CRISPR-Cas er en kraftig teknologi til ingeniør komplekse genomer av planter og dyr. Her, detalj vi en protokoll effektivt redigere det menneskelige genomet bruker forskjellige Cas-endonucleases. Vi markere viktige hensyn og design parametere for å optimalisere redigering effektivitet.
Gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) systemet fungerer naturlig bakteriell adaptiv immunitet, men har blitt vellykket repurposed genomet Engineering i mange forskjellige levende organismer. Oftest wildtype CRISPR tilknyttet 9 (Cas9) eller Cas12a endonuclease brukes til å holde seg bestemte nettsteder i genomet, hvoretter DNA double-strandet pause repareres via ikke-homologe slutten å bli (NHEJ) veien eller homologi-rettet reparasjon ( HDR) sti avhengig av om en giver mal er fraværende eller presentere henholdsvis. Hittil har CRISPR systemer fra ulike bakterie-art vist å kunne utføre genomet redigering i pattedyrceller. Men til tross for den tilsynelatende enkelheten av teknologi må flere design parametere vurderes, som ofte lar brukerne rådvill om hvordan best for å utføre sine genom redigering eksperimenter. Her beskriver vi en komplett arbeidsflyt fra experimental design til identifikasjon av cellen kloner som bærer DNA endringer, med mål om å tilrettelegge vellykket gjennomføring av genomet redigering eksperimenter i pattedyr linjer. Vi markere nøkkelfaktorer for brukere å merke, inkludert valg av CRISPR system, hvor mellomrom og utformingen av en enkelt-strandet oligodeoxynucleotide (ssODN) giver mal. Vi forventer at denne arbeidsflyten vil være nyttig for genet knockout studier, sykdom modellering innsats, eller generering av reporteren cellelinjer.
Muligheten til å ingeniør genomet av enhver levende organisme har mange biomedisinsk og bioteknologisk programmer, for eksempel korrigering av sykdomsfremkallende mutasjoner, bygging av nøyaktige mobilnettet modeller for sykdom studier eller generering av landbruket vekster med ønskelig egenskaper. Siden begynnelsen av århundret, ulike teknologier er utviklet for genomet engineering i pattedyrceller, inkludert meganucleases1,2,3, sink finger nucleases4,5, eller transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs)6,7,8,9. Men er disse tidligere teknologiene vanskelig å programmet eller kjedelig å montere, og dermed hindrer deres utbredt adopsjon i forskning og industri.
De siste årene, de klynget interspaced regelmessig kort palindromic gjentar (CRISPR) – CRISPR-assosiert (Cas) systemet har dukket opp som en kraftig ny genomet engineering teknologi10,11. Opprinnelig en adaptive immunsystemet i bakterier, det har blitt deployert for genomet endring i planter og dyr, inkludert mennesker. Hovedårsak hvorfor CRISPR-Cas har fått så mye popularitet i så kort tid er at elementet som bringer den viktigste Cas-endonuclease, som Cas9 eller Cas12a (også kjent som Cpf1), til riktig sted i genomet er bare et kort stykke chimeric enkelt støttelinje RN En (sgRNA), som er enkelt å utforme og billig å syntetisere. Etter blir rekruttert til målområdet, Cas enzymet fungerer som et par molekylær saks og innstiftet bundet DNA med sin RuvC, HNH eller Nuc domener12,13,14. Resulterende dobbel strandet pause (DSB) repareres senere av cellene via enten ikke-homologe slutten med (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR) veien. I fravær av en reparasjon mal repareres DSB av feilutsatte NHEJ veien, som kan gi opphav til pseudo-tilfeldige innsetting eller sletting av nukleotider (indeler) på webområdet kutt, potensielt forårsake frameshift mutasjoner i protein-koding gener. Men i nærvær av en donor mal som inneholder endringene i DNA, er DSB reparert av Hi-Fi HDR veien. Vanlige typer donor maler inkluderer enkelt-strandet oligonucleotides (ssODNs) og plasmider. Tidligere brukes vanligvis hvis tiltenkte DNA endringene er små (for eksempel endring av en enkelt base-par), mens sistnevnte brukes vanligvis hvis man ønsker å sette inn en relativt lang sekvens (for eksempel koding sekvensen av en grønn fluorescerende protein eller GFP) i målet locus.
Endonuclease aktiviteten til Cas protein krever tilstedeværelse av en protospacer tilstøtende motiv (PAM) mål område15. PAM Cas9 er på 3 slutten av protospacer, PAM Cas12a (også kalt Cpf1) er på 5′ slutten i stedet16. Cas-guiden RNA komplekse er ikke innføre en DSB hvis PAM er fraværende17. Derfor plasserer PAM en begrensning på genomisk stedene der en bestemt Cas-nuclease er i stand til å holde seg. Heldigvis viser Cas nucleases fra ulike bakterie-art vanligvis ulike PAM krav. Ved å integrere ulike CRISPR-Cas systemer i våre tekniske verktøykassen, kan vi derfor utvide omfanget av nettsteder som kan målrettes i et genom. Videre kan et naturlig Cas enzym være konstruert eller utviklet for å gjenkjenne alternativ PAM sekvenser, ytterligere utvide omfanget av genomisk mål tilgjengelig for manipulasjon18,19,20.
Selv om flere CRISPR-Cas-systemer finnes genomet engineering formål, har de fleste brukere av teknologi stolt på Cas9 nuclease fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) av flere grunner. Først krever det en relativt enkelt NGG PAM, i motsetning til mange andre sertifiseringsinstanser proteiner som kan bare holde seg i nærvær av mer komplekse PAMs. Det andre er den første Cas endonuclease å bli distribuert i menneskeceller21,22,23,24. Tredje er SpCas9 langt den beste preget enzymet hittil. Hvis en forsker ønsker å bruke en annen Cas nuclease, vil han eller hun ofte være uklart om hvordan best å utforme eksperimentet og hvor godt andre enzymer vil opptre i ulike biologiske sammenhenger i forhold til SpCas9.
For å utdype den relative ytelsen til forskjellige CRISPR-Cas-systemer, har vi nylig utførte en systematisk Sammenlikning av fem Cas endonucleases-SpCas9, Cas9 enzymet fra Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzymet fra Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzymet fra Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) og Cas12a enzymet fra Lachnospiraceae bakterie ND2006 (LbCas12a)25. For en rettferdig sammenligning vurdert vi de ulike Cas nucleases bruker samme sett med målområder og andre eksperimentelle forhold. Studien også avgrenset design parameterne for hver CRISPR-Cas-system, som ville tjene som en nyttig referanse for brukere av teknologi. Her, bedre aktiverer forskere å bruke CRISPR-Cas system, gir vi en trinnvis protokoll for optimal genomet engineering med forskjellige Cas9 og Cas12a enzymer (se figur 1). Protokollen inkluderer ikke bare eksperimentelle detaljer men også viktige Utformingshensyn å maksimere sannsynligheten for et vellykket genomet engineering resultat i pattedyrceller.
Figur 1 : En oversikt over arbeidsflyten skal generere genomet endret humane cellelinjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
CRISPR-Cas systemet er en kraftig og revolusjonerende teknologi til ingeniør genomes og transcriptomes av planter og dyr. Mange bakteriell arter er funnet for å inneholde CRISPR-Cas-systemer, som kan være tilpasset genom og transcriptome engineering formål44. Selv om Cas9 endonuclease fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) var den første enzymet distribueres vellykket i menneskeceller21,22,23<s…
The authors have nothing to disclose.
M.H.T. støttes av et byrå for vitenskap teknologi og Research felles rådet Office grant (1431AFG103), gir en National Medical Research Council (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation gir (NRF2013-THE001-046 og NRF2013-THE001-093), en Departementet for utdanning Tier 1 grant (RG50-17 (S)), en oppstart gi fra Nanyang Technological University, og midler til internasjonale genetisk Engineering maskin (iGEM) konkurransen fra Nanyang Technological University.
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201 | |
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | NEB | M0371 | |
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X | 1st Base | BUF-3000-50X4L | Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA. |
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X | 1st Base | BUF-3020-10X4L | Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. |
BbsI | NEB | R0539 | |
BsmBI | NEB | R0580 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | 400,000 units/ml |
Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | An alternative to T4 DNA Ligase. |
Rapid DNA Ligation Kit | Thermo Scientific | K1423 | An alternative to T4 DNA Ligase. |
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit | Thermo Scientific | 451245 | The salt solution comes with the TOPO vector in the kit. |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Kit for Gibson assembly. |
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli | Thermo Scientific | C737303 | |
LB Broth (Lennox), powder | Sigma Aldrich | L3022 | Reconstitute in ddH20, and autoclave before use |
LB Broth with Agar (Lennox), powder | Sigma Aldrich | L2897 | Reconstitute in ddH20, and autoclave before use |
SOC media | – | – | 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth |
Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Biotechnology | A-301 | |
REDiant 2X PCR Mastermix | 1st Base | BIO-5185 | |
Agarose | 1st Base | BIO-1000 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | |
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit | Favorgen | FAPDE 300 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate |
L-Glutamine, 200mM | Gibco | 25030 | |
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL | Gibco | 15140 | |
0.25% Trypsin-EDTA, 1X | Gibco | 25200 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160 | FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min |
Phosphate Buffered Saline, 1X | Gibco | 20012 | |
jetPRIME transfection reagent | Polyplus Transfection | 114-75 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 | Epicentre | LUCG-QE09050 | |
ISOLATE II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52067 | An alternative to QuickExtract |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | NEB | N0447 | |
6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA |
Protease Inhibitor Cocktail, Set3 | Merck | 539134 | |
Nitrocellulose membrane, 0.2µm | Bio-Rad | 1620112 | |
Tris-glycine-SDS buffer, 10X | Bio-Rad | 1610772 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS. |
Tris-glycine buffer, 10X | 1st base | BUF-2020 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine. |
Ponceau S solution | Sigma Aldrich | P7170 | |
TBS, 20X | 1st base | BUF-3030 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl. |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
Skim Milk for immunoassay | Nacalai Tesque | 31149-75 | |
WesternBright Sirius-femtogram HRP | Advansta | K12043 | |
Antibody for β-actin (C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | Lot number: C0916 |
MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | |
NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Qubit fluorometer | Thermo Scientific | Q33226 | |
EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Scientific | AMF4300 | |
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA | Addgene | 61591 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: xCas9 3.7 | Addgene | 108379 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: hCas9 | Addgene | 41815 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) | Addgene | 71814 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) | Addgene | 72247 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |