Summary
Her presenterer vi en protokoll for å teste glomerulær permeabilitet i mus ved hjelp av en svært følsom, radioaktivt Tracer. Denne metoden tillater repeterende urin analyser med små urin volumer.
Abstract
Tapet av albumin i urinen (albuminuri) spår kardiovaskulære utfall. Under fysiologiske forhold filtreres små mengder albumin av glomerulus og reabsorberes i rørsystemet frem til absorpsjons grensen nås. Tidlig økning i patologisk albumin filtrering kan dermed bli savnet ved å analysere albuminuri. Derfor, bruk av Bevegelsesuskarphet å teste glomerulær permselectivity synes fordelaktig. Fluorescensmerkete merket Tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (dvs. FITC-Ficoll), kan brukes til å studere glomerulær permselectivity. FITC-polysucrose molekyler er fritt filtrert av glomerulus men ikke reabsorberes i rørformede systemet. I mus og rotter, FITC-polysucrose har blitt undersøkt i modeller av glomerulær permeabilitet ved hjelp av teknisk komplekse prosedyrer (dvs. radioaktive målinger, høy ytelse væske kromatografi [HPLC], gel filtrering). Vi har endret og tilrettelagt en FITC-polysucrose Tracer-basert protokoll for å teste tidlig og små økninger i glomerulær permeabilitet til FITC-polysucrose 70 (størrelsen av albumin) i mus. Denne metoden tillater repeterende urin analyser med små urin mengder (5 μL). Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan Tracer FITC-polysucrose 70 brukes intravenøst og urin er samlet inn via en enkel urin kateter. Urin analyseres via en fluorescens plate leser og normalisert til en urin konsentrasjon markør (kreatinin), og dermed unngår teknisk komplekse prosedyrer.
Introduction
Funksjonelle eller strukturelle defekter innenfor glomerulær filtrerings barriere øke glomerulær permeabilitet til albumin, noe som resulterer i påvisning av albumin i urinen (albuminuri). Albuminuri spår kardiovaskulære utfall og er en viktig markør for glomerulær Kader1. Selv lave nivåer av albuminuri, ligger innenfor normalområdet, er forbundet med økt kardiovaskulær risiko1.
Under fysiologiske forhold, er albumin filtrert gjennom glomerulus og er nesten helt reabsorberes i rørformede system2,3. I mus, påvisning av albumin i urinen er vanligvis utført av en albumin enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (ELISA) fra 24 h av urin samling. Hvis urin fra en 24 h urin samling eller flekk urin brukes, små forskjeller i albumin konsentrasjoner kan bli savnet på grunn av analysen følsomhet problemer. De fleste forskere derfor bruke dyremodeller der albuminuri er indusert av robust nyreskader på grunn av giftstoffer, narkotika, og nyre kirurgi.
Derfor er funn av en følsom metode for å oppdage små og forbigående endringer i glomerulær permeabilitet svært viktig for feltet. Rippe et al. har presentert en rotte modell for å teste glomerulær permeabilitet ved å bruke en fluorescensmerkete merket Tracer, nemlig FITC-polysucrose 70 (dvs. FITC-Ficoll 70), på størrelse med albumin4. Den Tracer programmet tillater testing av kortsiktige endringer i glomerulær permeabilitet (i løpet av minutter) og er svært følsom4. To studier har brukt Tracer metoden i mus5,6. Til tross for sine fordeler, denne metoden, dessverre, har ulemper: det er teknisk svært kompleks, radioaktiv, og invasiv. Ytterligere analyse av urinen oppnås bare ved bruk av gel-filtrering eller størrelsesekskludering HPLC.
Innenfor dette papiret, presenterer vi en alternativ, følsom, radioaktivt, og rask metode for å måle glomerulær permeabilitet i mus ved hjelp av fluorescensmerkete merket FITC-polysucrose 70. Ved å innføre et Transurethral kateter, urin samling er mindre invasiv enn blære punktering, urethrotomy, og suprapubisk kateter søknad, og tillater urin samling minst hver 30 min. urin analyse utføres fra små mengder (5μL) ved hjelp av en fluorescerende plate leser. Tracer konsentrasjoner i urinen er normalisert til kreatinin konsentrasjoner i urinen ved hjelp av en enzymatisk kreatinin analysen.
Derfor, denne romanen metoden tilbyr et følsomt verktøy for å studere tidlig glomerulær skade med økt glomerulær permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøkelsene ble utført i henhold til retningslinjene som er skissert i veiledningen for Stell og bruk av Laboratoriedyr (US National Institutes of Health publikasjon nr. 85-23, revidert 1996). Alle dyre eksperimenter ble utført i samsvar med relevante institusjonelle godkjenninger (State Government Landesamt für natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] referansenummer 84-02.04.2012. A397).
1. utarbeidelse av instrumenter, løsninger og utstyr
- Rekonstituer FITC-polysucrose 70 med 0,9% steril natriumklorid (NaCl) til en endelig konsentrasjon på 10 mg/mL (dvs. 100 mg i 10 mL NaCl).
- Dialyze FITC-polysucrose 70 løsning for å fjerne gratis FITC molekyler over natten ved 4 ° c (molekylær vekt cut-off [MWCO] ved 10 000). Bruk 1 L av 0,9% steril NaCl per 10 mL FITC-polysucrose 70 under konstant omrøring. Beskytt mot lys. Alikvot den dialyzed FITC-polysucrose 70 og oppbevar den ved-20 ° c.
- For FITC-polysucrose 70-bolus legger du til 4 μL av 10 mg/mL FITC-polysucrose 70-oppløsning på 996 μL av 0,9% NaCl (den endelige konsentrasjonen av FITC-polysucrose 70:40 μg/mL).
- For likevekts infusjonsvæske, tilsett 20 μL av en 10 mg/mL FITC-polysucrose 70-oppløsning på 9,98 mL på 0,9% steril NaCl som gir en endelig konsentrasjon på 20 μg/mL.
- For den eksperimentelle løsningen, tilsett medikamenter eller stoffer til infusjonsvæsken (f. eks, for angiotensin II [Ang II] [100 ng/kg/min] for en 25 g mus, tilsett 3 μL av ang II av en 1 mM løsning).
- For kirurgi, forberede en barbermaskin, to kirurgiske klemmer, ett par kirurgiske saks, to pinsett, to fine pinsett, ett par fine saks, og pinner. Forbered 2 10 cm silke tråder (4-0 til 6-0) for ligation prosedyrer.
- For plassering av et sentralt venekateter, utarbeide en 10 mL sprøyte med en 21 G nål. Plasser tuppen av nålen i et 30 cm langt kateter (med en indre diameter [ID] på 0,58 mm). Koble 0,58 mm kateteret til et 10 cm kateter (med en ID på 0,28 mm). Skjær spissen av de mindre kateter skrå å skape en skarp spiss som er innført i halsen venen.
- Klargjør anestesi (dvs. intraperitoneal anestesi Ketamin, 100 mg/kg kroppsvekt, og xylazine, 5 mg/kg kroppsvekt).
- Forbered en 22 G angiocatheter ved å kaste nålen og markere kateteret 1 cm fra spissen. Varm opp varmeputen til 37 ° c.
- Forbered en blodtrykks anordning og endre blodtrykksmåling membranen om nødvendig.
2. forberedelsesfasen
- Urin kateter
Merk: avsnitt 2,1 følger protokollen som beskrevet av Reis et al.7. Figur 1 og supplerende figur 1 viser plasseringen av et urin kateter hos kvinnelige mus.- Bedøve musen med ketamin/xylazine (se trinn 1,8). Bruk toe-klype test for å bekrefte riktig anestesi. For å opprettholde anestesi, gjentar anestesi (f. eks, med halvparten av dosen) etter 60 min. riktig anestesi er bekreftet hvis toe knipe test ikke resulterer i refleks uttak.
Merk: kvinnelige FVB mus brukes i denne protokollen. - Plasser musen i rygg recumbency på en varmepute med 37 ° c. Stram den nedre abdomen og Finn urinrøret ostium (f. eks, under et mikroskop).
- Bruk plastdelen av kateteret på en 22 G angiocatheter og smør den med Xylocaine gel. Sett den forsiktig 3 mm inn i urinrør ostium mens den parallelt den den
- Drei toppen av angiocatheter 180 ° ved å holde spissen innenfor urinrøret ostium og opprettholde aksen i urinrøret (figur 1B).
- Introduser kateteret 7 mm lenger inn i musen slik at den er plassert i blæren (figur 1C). Ikke Tving kateteret utover motstanden. Korriger posisjonen til kateteret fra begynnelsen hvis motstanden er filt. Ta oppmerksom på at hvis plasseringen av urin kateteret er riktig, kan urin allerede vises i kateteret.
- Plasser en 1,5 mL brunt rør over toppen av angiocatheter for å samle urinen. Påfør 1 mL 0,9% NaCl subkutant for å forbedre urinproduksjonen.
- Bedøve musen med ketamin/xylazine (se trinn 1,8). Bruk toe-klype test for å bekrefte riktig anestesi. For å opprettholde anestesi, gjentar anestesi (f. eks, med halvparten av dosen) etter 60 min. riktig anestesi er bekreftet hvis toe knipe test ikke resulterer i refleks uttak.
- Sentralt venekateter
- Barbere nakken av musen og legg den i recumbency med hodet mot kirurgen. Hyperextend hodet av musen med en tape.
- Desinfisere nakken med 70% isopropanol. Lag en liten hud snitt (5 mm) under kjeven, ved hjelp av en TWEEZER og et par saks. Skjær huden ca 1 cm i retning av brystbenet til midten av brystbenet er nådd.
- Forsiktig analysere huden på høyre side av nakken, ved hjelp av et par saks. Lag et rektangulært snitt av huden til høyre side av musen for å avdekke bløtvevet i nakken. Bruk en saks og en TWEEZER. Fest hud klaffene med to klemmer.
Merk: hals venen går langs venstre side av skjoldbruskkjertelen eller er litt dekket av høyre flik av skjoldbruskkjertelen. Etter dette trinnet, bruk et mikroskop for kirurgi. - Forsiktig utsette hals vene ved stump forberedelse, ved hjelp av spissen av den fine TWEEZER. Unngå skade på vene grener.
Merk: det kan være nødvendig å fjerne vev med fin saks. Vær forsiktig når du bruker saks for å fjerne vev som det øker risikoen for blødning. - Plasser og lukk en ligatur med en silketråd (4-0 til 6-0) på den delen av det synlige hals åren (mot hodet av musen). Sett spenning på ligatur ved å feste silke tråden med en tape for å sikre liten spenning på hals venen. Forbered en ligatur rundt den proksimale delen av hals venen.
- Fyll kateteret med likevekts infusjonsoppløsning (se trinn 1,4) og fest kateteret med en tape slik at kateteret er samkjøre halsen vene. Kontroll for bobler for å unngå luft emboli.
- Løft hals vene med fin pinsett på stedet av innsetting (innsetting området er 1-2 mm proksimale av ligatur). Juster slangen parallelt med hals venen. Punktering av hals vene, satsing for lumen, og sett inn for ca 2-4 mm, parallelt aksen av hals vene. Unngå raske bevegelser.
- Lukk ligatur for å feste kateteret. Kontroll for tetthet av ligatur ved å se nøye gjennom mikroskopet. Sett en fuktig serviett over operasjonsstedet.
- Blodtrykksmåling
- Plasser halen-mansjetten på bunnen av musen halen mens musen ligger i rygg recumbency. Start målingene og gjenta dem 10x per gang punkt. Bygg en mening fra målingene.
- Juster posisjonen til halen-mansjetten hvis blodtrykksmålinger ikke ser ut til å være korrekte og falske data produseres.
3. likevekts fase
- Endre urin samling røret før likevekts fasen starter og legg den på is.
- Introduser en 10 mL sprøyte fylt med FITC likevekts fase løsning (se trinn 1,4) med en 21 G nål og det større kateteret (med en ID på 0,58 mm) og plasser den i sprøyte pumpen.
- Brett en serviett og legg den rundt den lille-fartøyet kateter (med en ID på 0,28 mm) som er innført i halsen vene. Legg kateteret inne i pinnen. Plasser en klemme over pinnen for å avskaffe retrograd blodstrøm eller luft emboli. Koble til en 27 G nål med en 1 mL sprøyte fylt med FITC bolus til enden av et lite fartøy kateter.
- Åpne klemmen og påfør FITC bolus (100 μL). Lukk klemmen igjen, og koble til det store kateteret med det mindre kateteret. Start sprøyte pumpen med 0,008 mL/min (0,480 mL/h). Fortsett infusjonen i 60 min.
4. eksperimentell fase
Merk: i denne fasen kan effekten av legemidler på glomerulær permselectivity undersøkes.
- Endre urinrøret (tid punkt 0 min) til en annen 1,5 mL brunt rør. Sett en serviett rundt det lille-fartøyet kateteret og lukk en klemme som indikert i trinn 3,3.
- Koble det store kateteret fra det lille kateteret. Endre sprøyter til de eksperimentelle fase løsningene (se trinn 1,5). La infusjons pumpen kjøre slik at det store kateteret er fylt med den likevekts løsningen.
- Koble til katetre på nytt, samtidig som du unngår luft emboli og åpner klemmen igjen. Start sprøyte pumpen ved 0,008 mL/min.
- Fortsett å kjøre sprøyten pumpen for 60 min og samle urin i urinrøret etterpå (urin 60 min). Plasser urinrøret på isen.
- Ofre musen ved cervical forvridning under anestesi. Før avhending er musen observert i 5 minutter for å sikre at den er død.
5. urin analyse
-
Fluorescens måling
- Tine urin bassenget og fortynne det 1:10 med fosfat-bufret saltvann (PBS).
Merk: urin bassenget er en pool av urin som har blitt samlet inn fra sunne mus i en 12-24 h urin samling i en metabolsk bur. - Klargjør standarder for fluorescens måling. Ta 10 brune 1,5 mL rør og merk dem for blank (1:10 utvannet urin basseng) og følgende FITC-polysucrose 70-konsentrasjoner (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 og 160 μg/mL).
- Pipet 246 μL av fortynnet urinmengde i et 1,5 mL brunt rør og tilsett 4 μL av FITC-polysucrose 70 lager konsentrasjon (se trinn 1,1) for å få en endelig konsentrasjon av 160 μg/mL FITC-polysucrose 70. Pipet 100 μL av det fortynnede urin bassenget i alle andre rør.
- Fortynne 1:2 ved pipettering 100 μL av 160 μg/mL FITC-polysucrose 70 rør inn i 80 μg/mL-slangen og fortsett med de andre konsentrasjonene. Sikre riktig blanding av de fortynnede konsentrasjonene (f.eks. ved å virvlingen røret før det fortsettes).
- Fortynne musen urinprøvene (0 min, 60 min) 1:10 med utvannet urin bassenget.
- Pipetter 5 μL av hver standard FITC-polysucrose 70 konsentrasjon og av musen urinprøver som triplicates i en svart 384-brønn plate. Sentrifuger platen ved 1 000 x g for 15 s for å unngå bobler.
- Analyser 384-brønn platen i en plate leser. Utfør eksitasjon ved 496 NM og måle fluorescens ved 525 NM.
- Tine urin bassenget og fortynne det 1:10 med fosfat-bufret saltvann (PBS).
-
Kreatinin måling
- Følg produsentens instruksjoner. I korte trekk klargjør du kreatinin Standards ved å fortynne 10 μL av 100 mM kreatinin standard oppløsning med 990 μL av kreatinin analysen buffer for å forberede en 1 mM standard løsning.
- Tilsett 0, 2, 4, 6, 8 og 10 μL av 1 mM kreatinin standard løsning i en 96-brønn plate for å generere 0, 2, 4, 6, 8 og 10 nmol/brønn standarder, henholdsvis. Legg kreatinin analysen buffer til hver brønn for å bringe volumet til 50 μL.
- Klargjør reaksjonsblandingen ved å tilsette 42 – 44 μL av kreatinin analysebuffer, 2 μL av creatinase, 2 μL av creatininase, 2 μL av kreatinin enzym blanding og 2 μL av kreatinin probe. For blank, bruk 44 μL av kreatinin analysen buffer, 2 μL av creatinase, 2 μL av kreatinin enzym mix, og 1 – 2 μL av kreatinin probe.
- Tilsett 50 μL av den egnede reaksjonsblandingen i hver brønn i 96-brønn platen og ruge den i 60 min på en horisontal shaker ved 37 ° c. Beskytt platen mot lys under inkubasjons. Mål absorbansen ved 570 NM på en plate leser.
- Beregn kreatinin konsentrasjonene ved å trekke den tomme verdien fra alle målingene. Resultatet vil ha enheten nanomoles/mikroliter. Multipliser konsentrasjonen av kreatinin ved Molekylvekten av kreatinin (113,12 ng/nmol) for å motta enheten nanograms/mikroliter.
6. data analyse
- Beregn FITC-polysucrose 70 urin konsentrasjon fra standardkurven.
- Referer til FITC-polysucrose 70 urin konsentrasjoner til kreatinin konsentrasjoner i den representative urinprøven.
- Referanse urinen 60 min prøver å urin 0 min prøver av kontroller og behandlede mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som avbildet i figur 2, er metoden for å teste glomerulær permeabilitet i mus bygget opp i tre faser. Den første fasen kalles forberedelsesfasen, der et urin kateter og et sentralt venekateter er plassert. Den andre fasen kalles likevekts fasen, og starter med en intravenøs bolus injeksjon av FITC-polysucrose 70 og etterfulgt av kontinuerlig infusjon av FITC-polysucrose 70 for 60 min. Den siste fasen kalles den eksperimentelle fasen. I denne fasen, infusjon av FITC-polysucrose 70 fortsetter og narkotika eller andre stoffer kan testes for å påvirke glomerulær permeabilitet. Urin samles på slutten av hver fase.
For å undersøke glomerulær permeabilitet i denne Tracer modellen, er det viktig å plassere et urin kateter riktig og uten å skade slimhinnen. Plasseringen av et urin kateter i en kvinnelig mus blære er demonstrert i figur 1. Kateteret plasseres 3 mm inn i urinrøret ostium, parallelt med den craniocaudal urinrør aksen (figur 1a). Kateteret er skrudd 180 ° mot halen av musen (figur 1B) og innført 7 mm lenger inn i blæren, parallelt med murine ryggraden (figur 1C, D).
Som beskrevet ovenfor, tidligere metoder for å teste glomerulær permeabilitet i mus brukte HPLC å rense FITC-polysucrose 70 signaler fra urinprøver5,6. Ettersom denne metoden bruker fluorescens måling uten en tidligere rensing av Tracer, PBS, mus urin, og FITC-polysucrose 70 i mus urin ble analysert. Figur 3a viser fluorescens skanning av PBS med en fluorescens peak på 325 NM, som synes å være en effekt av eksitasjon blitsen på 290 NM. Det fluorescens avsøke av innfødt musen urin viser en fluorescens maksimum for 395 NM (skikkelsen 3b). FITC-polysucrose 70 oppløst i mus urin viser en fluorescens maksimum ved 525 NM (figur 3c, D). Figur 3c viser at mus urin ikke forstyrrer fluorescens måling av FITC-polysucrose 70 i mus urin. Økende konsentrasjoner av FITC-polysucrose 70 viser en økt fluorescens intensitet (figur 3e).
For å bevise at denne metoden er i stand til å oppdage forskjeller i glomerulær permeabilitet, ble Ang II brukt i den eksperimentelle fasen av modellen. Ang II økte glomerulær permeabilitet i mus 60 min etter en kontinuerlig administrering i nonblood-relevante doser (figur 4a, B). Økningen i glomerulær permeabilitet på grunn av ang II kunne blokkeres av en ang II-reseptor blocker (ARB), nemlig candesartan (figur 4a). Ang II bleke redusert glomerulær permeabilitet (figur 4a). Blodtrykket ble målt via hale-cuff metoden og viste ikke vesentlige forskjeller mellom gruppene (figur 4b). Polysucrose 70-og FITC-Polysucrose 70-tilført dyr fungerer som kontroller for FITC-Polysucrose 70-og Ang II-behandlede dyr (figur 4c).
Figur 1: plassering av et urin kateter hos kvinnelige mus. Lateral visning av musen magen. (A) det markerte og smurte kateteret innføres 3 mm inn i den eksterne urinrør ostium til en kvinnelig mus. Den craniocaudal aksen av urinrøret er parallelle med kateteret. Forsiktig spenning på nedre del av magen med venstre pekefinger forenkler innføringen av kateteret inn i den eksterne urinrøret ostium. (B) kateteret er skrudd 180 ° mot halen av musen. Spissen av kateteret forblir 3 mm innenfor den eksterne urinrøret ostium. (C) kateteret er nå innført 7 mm lenger inn i blæren. Retningen av kateteret er på linje med murine ryggraden. (D) ventrale syn på musen magen. Kateteret plasseres 10 mm inn i musen. (E) urinen vises med riktig innsetting i blæren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk illustrasjon av de eksperimentelle prosedyrene på en tidslinje. Etter narkose av musen, er et urin kateter plassert. Det sentrale vene kateteret er implantert og Baseline urin er innhentet (0 min). Etterpå brukes FITC-polysucrose 70 bolus via det sentrale vene kateteret, og en kontinuerlig infusjon av FITC-polysucrose 70 startes. Likevekts fasen for FITC-polysucrose 70 varer 60 min. urin samles etter likevekts fasen (0 min) og før den eksperimentelle fasen starter. I denne fasen kan narkotika eller andre stoffer (som angiotensin II) anvendes. På slutten av den eksperimentelle fasen, urin er innhentet for analyse (60 min). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: fluorescens av PBS og mus urin med og uten FITC-polysucrose 70. (A) fluorescens Frekvensskanning (eksitasjon av 290 NM, utslipp av 325-700 NM) av PBS viser et signal på 325 NM, som synes å være en effekt av eksitasjon blitsen på 290 NM. (B) i Frekvensskanning av mus innfødte urin (urin basseng fortynnet på 1:10 og 1:20), det er et signal med et maksimum på 395 NM, sannsynligvis forårsaket av urin protein autofluorescence. (C) mus urin som inneholder FITC-polysucrose 70 (40 μg/ml) viser et signal peak på 525 NM som ikke forstyrrer måling av urin autofluorescence. (D) forstørrelse av FITC-polysucrose 70 fluorescens peak, avhengig av bølgelengden på utslippet. Ulike konsentrasjoner av FITC-polysucrose 70 (1,25, 2,5, 5, 10, 20 og 40 μg/mL) vises. (E) økende FITC-polysucrose 70 konsentrasjoner viser en økning på fluorescens intensitet ved utslipp av 525 NM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: ANGIOTENSIN II (Ang II) øker glomerulær permeabilitet. (A) Ang II øker betydelig glomerulær permeabilitet i mus, målt ved FITC-polysucrose 70 deteksjon i musene urin (gjennomsnitt + SEM; n = 5; p < 0,004, testet av Kruskal-Wallis-test). FITC-polysucrose 70 konsentrasjoner i urinen ble referert til kreatinin konsentrasjoner i urinen. Den hvite kolonner (0 min) representerer FITC-polysucrose 70 nivåer før starten av ang II stimulering, svarte søyler (60 min) representerer FITC-polysucrose 70 nivåer 60 min etter starten av ang II stimulering, og de grå kolonnene (120 min eller + 60 min) etter en ytterligere 60 min av ang II stimulering eller 60 min av ang II bleke. (B) systolisk blodtrykk ble overvåket av hale-cuff metoden (gjennomsnitt + SEM). Ingen signifikant blodtrykk forskjeller mellom kontroll og Ang II-behandlede grupper ble notert. (C) Polysucrose 70 og FITC-Polysucrose 70 ikke endre glomerulær permeabilitet hos mus betraktelig. Ang II øker glomerulær permeabilitet i mus betydelig (gjennomsnitt + SEM; n = 7, p < 0,005). Dette tallet har blitt modifisert fra Konigshausen et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: skjematisk diagram av plasseringen av et urin kateter hos kvinnelige mus. Lateral visning av musen magen. (A) det markerte og smurte kateteret innføres 3 mm inn i den eksterne urinrør ostium til en kvinnelig mus. Den craniocaudal aksen av urinrøret er parallelle med kateteret. Forsiktig spenning på nedre del av magen med venstre pekefinger forenkler innføringen av kateteret inn i den eksterne urinrøret ostium. (B) kateteret er skrudd 180 ° mot halen av musen. Spissen av kateteret forblir 3 mm innenfor den eksterne urinrøret ostium. (C) kateteret er nå innført 7 mm lenger inn i blæren. Retningen av kateteret er på linje med murine ryggraden. (D) ventrale syn på musen magen. Kateteret innføres 3 mm i den eksterne urinrøret ostium av en kvinnelig mus. (E) etter at kateteret er slått 180 °, er det innført 7 mm lenger inn i muse blæren. Retningen av kateteret er på linje med murine ryggraden. Dette tallet er endret fra Reis et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte metoden gjør det mulig for etterforsker å teste glomerulær permeabilitet i mus på en svært følsom måte ved hjelp av en Tracer. Med denne metoden, kortsiktige økninger i glomerulær permeabilitet kan diagnostiseres ved hjelp av bare små mengder urin. De mest kritiske trinnene for vellykket mestring denne teknikken er 1) utvikle manuell ekspertise i musen kirurgi, spesielt i kanyleringen av en sentral vene, 2) plassere urin kateter uten å skade slimhinnen, og 3) manuell ekspertise i håndtering 384-brønn plater med små mengder prøver.
Når du plasserer det sentrale venekateter, er det viktig at kateteret ikke trenge inn i hals vene. For å unngå penetrasjon, anbefaler vi å sette spenning på hals venen med en ligatur (se trinn 2.2.7) og for å løfte hals vene med fin pinsett for å forlenge hulrommene i hals venen. For å holde innsetting området små, prøv å unngå grov bevegelser mens du setter inn kateteret og alltid sikre best mulig visning av operasjonsfeltet ved å fjerne ekstra vev. Det mest kritiske trinnet i plasseringen av urin kateteret er den endelige innsetting i blæren. Hvis motstanden er filt, anbefaler vi å starte på nytt fra begynnelsen for ikke å forårsake falske spor og skade på slimhinnen. Kateter rotasjon, smøring og milde bevegelser, samt opplæring, hjelp i vanskelige tilfeller7.
FITC-polysucrose 70 er en fluorescensmerkete merket, utvidet, og tverrbundet polymer av sukrose og epichlorohydrin9. Den oppfører seg i løsning som et globular molekyl med en sfærisk form og med en lav form asymmetri, men med en molekylær fleksibilitet9. Som andre sukrose molekyler, FITC-polysucrose 70 er filtrert av glomerulus og ikke reabsorberes i rørformede systemet4. For å unngå frie FITC-molekyler i infusjonen, dialyzed vi FITC-polysucrose 70-løsningen før påføring av musene. Det er mulig å lagre dialyzed FITC-polysucrose 70 molekyler ved-20 ° c i månedsvis. Som FITC-polysucrose 70 brukes intravenøst i denne og andre protokoller, er det viktig at ingen blod forurenser urinprøvene. Derfor må urin kateteret plasseres med forsiktighet og antikoagulerende stoffer i eksperimentet bør unngås. Standarden kurve for FITC-polysucrose 70 er oppløst i mus urin bassenget for å få mest mulig nøyaktige resultater. På grunn av konsentrasjons forskjeller i urinen på ulike eksperimentelle tids punkter og mellom grupper, FITC-polysucrose 70 konsentrasjoner må refereres til en markør i urinen som reflekterer urin konsentrasjon (f. eks, kreatinin). Interferens med FITC-polysucrose 70-fluorescens med måling av kreatinin i en enzymatisk analyse er usannsynlig.
Analysen av FITC-polysucrose 70-fluorescens bør utføres i sorte 384-brønn plater, da små urin volumer på 5 μL kan måles i disse platene. Vi anbefaler ikke å gjenbruke de samme brønnene i 384-brønn platene, selv etter å ha vasket platene, da fluorescens fortsatt er målbare. Som bobler forstyrre fluorescens lesing, bør platene være sentrifugert før analyse. Alternativt kan bobler ødelegges manuelt med tuppen av en pipette.
Bruken av polysucroses for å teste glomerulær permselectivity ble beskrevet nesten 40 år siden10. Fluorescensmerkete merket polysucrose har blitt undersøkt i glomerulær skade studier nesten utelukkende hos rotter i de siste årene4,11, 12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Dette kan ha anatomiske årsaker som følge av enklere kirurgiske prosedyrer hos rotter enn hos mus. Hos rotter brukes urethrotomy tilå få urinprøver4,5,9,12,13,14,21. For å analysere plasma-og urinprøver utsettes sonder for utelukkelse av høy ytelse kromatografi4,5,9,12,13,14 ,21. I tillegg måles glomerulær filtreringshastighet (GFR) av radioaktivt 51CR-etylendiamin Tetraacetic acid (EDTA)4,5,9,12,13 ,14,21. To tidligere studier har søkt FITC-polysucrose 70 i mus5,6. I mus, en suprapubisk urin kateter innføres i blæren6,20. Urin-og plasma sonder utsettes for gel-filtrering før analysen av FITC-polysucrose 70-fluorescens. Lignende som hos rotter ble GFR analysert via radioaktivitet6,20. Den andre publikasjonen om anvendelsen av FITC-polysucrose 70 i mus bruker en modell av bukhulen permeabilitet og derfor ikke analysere mus urin for FITC-polysucrose 70 fluorescens22. Den presenterte metoden ble derfor modifisert for å lette urin prøvetaking og analyse. Urinprøver kan lett fås gjennom et ikke-invasiv Transurethral urin kateter. Urin analyse for FITC-polysucrose 70 fluorescens er utført uten noen tidligere høy ytelse størrelse eksklusjon kromatografi eller gel filtrering. Ved henvisning FITC-polysucrose 70 fluorescens til mus urin kreatinin, måling av GFR med en radioaktiv analysen er ikke nødvendig.
Økninger i blodtrykket forbedre glomerulær permeabilitet. Derfor blodtrykk overvåking er viktig mens gransker glomerulær permeabilitet. De mest nøyaktige blodtrykks målingene hos mus utføres via et sentralt arteriell kateter23 som trenger heparinization av kateteret for å forhindre blodpropp. Vi har opplevd problemer med hematuri etter lav dose heparinization og urin kateter plassering. Derfor bestemte vi oss for å utføre halen-cuff teknikk for å måle blodtrykket, som er ikke-invasiv og trenger ikke heparinization. Avhengig av dybden av anestesi, blodtrykk overvåking med halen-cuff metoden er noen ganger utfordrende. Blodtrykk membraner må sjekkes på forhånd og plasseringen av musen bør optimaliseres før blodtrykks opptak.
I tillegg til utfordringer i blodtrykksmåling er denne teknikken også begrenset ved å produsere vilkårlige enheter av FITC-polysucrose 70. Så langt har denne teknikken bare blitt undersøkt hos dyr, og derfor er dens relevans til den menneskelige glomerulær filteret fortsatt ukjent. Tidsintervaller for å undersøke økninger i glomerulær permeabilitet avhenge mus urin produksjon. Derfor, svært kortsiktige økninger i glomerulær permeabilitet (i minutter) kan bli savnet på grunn av mangel på mus urin produksjon. I denne protokollen, FITC-polysucrose 70 er normalisert til urin kreatinin, som er fjernet fra blodet hovedsakelig via glomerulær filtrering, men også av proksimale rørformede sekresjon. Dette vil innføre en feil ved estimering glomerulær permeabilitet bruker denne metoden, redusere den målte brøk clearance av polysucrose24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, og Nicola Kuhr for deres eksepsjonelle tekniske assistanse og Dr. Dennis Sohn for hans hjelp med fluorescens Scan. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 til L.C.R. og L.S. Funder hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
