Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Kaiwen  Ivy Liu; Norfala-Aliah  Binte Sutrisnoh; Yuanming Wang; Meng How Tan

doi:10.3791/59086

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Genetics

Genomet redigering i däggdjur cellinjer med CRISPR-Cas

Published: April 11, 2019

doi:

10.3791/59086

Kaiwen Ivy Liu, Norfala-Aliah Binte Sutrisnoh, Yuanming Wang², Meng How Tan²

¹Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, ²School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas är en kraftfull teknik för att konstruera komplexa genomen hos växter och djur. Här, detalj vi ett protokoll för att effektivt redigera det mänskliga genomet som använder olika Cas endonucleases. Vi belysa viktiga överväganden och konstruktionsparametrar att optimera redigering effektivitet.

Abstract

Klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) systemet fungerar naturligt i bakteriell adaptiv immunitet, men har varit framgångsrikt repurposed för genomet engineering i många olika levande organismer. Vanligast, vildtyp CRISPR associerade 9 (Cas9) eller Cas12a Amiiiiin används för att klyva specifika platser i genomet, varefter rasten dubbelsträngat DNA repareras via icke-homolog slutet att gå (NHEJ) väg eller på homologi-regisserad reparation ( HDR) väg beroende på om en givare mall är frånvarande eller presentera respektive. Hittills har har CRISPR system från olika bakteriearter visat sig kunna utföra gen editering i däggdjursceller. Men trots den skenbara enkelheten av teknik måste flera design parametrar övervägas, som ofta lämnar användare villrådig om hur bäst för att utföra sin arvsmassa redigering experiment. Här beskriver vi ett komplett arbetsflöde från experimentell design till identifiering av cell kloner som bär önskat DNA ändringar, med målet att underlätta framgångsrika genomförandet av genomet redigering experiment i däggdjursceller linjer. Vi belysa viktiga överväganden för användare att ta del av, inklusive valet av CRISPR system, spacer längden och utformningen av en mall för givare av enkelsträngat oligodeoxynucleotide (ssODN). Vi föreställer oss att det här arbetsflödet kommer att vara användbart för genen knockout studier, sjukdom modellering ansträngningar, eller generering av reporter cellinjer.

Introduction

Förmågan att ingenjör genomet hos någon levande organism har många biomedicinska och biotekniska tillämpningar, såsom korrigering av sjukdomsframkallande mutationer, byggandet av korrekt cellular-modeller för sjukdom studier eller generation av jordbruks grödor med önskvärda egenskaper. Sedan vänden av århundradet, olika tekniker har utvecklats för genomet engineering i däggdjursceller inklusive meganucleases¹^,²^,³, zink finger nukleotider⁴^,⁵, eller transkription aktivator-liknande effektor nukleaser (TALENs)⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Dessa tidigare tekniker är dock svår att program och tråkiga att montera, därmed hämmar deras utbredd användning i forskning och industrin.

Under de senaste åren, den klustrade mellanliggande regelbundet kort palindromic repetitioner (CRISPR) – CRISPR-associerade (Cas) system har vuxit fram som en kraftfull ny genome engineering technology¹⁰^,¹¹. Ursprungligen en adaptiva immunsystemet i bakterier, det har varit framgångsrikt distribuerat för genomet ändring i växter och djur, inklusive människor. En primär anledning varför CRISPR-Cas har fått så mycket popularitet på så kort tid är det elementet som ger den viktiga Cas Amiiiiin, såsom Cas9 eller Cas12a (även känd som Cpf1), på rätt plats i genomet är bara en kort bit av chimära enda guide RN En (sgRNA), som är enkla att design och billigt att syntetisera. Efter rekryteras till målwebbplatsen, Cas enzymet fungerar som ett par molekylära saxar och klyver bundna DNA med dess RuvC, HNH eller Nuc domäner¹²^,¹³^,¹⁴. Den resulterande dubbel strandsatta pausen (DSB) repareras därefter av cellerna via antingen icke-homolog slutet att gå (NHEJ) eller homologi-regisserad reparation (HDR) väg. I avsaknad av en reparation mall repareras DSB av felbenägna NHEJ vägen, som kan ge upphov till pseudo-slumpmässiga infogning eller borttagning av nukleotider (indels) på webbplatsen skurna, potentiellt orsaka frameshift mutationer i proteinet-kodande gener. Dock i närvaro av en givare-mall som innehåller DNA ändringarna, repareras DSB av HiFi HDR smittvägen. Vanliga typer av givare mallar inkluderar enkelsträngat oligonukleotider (ssODNs) och plasmider. Förstnämnda används vanligtvis om de avsedda DNA-förändringarna är små (exempelvis ändring av ett enda baspar), medan den senare används vanligtvis om man vill infoga en relativt lång sekvens (exempelvis den kodande sekvensen av ett grönt fluorescerande protein eller GFP) i det mål locus.

Amiiiiin aktiviteten av proteinet Cas kräver närvaro av en protospacer intill motiv (PAM) på mål plats¹⁵. Den PAM av Cas9 är slutet 3′ av protospacer, medan den PAM av Cas12a (även kallad Cpf1) är på 5′ avsluta istället¹⁶. Cas-guiden RNA komplex är inte att införa en DSB om PAM är frånvarande¹⁷. PAM förlägger därför en begränsning på de genomiska platser där en viss Cas nuclease kunna klyva. Lyckligtvis, Cas nukleaser från olika bakteriearter uppvisar vanligtvis olika PAM krav. Därav, genom att integrera olika CRISPR-Cas system i våra engineering verktygslådan, kan vi öka utbudet av platser som kan riktas i en genomet. Dessutom kan en naturlig Cas-enzym vara konstruerad eller utvecklats för att identifiera alternativa PAM sekvenser, ytterligare utvidgning av genomisk mål nås till manipulation¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Även om flera CRISPR-Cas system finns tillgängliga för genomet engineering ändamål, har de flesta användare av tekniken åberopat huvudsakligen den Cas9 nuclease från Streptococcus pyogenes (SpCas9) av flera skäl. Först, det kräver en förhållandevis enkelt NGG PAM, till skillnad från många andra Cas proteiner som kan bara klyva i närvaro av mer komplexa PAMs. Det andra är den första Cas Amiiiiin distribueras framgångsrikt i mänskliga celler²¹^,²²^,²³^,²⁴. Tredje är SpCas9 överlägset bäst kännetecknas enzymet hittills. Om en forskare vill använda en annan Cas nuclease, skulle han eller hon ofta vara oklart om hur man bäst att utforma experimentet och hur väl andra enzymer utför i olika biologiska sammanhang jämfört med SpCas9.

För att ge klarhet till relativa prestanda för olika CRISPR-Cas system, har vi nyligen utfört en systematisk jämförelse av fem Cas endonucleases – SpCas9, enzymet Cas9 från Staphylococcus aureus (SaCas9), enzymet Cas9 från Neisseria meningitidis (NmCas9), det Cas12a enzymet från Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) och enzymet Cas12a från Lachnospiraceae bakterien ND2006 (LbCas12a)²⁵. För en rättvis jämförelse utvärderat vi de olika Cas nukleaser använder samma uppsättning mål platser och andra försöksbetingelser. Studien avgränsas också design parametrar för varje CRISPR-Cas-systemet, som skulle tjäna som en användbar referens för användare av tekniken. Här, att bättre möjliggöra forskare att använda CRISPR-Cas system, vi tillhandahåller en stegvisa protokoll för optimal genomet engineering med olika Cas9 och Cas12a-enzymer (se figur 1). Protokollet omfattar inte endast experimentella Detaljer men också viktiga designhänsyn att maximera sannolikheten för en framgångsrik genomet engineering resultatet i däggdjursceller.

Figur 1 : En översikt av arbetsflödet att generera genomet redigeras mänskliga cellinjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. design av sgRNAs Välj ett lämpligt CRISPR-Cas system. Först inspektera målregionen för PAM sekvenser av alla Cas9 och Cas12a nukleaser som har visat sig vara funktionell i däggdjursceller16,21-32. Fem vanliga enzymer ges i tabell 1 tillsammans med deras respektive PAMs.Obs: förutom endonucleases som anges i tabell 1, det finns andra mindre vanliga Cas-enzymer som framgångsrikt har distribuerats i däggdjursceller samt, såsom en Cas9 nuclease f…

Representative Results

Att utföra en genomet redigering experiment, en CRISPR plasmid uttrycker en sgRNA inriktning i locus-of-intresse behöver klonas. Först rötas plasmiden med ett restriktionsenzym (vanligtvis en typ IIs enzym) till linjär det. Det rekommenderas att lösa den smälta produkten på en 1% agarosgel tillsammans med en osmält plasmiden att skilja mellan en fullständig och partiell matsmältning. Osmält plasmider är supercoiled, tenderar de att köra snabbare än motsvarigheterna linearized (se figur…

Discussion

CRISPR-Cas systemet är en kraftfull, revolutionerande teknik till ingenjör i arvsmassan och transcriptomes av växter och djur. Många bakteriearter har befunnits innehålla CRISPR-Cas system, som kan potentiellt anpassas för genomet och transkriptom engineering ändamål⁴⁴. Även om den Cas9 Amiiiiin från Streptococcus pyogenes (SpCas9) var det första enzymet distribueras framgångsrikt i mänskliga celler²¹^,²²^,<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. stöds av en byrå för vetenskap, teknologi och forsknings gemensamma rådet Office grant (1431AFG103), en National Medical Research Council bevilja (OFIRG-0017-2016), National Research Foundation bidrag (NRF2013-THE001-046 och NRF2013-THE001-093), en Ministeriet för utbildning Tier 1 grant (RG50/17 (S)), en start bevilja från Nanyang Technological University, och medel för internationella genetiskt Engineering maskin (iGEM) konkurrensen från Nanyang Technological University.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 ^oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

References

Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).