parallèle à la veine jugulaire. Perforez la veine jugulaire, en visant le lumen, et insérez pour environ 2-4 mm, en parallèle de l'axe de la veine jugulaire. Évitez tout mouvement rapide.
    8. Fermez la ligature pour fixer le cathéter. Contrôle de l'étanchéité de la ligature en regardant attentivement à travers le microscope. Placez un écouvillon humide sur le site de la chirurgie.
  3. Mesure de la pression artérielle
    1. Placez le brassard de queue au bas de la queue de la souris pendant que la souris est couchée dans la charge dorsal. Démarrez les mesures et répétez-les 10fois par point de temps. Construire une moyenne à partir des mesures.
    2. Ajustez la position de la coiffe arrière si les mesures de la tension artérielle ne semblent pas correctes et si de fausses données sont produites.

3. Phase d'équilibre

  1. Changer le tube de collecte urinaire avant le début de la phase d'équilibre et le placer sur la glace.
  2. Introduire une seringue de 10 ml remplie de solution de phase d'équilibre FITC (voir l'étape 1.4) avec une aiguille de 21 G et le cathéter plus grand (avec un ID de 0,58 mm) et la placer dans la pompe à seringues.
  3. Pliez un écouvillon et placez-le autour du cathéter à petit navire (avec un ID de 0,28 mm) qui est introduit dans la veine jugulaire. Pose le cathéter à l'intérieur de l'écouvillon. Placez une pince sur l'écouvillon pour abolir le flux sanguin rétrograde ou l'embolie de l'air. Connectez une aiguille de 27 G avec une seringue de 1 ml remplie du bolus FITC à l'extrémité du cathéter à petit navire.
  4. Ouvrez la pince et appliquez le bolus FITC (100 l). Refermez la pince à nouveau et connectez le cathéter plus grand avec le cathéter plus petit. Démarrer la pompe à seringues avec 0,008 ml/min (0,480 ml/h). Poursuivre l'infusion pendant 60 min.

4. Phase expérimentale

REMARQUE : Dans cette phase, l'effet des drogues sur la permselectivité glomerulaire peut être étudié.

  1. Changer le tube urinaire (point de temps 0 min) à un autre tube brun de 1,5 ml. Placez un écouvillon autour du cathéter de petit navire et fermez une pince comme indiqué à l'étape 3.3.
  2. Déconnectez le grand cathéter du cathéter à petit navire. Changer les seringues pour les solutions de phase expérimentale (voir l'étape 1.5). Laissez la pompe d'infusion fonctionner de sorte que le grand cathéter soit rempli de la solution d'équilibre.
  3. Reconnectez les cathéters tout en évitant l'embolie de l'air et rouvrez la pince. Démarrer la pompe à seringues à 0,008 ml/min.
  4. Continuer à faire fonctionner la pompe à seringues pendant 60 min et recueillir l'urine dans le tube urinaire par la suite (urine 60 min). Placer le tube d'urine sur la glace.
  5. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale pendant l'anesthésie. Avant l'élimination, la souris est observée pendant 5 minutes pour s'assurer qu'elle est morte.

5. Analyse d'urine

  1. Mesure de fluorescence
    1. Décongelez la piscine urinaire et diluez-la 1:10 avec de la saline tamponnée par le phosphate (PBS).
      REMARQUE : La piscine urinaire est un pool d'urine qui a été rassemblé des souris saines dans une collection d'urine de 12-24 h dans une cage métabolique.
    2. Préparer des normes pour la mesure de la fluorescence. Prenez 10 tubes bruns de 1,5 ml et étiquetez-les pour les blancs (1:10 piscine d'urine diluée) et les concentrations de 70 FITC-polysucrose suivantes (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 et 160 g/mL).
    3. Pipet 246 'L de piscine d'urine diluée dans un tube brun de 1,5 mL et ajouter 4 'L de la concentration de stock FITC-polysucrose 70 (voir l'étape 1.1) pour obtenir une concentration finale de 160 'g/mL FITC-polysucrose 70. Pipet 100 L de la piscine d'urine diluée dans tous les autres tubes.
    4. Diluer 1:2 en piécortant 100 oL du tube 70 de 160 g/mL FITC-polysucrose dans le tube de 80 g/mL et continuez avec les autres concentrations. Assurer un bon mélange des concentrations diluées (p. ex., en faisant du vortex le tube avant de continuer).
    5. Diluer les échantillons d'urine de souris (0 min, 60 min) 1:10 avec une piscine urinaire diluée.
    6. Pipette 5 ll de chaque norme FITC-polysucrose 70 concentration et des échantillons d'urine de souris comme triplitaux dans une plaque noire de 384 puits. Centrifuger la plaque à 1000 x g pour 15 s pour éviter les bulles.
    7. Analyser la plaque de 384 puits dans un lecteur de plaque. Effectuer l'excitation à 496 nm et mesurer la fluorescence à 525 nm.
  2. Mesure de créatinine
    1. Suivez les instructions du fabricant. En bref, préparer des normes de créatinine en diluant 10 'L de la solution standard de 100 mM de créatinine avec 990 'L de tampon d'assay de créatinine pour préparer une solution standard de 1 mM.
    2. Ajouter 0, 2, 4, 6, 8 et 10 l de la solution standard de 1 mM de créatinine dans une plaque de 96 puits pour générer 0, 2, 4, 6, 8 et 10 normes nmol/puits, respectivement. Ajouter un tampon d'assay à la créatinine à chaque puits pour porter le volume à 50 l.
    3. Préparer les mélanges de réaction en ajoutant 42 à 44 l de tampon d'essai de créatinine, 2 l de créatinase, 2 l de créatininase, 2 l de mélange d'enzymes créatinines, et 2 l de sonde de créatinine. Pour le blanc, utilisez 44 l de tampon d'essai de créatinine, 2 l de créatinase, 2 l de mélange d'enzymes de créatinine, et 1/2 l de sonde de créatinine.
    4. Ajouter 50 oL du mélange de réaction approprié à chaque puits dans la plaque de 96 puits et l'incuber pendant 60 min sur un shaker horizontal à 37 oC. Protéger la plaque de la lumière pendant l'incubation. Mesurer l'absorption à 570 nm sur un lecteur de plaque.
    5. Calculez les concentrations de créatininine en soustrayant la valeur vierge de toutes les lectures. Le résultat aura l'unité nanomoles/microlitre. Multipliez la concentration de créatinine par le poids moléculaire de la créatinine (113,12 ng/nmol) pour recevoir l'unité nanogrammes/microlitre.

6. Analyse des données

  1. Calculez la concentration d'urine FITC-polysucrose 70 de la courbe standard.
  2. Référence à la FITC-polysucrose 70 concentrations d'urine aux concentrations de créatinine dans l'échantillon d'urine représentatif.
  3. Référencez les échantillons d'urine de 60 min à l'urine 0 min échantillons de témoins et de souris traitées.

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Representative Results

Comme le montre la figure 2, la méthode pour tester la perméabilité glomerulaire chez la souris est constituée en trois phases. La première phase est appelée phase de préparation, dans laquelle un cathéter urinaire et un cathéter veineux central sont placés. La deuxième phase est appelée phase d'équilibre, en commençant par une injection intraveineuse de bolus de FITC-polysucrose 70 et suivie de l'infusion continue de FITC-polysucrose 70 pendant 60 min. La dernière phase est appelée phase expérimentale. Dans cette phase, l'infusion de FITC-polysucrose 70 est poursuivie et des médicaments ou d'autres substances peuvent être testés pour influencer la perméabilité glomerulaire. L'urine est recueillie à la fin de chaque phase.

Pour étudier la perméabilité glomerulaire dans ce modèle de traceur, il est essentiel de placer un cathéter urinaire correctement et sans blesser la muqueuse. Le placement d'un cathéter urinaire dans une vessie de souris femelle est démontré dans la figure 1. Le cathéter est placé 3 mm dans l'ostium urétral, parallèle à l'axe urétral craniocaudal (Figure 1A). Le cathéter est tourné à 180 degrés vers la queue de la souris (Figure 1B) et introduit 7 mm plus loin dans la vessie, parallèlement à la colonne vertébrale murine (Figure 1C,D).

Comme décrit ci-dessus, les méthodes précédentes pour tester la perméabilité glomerulaire chez les souris ont utilisé HPLC pour purifier FITC-polysucrose 70 signaux provenant d'échantillons d'urine5,6. Comme cette méthode utilise la mesure de fluorescence sans une purification précédente du traceur, PBS, urine de souris, et FITC-polysucrose 70 dans l'urine de souris ont été analysés. La figure 3A montre l'analyse de fluorescence du PBS avec un pic de fluorescence à 325 nm, ce qui semble être un effet du flash d'excitation à 290 nm. Le balayage de fluorescence de l'urine indigène de souris montre un maximum de fluorescence à 395 nm (figure 3B). FITC-polysucrose 70 dissous dans l'urine de souris affiche un maximum de fluorescence à 525 nm (Figure 3C, D). La figure 3C montre que l'urine de souris ne perturbe pas la mesure de fluorescence du FITC-polysucrose 70 dans l'urine de souris. Les concentrations croissantes de FITC-polysucrose 70 montrent une intensité de fluorescence accrue (figure 3E).

Pour prouver que cette méthode est capable de détecter les différences dans la perméabilité glomerulaire, Ang II a été appliqué dans la phase expérimentale du modèle. Ang II a augmenté la perméabilité glomerulaire chez les souris 60 min après une administration continue dans les doses non liées à la pression sanguine (figure4A, B). L'augmentation de la perméabilité glomerulaire due à Ang II pourrait être bloquée par un bloqueur de récepteurs Ang II (ARB), à savoir le candesartan (figure 4A). Ang II lavage diminué perméabilité glomerulaire (Figure 4A). La pression artérielle a été mesurée par la méthode de la coiffe de la queue et n'a pas montré de différences significatives entre les groupes (figure 4B). Polysucrose 70- et FITC-polysucrose 70-infused animals serve as controls for FITC-polysucrose 70- and Ang II-treated animals (Figure 4C).

Figure 1
Figure 1 : Placement d'un cathéter urinaire chez des souris femelles. Vue latérale de l'abdomen de souris. (A) Le cathéter marqué et lubrifié est introduit 3 mm dans l'ostium urétral externe d'une souris femelle. L'axe craniocaudal de l'urètre est parallèle au cathéter. La tension soigneuse sur l'abdomen inférieur avec l'index gauche facilite l'introduction du cathéter dans l'ostium urétral externe. (B) Le cathéter est tourné à 180 degrés vers la queue de la souris. L'extrémité du cathéter reste de 3 mm dans l'ostium urétral externe. (C) Le cathéter est maintenant introduit 7 mm plus loin dans la vessie. La direction du cathéter est alignée avec la colonne vertébrale murine. (D) Vue ventrale de l'abdomen de la souris. Le cathéter est placé 10 mm dans la souris. (E) L'urine apparaît avec une insertion correcte dans la vessie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Illustration schématique des procédures expérimentales sur une chronologie. Après la narcose de la souris, un cathéter urinaire est placé. Le cathéter veineux central est implanté et l'urine de base est obtenue (0 min). Par la suite, le bolus 70 de FITC-polysucrose est appliqué par l'intermédiaire du cathéter veineux central et une infusion continue de FITC-polysucrose 70 est commencée. La phase d'équilibre pour LE FITC-polysucrose 70 dure 60 min. L'urine est recueillie après la phase d'équilibre (0 min) et avant le début de la phase expérimentale. Dans cette phase, des médicaments ou d'autres substances (comme l'angiotensine II) peuvent être appliqués. À la fin de la phase expérimentale, l'urine est obtenue pour analyse (60 min). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Fluorescence de l'urine de PBS et de souris avec et sans FITC-polysucrose 70. (A) Le balayage de fréquence de fluorescence (excitation de 290 nm, émission de 325-700 nm) de PBS montre un signal à 325 nm, qui semble être un effet du flash d'excitation à 290 nm. (B) Dans le balayage de fréquence de l'urine indigène de souris (piscine d'urine diluée à 1:10 et 1:20), il y a un signal avec un maximum à 395 nm, probablement provoqué par l'autofluorescence urinaire de protéine. (C) L'urine de souris contenant du FITC-polysucrose 70 (40 g/mL) montre un pic de signal à 525 nm qui n'interfère pas avec la mesure de l'autofluorescence urinaire. (D) Grossissement du pic de fluorescence FITC-polysucrose 70 selon la longueur d'onde des émissions. Différentes concentrations de FITC-polysucrose 70 (1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 g/mL) sont affichées. (E) L'augmentation des concentrations de FITC-polysucrose 70 montre une augmentation de l'intensité de fluorescence à l'émission de 525 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : L'angiotensine II (Ang II) augmente la perméabilité glomerulaire. (A) Ang II augmente considérablement la perméabilité glomerulaire chez la souris, mesurée par la détection FITC-polysucrose 70 dans l'urine des souris (moyenne - SEM; n 5; p lt; 0,004, testé par le test Kruskal-Wallis). FITC-polysucrose 70 concentrations dans l'urine ont été référencées aux concentrations de créatinine d'urine. Les colonnes blanches (0 min) représentent les niveaux FITC-polysucrose 70 avant le début de la stimulation ang II, les colonnes noires (60 min) représentent FITC-polysucrose 70 niveaux 60 min après le début de la stimulation Ang II, et les colonnes grises (120 min ou 60 min) après un 60 min supplémentaires de stimulation Ang II ou 60 min de lavage Ang II. (B) La tension artérielle systolique a été surveillée par la méthode de la coiffe de la queue (moyenne et SEM). Aucune différence significative de tension artérielle entre les groupes témoins et Ang II-traités n'a été notée. (C) Polysucrose 70 et FITC-polysucrose 70 ne modifient pas la perméabilité glomerulaire chez la souris de manière significative. Ang II augmente la perméabilité glomerulaire chez les souris de manière significative (moyenne - SEM; n 7, p 'lt; 0.005). Ce chiffre a été modifié à partirde Konigshausen et al.8 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 1
Figure supplémentaire 1 : diagramme schématique du placement d'un cathéter urinaire chez les souris femelles. Vue latérale de l'abdomen de souris. (A) Le cathéter marqué et lubrifié est introduit 3 mm dans l'ostium urétral externe d'une souris femelle. L'axe craniocaudal de l'urètre est parallèle au cathéter. La tension soigneuse sur l'abdomen inférieur avec l'index gauche facilite l'introduction du cathéter dans l'ostium urétral externe. (B) Le cathéter est tourné à 180 degrés vers la queue de la souris. L'extrémité du cathéter reste de 3 mm dans l'ostium urétral externe. (C) Le cathéter est maintenant introduit 7 mm plus loin dans la vessie. La direction du cathéter est alignée avec la colonne vertébrale murine. (D) Vue ventrale de l'abdomen de la souris. Le cathéter est introduit 3 mm dans l'ostium urétral externe d'une souris femelle. (E) Après que le cathéter est tourné 180 degrés, il est introduit 7 mm plus loin dans la vessie de la souris. La direction du cathéter est alignée avec la colonne vertébrale murine. Ce chiffre a été modifié à partir de Reis et coll.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La méthode présentée permet à l'investigateur de tester la perméabilité glomerulaire chez la souris d'une manière très sensible à l'aide d'un traceur. Avec cette méthode, des augmentations à court terme de la perméabilité glomerulaire peuvent être diagnostiquées en utilisant seulement de petites quantités d'urine. Les étapes les plus critiques pour maîtriser avec succès cette technique sont 1) développer l'expertise manuelle dans la chirurgie de souris, particulièrement dans l'annulation d'une veine centrale, 2) placer le cathéter urinaire sans nuire à la muqueuse, et 3) l'expertise manuelle dans la manipulation 384-puits plaques avec de petits volumes d'échantillons.

Lors de la pose du cathéter veineux central, il est essentiel que le cathéter ne pénètre pas dans la veine jugulaire. Pour éviter la pénétration, nous recommandons de mettre la tension sur la veine jugulaire avec une ligature distale (voir l'étape 2.2.7) et de soulever la veine jugulaire avec des pincettes fines pour étendre le lumen de la veine jugulaire. Pour garder le site d'insertion petit, essayez d'éviter les mouvements bruts tout en insérant le cathéter et assurez toujours la meilleure vue du champ chirurgical en enlevant le tissu supplémentaire. L'étape la plus critique dans le placement du cathéter urinaire est l'insertion finale dans la vessie. Si la résistance se fait sentir, nous vous recommandons de recommencer à partir du début afin de ne pas causer de fausses traces et des blessures à la muqueuse. La rotation du cathéter, la lubrification et les mouvements doux, ainsi que la formation, aident dans les cas difficiles7.

FITC-polysucrose 70 est un polymère fluorescent étiqueté, ramifié et relié à l'intérieur du saccharose 9. Il se comporte en solution comme une molécule globulaire avec une forme sphérique et avec une asymétrie de forme faible, mais avec une déformation moléculaire9. Comme d'autres molécules de saccharose, FITC-polysucrose 70 est filtré par le glomerulus et non réabsorbé dans le système tubulaire4. Pour éviter les molécules FITC libres dans l'infusion, nous avons dialysé la solution FITC-polysucrose 70 avant l'application aux souris. Il est possible de stocker des molécules dialysées FITC-polysucrose 70 à -20 oC pendant des mois. Comme FITC-polysucrose 70 est appliqué par voie intraveineuse dans ce protocole et d'autres, il est essentiel qu'aucun sang ne contamine les échantillons d'urine. Par conséquent, le cathéter urinaire doit être placé avec prudence et les substances anticoagulantdans l'expérience devraient être évitées. La courbe standard pour FITC-polysucrose 70 est dissous dans le pool d'urine de souris pour obtenir les résultats les plus précis. En raison des différences de concentration dans l'urine à différents moments expérimentaux et entre les groupes, les concentrations de FITC-polysucrose 70 doivent être référencées à un marqueur dans l'urine qui reflète la concentration d'urine (p. ex., la créatinine). L'interférence de la fluorescence 70 de FITC-polysucrose avec la mesure de la créatinine dans un test enzymatique est peu probable.

L'analyse de la fluorescence FITC-polysucrose 70 doit être effectuée dans des plaques noires de 384 puits, car de petits volumes d'urine de 5 L peuvent être mesurés dans ces plaques. Nous ne recommandons pas de réutiliser les mêmes puits dans les plaques de 384 puits, même après le lavage des plaques, car la fluorescence est encore mesurable. Comme les bulles interfèrent avec la lecture de fluorescence, les plaques doivent être centrifugeées avant l'analyse. Alternativement, les bulles peuvent être détruites manuellement avec la pointe d'une pipette.

L'utilisation de polysucroses pour tester la permsélectivité glomerulaire a été décrite il y a près de 40 ans10. Fluorescently étiqueté polysucrose a été étudié dans des études de lésions glomerulaires presque exclusivement chez les rats dans les dernières années4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Cela peut avoir des raisons anatomiques en raison de procédures chirurgicales plus faciles chez les rats que chez les souris. Chez les rats, l'uréthrotomie est utilisée pour obtenir des échantillons d'urine4,5,9,12,13,14,21. Pour analyser les échantillons de plasma et d'urine, les sondes sont soumises à une chromatographie d'exclusion de taille de haute performance4,5,9,12,13,14 ,21. En outre, le taux de filtration glomerulaire (GFR) est mesuré par l'acide tétraacétique radioactif 51Cr-éthylènediamine (EDTA)4,5,9,12,13 ,14,21. Deux études antérieures ont appliqué FITC-polysucrose 70 chez les souris5,6. Chez la souris, un cathéter urinaire suprapubique est introduit dans la vessie6,20. Les sondes urinaires et plasmatiques sont soumises à la filtration de gel avant l'analyse de la fluorescence de FITC-polysucrose 70. Semblable que chez les rats, GFR a été analysé par radioactivité6,20. La deuxième publication concernant l'application de FITC-polysucrose 70 chez les souris utilise un modèle de perméabilité péritonéale et, par conséquent, n'a pas analysé l'urine de souris pour FITC-polysucrose 70 fluorescence22. La méthode présentée a donc été modifiée pour faciliter l'échantillonnage et l'analyse de l'urine. Les échantillons d'urine peuvent être facilement obtenus par un cathéter urinaire transurétral non invasif. L'analyse d'urine pour la fluorescence 70 de FITC-polysucrose est exécutée sans n'importe quelle chromatographie ou filtration d'exclusion de taille de haute-performance précédente. En faisant référence à la fluorescence 70 de FITC-polysucrose à la créatinine d'urine de souris, la mesure du GFR avec un test radioactif n'est pas nécessaire.

Les augmentations de la tension artérielle augmentent la perméabilité glomerulaire. Par conséquent, la surveillance de tension artérielle est essentielle tout en étudiant la perméabilité glomerulaire. Les mesures de tension artérielle les plus précises chez les souris sont effectuées par l'intermédiaire d'un cathéter artériel central23 nécessitant l'héparinisation du cathéter pour empêcher la coagulation. Nous avons éprouvé des problèmes avec l'hématurie après l'héparinisation de bas-dose et le placement urinaire de cathéter. Par conséquent, nous avons décidé d'effectuer la technique de manchette de queue pour mesurer la tension artérielle, qui est non invasive et n'a pas besoin d'héparinisation. Selon la profondeur de l'anesthésie, la surveillance de la pression artérielle avec la méthode de la queue-manchette est parfois difficile. Les membranes de pression artérielle doivent être vérifiées à l'avance et la position de la souris doit être optimisée avant l'enregistrement de la pression artérielle.

En plus des défis dans la mesure de tension artérielle, cette technique est également limitée en produisant des unités arbitraires de FITC-polysucrose 70. Jusqu'à présent, cette technique n'a été étudiée que chez les animaux et, par conséquent, sa pertinence pour le filtre glomerulaire humain est encore inconnue. Les intervalles de temps pour étudier les augmentations de la perméabilité glomerulaire dépendent de la production d'urine de souris. Par conséquent, des augmentations à très court terme de la perméabilité glomerulaire (en minutes) peuvent être manquées en raison du manque de production d'urine de souris. Dans ce protocole, FITC-polysucrose 70 est normalisé à la créatinine d'urine, qui est enlevée du sang principalement par filtration glomerulaire, mais également par sécrétion tubulaire proximale. Ceci introduirea une erreur en estimant la perméabilité glomerulaire utilisant cette méthode, réduisant le dégagement fractionnaire mesuré du polysucrose24.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Christina Schwandt, Blanka Duvnjak et Nicola Kuhr pour leur assistance technique exceptionnelle et le Dr Dennis Sohn pour son aide à l'analyse de la fluorescence. Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 à L.C.R. et L.S. Le bailleur de rôle n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for neck cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery 
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
BD Insyte Autoguard BD 381823  urinary catheter
Multimode Detector DTX 880 Beckman Coulter plate reader
384 well microtiterplate Nunc 262260 384 well platte
Creatinine Assay Kit Sigma-Aldrich MAK080 to measure creatinine concentration
96 well plate Nunc 260836 for creatinine assay 
FITC-labeled polysuccrose 70 TBD Consultancy FP70 FITC-ficoll
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525 used to test glomerular permeability
BP-98A Softron for blood pressure measurement
OTS 40.3040 Medite 01-4005-00 heating plate for mouse surgery
Instillagel 6mL Farco-Pharma GmbH for urinary catheter
Exacta Aesculap GT415 shaver

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References

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Médecine Numéro 150 Perméabilité Glomerulaire polysucrose traceur albuminurie cathéter urinaire de souris cathéter veineux central de souris diaphragme fendu glomerulus
Mesure très sensible de la perméabilité glomerulaire chez les souris avec fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70
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Königshausen, E., Potthoff, S.… More

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Woznowski, M., Stegbauer, J., Rump, L. C., Sellin, L. Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70. J. Vis. Exp. (150), e59064, doi:10.3791/59064 (2019).

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