CRISPR-Cas er en kraftfuld teknologi til ingeniør komplekse genomer af planter og dyr. Vi detalje her, en protokol til effektivt redigere det menneskelige genom ved hjælp af forskellige Cas endonucleases. Vi fremhæve vigtige overvejelser og design parametre til at optimere redigering effektivitet.
Klyngesystem regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) funktioner naturligt i bakteriel adaptive immunitet, men har været succesfuldt repurposed for genom engineering i mange forskellige levende organismer. Mest almindeligt, vildtype CRISPR forbundet 9 (Cas9) eller Cas12a liv1975 bruges til at kløve specifikke steder i genomet, hvorefter DNA dobbelt-strenget pause er repareret via ikke-homologe slutningen at deltage (NHEJ) vej eller homologi-instrueret reparation ( HDR) pathway afhængigt af om en donor skabelon er fraværende eller præsentere henholdsvis. Til dato, har CRISPR systemer fra forskellige bakteriearter vist sig at være i stand til at udføre genom-redigering i pattedyrsceller. Men trods den tilsyneladende enkelhed af teknologien, flere konstruktionsparametre skal betragtes, som ofte lader brugere forvirret om, hvordan du bedst til at udføre deres genom-redigering eksperimenter. Her beskriver vi en komplet workflow fra eksperimentelle design for identifikation af celle kloner, der bærer ønskede DNA ændringer, med mål at fremme vellykket gennemførelse af genom-redigering eksperimenter i pattedyr cellelinjer. Vi fremhæve vigtige overvejelser for brugerne at tage til efterretning, herunder valg af CRISPR system, spacer længde og udformningen af en enkelt-strenget oligodeoxynucleotide (ssODN) donor skabelon. Vi forestiller os, at denne arbejdsproces vil være nyttig for gen knockout undersøgelser, sygdom modellering indsats, eller generation af reporter cellelinjer.
Evnen til at ingeniør genomet af alle levende organisme har mange biomedicinske og bioteknologiske applikationer, såsom korrektion af sygdom-forårsager mutationer, opførelsen af præcise cellulære modeller for sygdom undersøgelser eller generation af landbruget afgrøder med ønskværdige egenskaber. Siden århundredeskiftet, forskellige teknologier er udviklet til genom engineering i pattedyrceller, herunder meganucleases1,2,3, zink finger nukleaser4,5, eller transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs)6,7,8,9. Men disse tidligere teknologier er enten svært at programmet eller kedelig at samle, dermed hæmmer deres udbredt vedtagelse i forskningen og industrien.
I de seneste år, de klynger interspaced regelmæssigt korte palindromiske gentagelser (CRISPR) – CRISPR-forbundet (Cas) system er opstået som en kraftfulde nye genom engineering technology10,11. Oprindeligt en adaptive immunsystem i bakterier, det har været succesfuldt implementeret for genom ændring i planter og dyr, herunder mennesker. Den primære årsag, hvorfor CRISPR-Cas har opnået så stor popularitet på så kort tid er der det element, der bringer de vigtigste Cas endonuklease, såsom Cas9 eller Cas12a (også kendt som Cpf1), til den korrekte placering i genomet er blot et kort stykke af kimære enkelt guide RN A (sgRNA), som er ligetil at design og billigt at syntetisere. Efter at blive rekrutteret til mål-webstedet, Cas enzym fungerer som et par af molekylære sakse og kløver det bundne DNA med sin RuvC, HNH eller Nuc domæner12,13,14. Den resulterende dobbelt strandede pause (DSB) er efterfølgende repareres af celler via enten ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) eller homologi-instrueret reparation (HDR) pathway. I mangel af en reparation skabelon, er DSB repareret af den fejlbehæftede NHEJ vej, der kan give anledning til pseudo-tilfældige indsættelse eller deletion af nukleotider (indels) på webstedet cut, potentielt forårsager frameshift mutationer i gener, protein-kodning. Men i nærværelse af en donor-skabelon, der indeholder de ønskede DNA ændringer, DSB er repareret af high fidelity HDR pathway. Almindelige typer af donor skabeloner omfatter enkeltstrenget oligonukleotider (ssODNs) og plasmider. Førstnævnte bruges typisk, hvis de påtænkte DNA ændringer er små (f.eks. ændring af en enkelt basepar), mens sidstnævnte er typisk bruges hvis man ønsker at indsætte en relativt lang sekvens (f.eks den kodende sekvens af en grøn fluorescerende proteiner eller Normal god landbrugspraksis) i target locus.
Liv1975 aktivitet af Cas protein kræver tilstedeværelsen af et protospacer tilstødende motiv (PAM) på målet site15. PAM Cas9 er ultimo 3′ protospacer, mens PAM Cas12a (også kaldet Cpf1) er på 5′-enden i stedet16. Cas-guide RNA komplekse er ude af stand til at indføre en DSB, hvis PAM er fraværende17. Derfor, PAM placerer en begrænsning på de genomisk steder hvor en særlig Cas nukleasen er stand til at kløve. Heldigvis, Cas nukleaser fra forskellige bakteriearter typisk udviser forskellige PAM krav. Derfor, ved at integrere forskellige CRISPR-Cas systemer i vores engineering værktøjskasse, kan vi udvide antallet af websteder, der kan være målrettet i en genom. Desuden kan en naturlig Cas enzym manipuleret eller udviklet sig til at genkende alternative PAM sekvenser, yderligere udvide anvendelsesområdet for genomisk mål tilgængelige for manipulation18,19,20.
Selv om flere CRISPR-Cas systemer er tilgængelige for genom engineering formål, har de fleste brugere af teknologien påberåbt sig hovedsageligt Cas9 nukleasen fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) af flere årsager. Først, det kræver en forholdsvis simpelthen NGG PAM i modsætning til mange andre Cas proteiner, der kan kun kløver i overværelse af mere komplekse PAMs. For det andet, det er den første Cas liv1975 implementeres med succes i humane celler21,22,23,24. For det tredje er SpCas9 langt de bedst karakteriserede enzym til dato. Hvis en forsker ønsker at bruge en anden Cas nukleasen, vil han eller hun ofte være uklart, om hvordan man bedst at designe eksperimentet og hvor godt andre enzymer vil udføre i forskellige biologiske sammenhænge i forhold til SpCas9.
For at skabe klarhed for den relative resultater af forskellige CRISPR-Cas systemer, har vi for nylig udført en systematisk sammenligning af fem Cas endonucleases-SpCas9, Cas9 enzymet fra Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzymet fra Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzymet fra Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), og Cas12a enzymet fra Lachnospiraceae bakterie ND2006 (LbCas12a)25. Vi vurderet til en fair sammenligning, de forskellige Cas nukleaser bruger det samme sæt af målwebsteder og andre forsøgsbetingelser. Undersøgelsen også afgrænset design parametre for hver CRISPR-Cas-system, som ville tjene som en nyttig reference for brugere af teknologien. Her, for bedre at kunne sætte forskerne til at gøre brug af CRISPR-Cas-system, vi leverer en trinvis protokol for optimal genom engineering med forskellige Cas9 og Cas12a enzymer (Se figur 1). Protokollen ikke kun omfatter eksperimentelle detaljer men også vigtige Designovervejelser at maksimere sandsynligheden for en vellykket genom engineering resultatet i pattedyrsceller.
Figur 1 : En oversigt over arbejdsproces til at generere genom redigeret menneskelige cellelinjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
CRISPR-Cas-system er en kraftfuld, revolutionerende teknologi til ingeniør genomer og transcriptomes af planter og dyr. Talrige bakteriearter har vist sig for at indeholde CRISPR-Cas systemer, som potentielt kan være tilpasset til genom og transkriptom engineering formål44. Selv om Cas9 liv1975 fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) var det første enzym til implementeres med succes i humane celler21,22,<sup class="xref…
The authors have nothing to disclose.
M.H.T. understøttes af et agentur for videnskab teknologi og forsknings fælles Rådet Office grant (1431AFG103), en National Medical Research Council tildele (OFIRG/0017/2016), Grundforskningsfond tilskud (NRF2013-THE001-046 og NRF2013-THE001-093), en Ministeriet for uddannelse Tier 1 tilskud (RG50/17 (S)), en start indrømmer Nanyang Technological University og midler for den internationale genetisk Engineering maskine (iGEM) konkurrence fra Nanyang Technological University.
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201 | |
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | NEB | M0371 | |
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X | 1st Base | BUF-3000-50X4L | Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA. |
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X | 1st Base | BUF-3020-10X4L | Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. |
BbsI | NEB | R0539 | |
BsmBI | NEB | R0580 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | 400,000 units/ml |
Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | An alternative to T4 DNA Ligase. |
Rapid DNA Ligation Kit | Thermo Scientific | K1423 | An alternative to T4 DNA Ligase. |
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit | Thermo Scientific | 451245 | The salt solution comes with the TOPO vector in the kit. |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Kit for Gibson assembly. |
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli | Thermo Scientific | C737303 | |
LB Broth (Lennox), powder | Sigma Aldrich | L3022 | Reconstitute in ddH20, and autoclave before use |
LB Broth with Agar (Lennox), powder | Sigma Aldrich | L2897 | Reconstitute in ddH20, and autoclave before use |
SOC media | – | – | 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth |
Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Biotechnology | A-301 | |
REDiant 2X PCR Mastermix | 1st Base | BIO-5185 | |
Agarose | 1st Base | BIO-1000 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | |
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit | Favorgen | FAPDE 300 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate |
L-Glutamine, 200mM | Gibco | 25030 | |
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL | Gibco | 15140 | |
0.25% Trypsin-EDTA, 1X | Gibco | 25200 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160 | FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min |
Phosphate Buffered Saline, 1X | Gibco | 20012 | |
jetPRIME transfection reagent | Polyplus Transfection | 114-75 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 | Epicentre | LUCG-QE09050 | |
ISOLATE II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52067 | An alternative to QuickExtract |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | NEB | N0447 | |
6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA |
Protease Inhibitor Cocktail, Set3 | Merck | 539134 | |
Nitrocellulose membrane, 0.2µm | Bio-Rad | 1620112 | |
Tris-glycine-SDS buffer, 10X | Bio-Rad | 1610772 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS. |
Tris-glycine buffer, 10X | 1st base | BUF-2020 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine. |
Ponceau S solution | Sigma Aldrich | P7170 | |
TBS, 20X | 1st base | BUF-3030 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl. |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
Skim Milk for immunoassay | Nacalai Tesque | 31149-75 | |
WesternBright Sirius-femtogram HRP | Advansta | K12043 | |
Antibody for β-actin (C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | Lot number: C0916 |
MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | |
NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Qubit fluorometer | Thermo Scientific | Q33226 | |
EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Scientific | AMF4300 | |
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA | Addgene | 61591 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: xCas9 3.7 | Addgene | 108379 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: hCas9 | Addgene | 41815 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) | Addgene | 71814 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) | Addgene | 72247 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |