Summary
ويشمل هذا البروتوكول تشريح العظام الطويلة موريني والعزلة نخاع العظام، توليد الضامة نخاع العظام وإنتاج الآكلة مستعمرة بلعم حفز المنشط مستقبلات ليجند العامل النووي كابا-ب (رانكل) وعامل (م-CSF) باستخدام أو ألفا عامل نخر الورم (تنف-α) واعتقالهم من قبل الأضداد المضادة-ج-fms، مستقبلات M-CSF.
Abstract
يعيد البناء العظام عملية معقدة، وأنها تنطوي على فترات للترسيب وارتشاف. ارتشاف العظام هو عملية بموجبها العظام هو موزعة حسب الآكلة في الاستجابة للمحفزات المختلفة. اوستيوكلاست السلائف تفرق في الآكلة مولتينوكلير ردا على مستعمرة بلعم حفز المنشط مستقبلات ليجند العامل النووي كابا-ب (رانكل) وعامل (م-CSF). تحت ظروف مرضية، الشخصية سيتوكين مختلفة وتنطوي على مزيج السيتوكينات الالتهابية. ألفا عامل نخر الورم (تنف-α) واحد من السيتوكينات الأكثر أهمية كما أنها وجدت بكميات كبيرة في المناطق المعنية مع عظام النهايات التحريضية. والغرض من هذا البروتوكول هو توفير أسلوب الذي يتم عزل مورين نخاع العظام لتوليد الآكلة عن طريق الاستقراء مع الخدمات القطرية م وأما رانكل أو تنف-α التي سوف تكون منعت في وقت لاحق بزيادة جرعة من الأضداد المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة، مستقبلات ل M-CSF. وتبرز هذه التجربة القيمة العلاجية للأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة في أمراض التهاب العظام ارتشاف.
Introduction
الآكلة خلايا متخصصة للغاية، وأنها تفرق من الخلايا الجذعية المكونة للدم من خلال دمج متعددة اوستيوكلاست السلائف. أنها ضرورية لإعادة عرض العظام صحية والمساهمة في ارتشاف العظم باثولوجي المرتبطة بأمراض عظمية الالتهابات مثل التهاب المفاصل وأمراض اللثة1.
الدالة أوستيوكلاستوجينيسيس واوستيوكلاست هي توسط عاملين أساسيين؛ مستعمرة بلعم حفز المنشط مستقبلات للعامل النووي كابا-ب يجند (رانكل) وعامل (م-CSF). M-CSF ورانكل هامان ل التمايز اوستيوكلاست2. وثمة عامل آخر هو ما ثبت للحث على تشكيل اوستيوكلاست من نخاع العظم الضامة في المختبر هو عامل نخر الورم ألفا (تنف-α)3،،من45. تنف-α تشكيل اوستيوكلاست وساطة قد ثبت أن تكون حاسمة بالنسبة لعظام النهايات في أمراض العظام المدمرة مثل التهاب المفاصل6وامراض اللثة7و8من هشاشة العظام بعد سن إلياس.
ج-fms مستقبلات غشاء للخدمات القطرية م ويتوسط العمل به. دور ج-fms توثيقاً جيدا في الأدب كما أنها بينت أن إدارة جسم مضاد ضد ج-fms (الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة) تماما اعتقل أوستيوكلاستوجينيسيس في نموذج لالتهاب المفاصل كذلك في تنف-α التي يسببها تقرحات العظام بينما وكان أوستيوكلاستوجينيسيس بعيدة من المشترك ملتهبة قوية لا تزال9. الإدارة للأجسام المضادة-ج-fms تثبيط ارتشاف العظم وتشكيل اوستيوكلاست الناجمة عن lipopolysaccharide (LPS) في الماوس كالفاريا10 كذلك كما هو الحال في التهاب اللثة الناجم عن لبس نموذج11. وعلاوة على ذلك، أعاقت الأجسام المضادة-ج-fms ارتشاف الجذر الميكانيكية الناجمة عن الإجهاد أثناء حركة الأسنان تقويم الأسنان12، فضلا عن حركة الأسنان تقويم الأسنان وارتشاف العظام المرتبطة بتقويم الأسنان حركة13.
M-CSF أبلغ إلى الوظائف الأخرى التي تعتبر أساسية للاستجابة المناعية المضيف. نظراً لغياب م-CSF في الفئران op/op مع الالتهاب الرئوي البكتيري يؤدي إلى زيادة عبء البكتيرية ونشر البكتيريا للكبد مع نخر كبدي14. ولذلك، المهم M-CSF للاستجابة المناعية في الحماية من العدوى.
وتوضح هذه الدراسة بفعل تأثير الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة على م-CSF ورانكل أو تنف-α تشكيل اوستيوكلاست في المختبر والخدمات القطرية م التي يسببها انتشار السلائف اوستيوكلاست. هذا البروتوكول يوضح عزل خلايا نخاع العظام مورين من العظام الطويلة، والخطوات لتوليد الضامة نخاع العظام (بم) التي تعتبر كسلائف اوستيوكلاست والحث على التفريق بين بم في الآكلة مولتينوكلير اثنين الأساليب؛ أما رانكل أو تنف-α. ويقارن البروتوكول أيضا إلقاء القبض على أوستيوكلاستوجينيسيس في كلتا الطريقتين باستخدام الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة.
العملية التي انتزعت نخاع العظام واستخدامها لاحقاً لتوليد السلائف اوستيوكلاست يعول عليها في إنتاج كميات كبيرة من الثقافات اوستيوكلاست الصرفة التي يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات المصب مثل اختبار المخدرات. استخدام رانكل أو تنف-α للحث على أوستيوكلاستوجينيسيس في هذا البروتوكول يميز أوستيوكلاستوجينيسيس كعملية الفسيولوجية (رانكل) من أوستيوكلاستوجينيسيس كعملية باثولوجي (تنف-α)، التي توفر بدورها اثنين من الإجراءات البديلة لتوجيه قرار منها واحد متفوقة من حيث المواد الكاشفة لاستخدامها في تطبيقات المتلقين للمعلومات. ويوفر هذا البروتوكول أيضا أسلوب الذي يمكن أن نحدد تركيز مناسب للأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة التي يمكن استخدامها بأمان للدراسات المعنية بارتشاف العظام وأمراض عظمية في وقت لاحق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات الحيوانية ورعاية الحيوانات وفقا لجامعة توهوكو القواعد والأنظمة.
1-مورين اللكتات التشريح والمناولة
- قبل التشريح، ملء صفيحة مع حوالي 50 مل من α-الفنزويلية تبعاً لحجم الحاوية ووضعه على الجليد. وهذا سيكون بمثابة وعاء جمع حتى اكتمال تشريح العظام جميع. لهذا، وبعد ذلك استخدام التجارب، α-الفنزويلية التي تحتوي على 10% الجنيني البقري المصل (FBS) و 100 وحدة دولية/مل البنسلين G 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين.
- Euthanize C57Bl/6J الماوس باستنشاق جرعة زائدة من إيسوفلوراني 5%.
- إصلاح الماوس في موقف ضعيف استخدام دبابيس اخترقت من خلال أشجار النخيل والقدمين ورذاذ دقيق مع الإيثانول 70%.
- جعل شق جلد باستخدام مقص الجراحية المعقمة وملاقط على مستوى الورك وتوسيعه وصولاً إلى القدمين تعريض العضلات.
- قطع وتر إرفاق في عضلة الفخذ ووتر إرفاق أوتار العضلات بالعظام. قشر خارج العضلات فضح مفاصل الورك والركبة. تحديد موقع هذه الأوتار سيخفف تحرير عضلات كلا من المرفقات بها دون ترك علامات الأنسجة اللينة. لا تقطع في العظام.
- ضع المقص بين رأس عظم الفخذ ومساحة مشتركة، ويقتطع من تحرير عظم الفخذ ولكن الحفاظ العظام سليمة. وهذا سيمكن مفرزة من العظام دون المخاطرة بتعريض نخاع العظام.
- وبالمثل قص بعيداً في عضلات إرفاق إلى الساق. قص الساق خالية من تمسكها في الكاحل الحفاظ العظام سليمة لتجنب التلوث.
- كشط أي الأنسجة اللينة المتبقية من عظم الفخذ والساق باستخدام شفرات مقص وكيمويبي ووضعه في لوحة مع α-الفنزويلية على الجليد.
2-موريني اللكتات العزلة نخاع العظام
- ملء حقنه إبرة ز 30 مع α-الفنزويلية.
- قطع الساق والفخذ بعيداً عن الركبة.
- قص نهايات العظام الطويلة من كلا الجانبين باستخدام مقص.
- عقد العظام من مدخل المنجم باستخدام الملقط وأدخل الإبرة في المساحة نخاع العظام وبطء تدفق محتوى النخاع في طبق ثقافة 6 سم. سوف تظهر العظام البيضاء، مشيراً إلى استخراج كافة المحتويات نخاع العظام. كرر كل العظام.
- استخراج سلالة نخاع العظام باستخدام مصفاة خلية نايلون ميكرومترات 40 إلى 50 مل الأنبوبة المخروطية أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية وتغسل مع 5 مل من α-الفنزويلية والطرد المركزي في 300 x غ 5 كحد أدنى لتكرار الغسيل لما مجموعة 2 مرات.
-
ريسوسبيند بيليه في 10 مل من α-الفنزويلية وأداء عدد خلايا استخدام هيموسيتوميتير النحو التالي:
- جعل إضعاف 1:1 تعليق الخلية بإضافة 10 ميكروليتر من تعليق خلية إلى 10 ميكروليتر من 0.4% تريبان الأزرق في أنبوب 1.5 مل و "الماصة؛" مرة واحدة.
- تغطية قاعة هيموسيتوميتير مع غطاء شريحة ونقل تعليق صبغ هيموسيتوميتير. من المهم عدم أوفيرفيل أو أونديرفيل الدائرة وتسمح بتعليق لملء الدائرة بعمل شعري.
- مكان هيموسيتوميتير في مرحلة مجهر. استخدام 10 x الهدف، التركيز على ساحة مركز. حساب عدد الخلايا كل الالتزام بخطوط 3. للتأكد من أنه لا يتم حساب الخلايا مرتين، عد زوايا العلوي الأيمن والأيسر من كل مربع. ستظهر الخلايا الميتة زرقاء داكنة، وهذه مستبعدة من العد.
- اعتماداً على التطبيق المصب، بذور الخلايا إلى سفينة ثقافة مناسبة. لهذه التجربة خاصة، اتبع الباب 3.
3-توليد بم
- الثقافة الطبق البذور 1 × 107 خلايا/10 مل في 10 سم وإضافة 100 م-CSF نانوغرام/مليلتر. تركيز السائل النخاعي م النهائي 100 نانوغرام/مليلتر من الثقافة المتوسطة. احتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 لمدة 3 أيام.
- بعد 3 أيام، إزالة المتوسطة الثقافة وغسل الخلايا بقوة مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين لإزالة الخلايا غير ملتصقة، إضافة 5 مل من درجة حرارة الغرفة 0.02% التربسين-يدتا في برنامج تلفزيوني واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 لمدة 5 دقائق.
- فصل الخلايا من بيبيتينج شامل. تأكد من أنه قد تم فصل الخلايا بمراعاة ثقافة تحت مجهر (الخلايا يجب أن تظهر مستدير الزوايا والعائمة في وسائل الإعلام). إذا كانت الخلايا لا تزال تعلق، كرر بيبيتينج شامل لفصل لهم. عندما تم فصل الخلايا، إضافة 5 مل من α-الفنزويلية لإلغاء تنشيط رد فعل.
- جمع الخلايا في أنبوب 50 مل المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ س لأدنى 5 تجاهل المادة طافية، وتغسل مع 5 مل من α-الفنزويلية.
- الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند بيليه في 10 مل من α-الفنزويلية.
- نفذ عدد خلايا كما تم وصفه سابقا في خطوة 2.7.1.
- الثقافة الطبق البذور 1 × 106 خلايا/10 مل في 10 سم وإضافة 100 م-CSF نانوغرام/مليلتر. تركيز السائل النخاعي م النهائي 100 نانوغرام/مليلتر من الثقافة المتوسطة. احتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 لمدة 3 أيام.
4-توليد الآكلة من بم كسلائف اوستيوكلاست
- وبعد 3 أيام، حصاد الخلايا المرفقة التي تمثل بم كسلائف اوستيوكلاست، في أعقاب خطوات 3.2-3.7.
- بم البذور في 5 × 104 خلايا/200 ميكروليتر من α-الفنزويلية في صفيحة جيدا 96. إضافة رانكل لتركيز نهائي من 50 نانوغرام/مل أو تنف-α لتركيز نهائي من 100 نانوغرام/مليلتر. إضافة M-CSF لتركيز نهائي من 100 نانوغرام/مليلتر لكل بئر.
- إضافة الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة (تركيزات نهائية من 0، 1، 10، 100، 1000 نانوغرام/مل) لكل بئر.
- احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 لمدة 4 أيام. تغيير وسائل الإعلام كل يوم لمدة 4 أيام.
5-طرطرات مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP) وصمة عار
- وبعد 4 أيام حضانة، بلطف نضح المتوسطة الثقافة لكل بئر. تغسل كل مرة جيدا مع 200 ميكروليتر من درجة حرارة الغرفة 1 x برنامج تلفزيوني.
- إضافة 200 ميكروليتر من الفورمالين 10% لكل بئر للتثبيت واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة. نضح في الفورمالين وغسل كل جيدا 3 مرات مع المياه..
- إضافة 200 ميكروليتر من 0.2% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني لكل خير بالنسبة بيرميبيليزيشن واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة. نضح X-100 تريتون وغسل كل جيدا 3 مرات بالمياه.
- إضافة 200 ميكروليتر من فخ الحل وصمة عار لكل بئر. تصور وصمة عار تحت المجهر. وسوف يستغرق من 10-30 دقيقة لوصمة عار لتطوير بشكل صحيح.
- نضح بوصمة عار ويغسل كل جيدا 3 مرات مع المياه، والهواء الجاف. الحفاظ على درجة حرارة الغرفة لاستخدامها في مزيد من المراقبة.
6-انتشار الإنزيم
- بم البذور كسلائف اوستيوكلاست في 5 × 103 خلايا/200 ميكروليتر من α-الفنزويلية في صفيحة جيدا 96. إضافة M-CSF لتركيز نهائي من 100 نانوغرام/مليلتر لكل بئر.
- إضافة الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة (تركيزات نهائية من 0، 1، 10، 100، 1,000 نانوغرام/مل) واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 لمدة 3 أيام دون تغيير المتوسطة.
- وبعد 3 أيام، غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x. إضافة 100 ميكروليتر من α-الفنزويلية لكل بئر.
- إضافة 10 ميكروليتر خلية العد الحل كيت واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 2 وتحديد امتصاص لكل بئر في 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والغرض من هذا البروتوكول هو تقييم تأثير الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة على تشكيل اوستيوكلاست حضور رانكل أو تنف-α، وتحديد أثر م-CSF على انتشار السلائف اوستيوكلاست. وقد قدمنا في هذا البروتوكول، عملية موثوقة التي تتولد كميات كبيرة من الثقافات اوستيوكلاست نقية. لقد قدمنا أيضا طريقة لاختبار تركيز الأجسام المضادة-ج-fms مناسبة لتثبيط تشكيل اوستيوكلاست تحت ظروف ثقافة مختلفة.
تشكيل اوستيوكلاست في M-ثقافة الخدمات القطرية + رانكل مع الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة ويرد في الشكل 1. الساعة 1، 10 نانوغرام/مل جسم المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة، لم يطرأ أي انخفاض كبير في عدد الآكلة مقارنة للتحكم (0 نانوغرام/ملليلتر). بينما في 100، 1,000 الأضداد المضادة-ج-fms نغ، كان هناك انخفاضا كبيرا في عدد الآكلة مقارنة بعنصر التحكم. ويرد تشكيل اوستيوكلاست في ثقافة م-CSF + تنف-α مع الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة في الشكل 2. في 1 نانوغرام/مليلتر جسم المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة، كان هناك لا انخفاض كبير في عدد الآكلة مقارنة للتحكم (0 نانوغرام/ملليلتر). في 10، 100، 1,000 نانوغرام/مليلتر الأضداد المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة، كان هناك انخفاضا كبيرا في عدد الآكلة مقارنة بعنصر التحكم.
ويرد في الشكل 3اوستيوكلاست السلائف الثقافة مع جسم M-CSF + المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة. الساعة 1، 10، 100 نانوغرام/ملليلتر، لم يطرأ أي انخفاض كبير في عدد السلائف اوستيوكلاست مقارنة بالتحكم (0 نانوغرام/ملليلتر)، بينما في 1,000 نانوغرام/ملليلتر، كان هناك انخفاض كبير في عدد السلائف اوستيوكلاست مقارنة بعنصر التحكم. وهذا يشير إلى ضرورة تركيز يصل إلى 1,000 نانوغرام/مل لتمنع انتشار اوستيوكلاست السلائف إلى حد كبير.
هذه النتائج تقدم معلومات عن طبيعة قوي رانكل في إنتاج الآكلة بينما كان يستخدم بتركيز 50 نانوغرام/مل من رانكل، وهناك حاجة تركيز 100 نانوغرام/مليلتر من تنف-α للحصول على نفس العدد من الآكلة. كل من هذه الأساليب مناسبة لجيل اوستيوكلاست ولكن القرار الذي متفوقة تعتمد على تطبيق المتلقين للمعلومات في السياق الكواشف استخدامها في وقت لاحق. كما تشير النتائج، باستخدام رانكل ليس ما يعادل استخدام تنف-α لتوليد الآكلة.
في هذا البروتوكول، استخدمنا الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة أن تمنع أوستيوكلاستوجينيسيس، ومن خلال النظر في النتائج، نجد أن تركيز 100 نانوغرام/مليلتر من الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة ضروري لتحقيق انخفاض كبير في عدد اوستيوكلاست في آبار رانكل. هناك حاجة إلى تركيز 1,000 نانوغرام/مليلتر من الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة لتمنع انتشار السلائف اوستيوكلاست في مكسف انتشار المقايسة، حين كان تركيز فقط 10 نانوغرام/مل من الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة بحاجة إلى تحقيق انخفاض كبير في اوستيوكلاست عدد في الآبار تنف-α.
رقم 1: تأثير الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة على تشكيل المستحثة رانكل اوستيوكلاست- الملاحظة المجهرية اوستيوكلاست السلائف التي كانت تعامل مع M-CSF، رانكل والجرعات المختلفة للأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة (0، 1، 10، 100 و 000 1 نانوغرام/مل) لمدة 4 أيام. الخلايا الثابتة وملطخة تلطيخ فخ. عدد الخلايا إيجابية فخ مثقف مع M-CSF، رانكل وتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة (0، 1، 10، 100 و 000 1 نانوغرام/مل) لمدة 4 أيام. الخلايا الثابتة وملطخة تلطيخ فخ. وجرى تقييم عدد الخلايا إيجابية فخ. وأعرب عن النتائج كما يعني ± التنمية المستدامة من أربع ثقافات. تم الكشف عن الاختلافات الإحصائية باستخدام اختبارات شيف (n = 4؛ * ف < 0.01). تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تأثير الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة على تشكيل اوستيوكلاست الناجمين عن تنف-α- الملاحظة المجهرية اوستيوكلاست السلائف التي كانت تعامل مع M-CSF، وتنف-α، والجرعات المختلفة للأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة (0، 1، 10، 100 و 000 1 نانوغرام/مل) لمدة 4 أيام. الخلايا الثابتة وملطخة تلطيخ فخ. عدد الخلايا إيجابية فخ مثقف مع M-CSF، وتنف-α، وتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة (0، 1، 10، 100 و 000 1 نانوغرام/مل) لمدة 4 أيام. الخلايا الثابتة وملطخة تلطيخ فخ. وجرى تقييم عدد الخلايا إيجابية فخ. وأعرب عن النتائج ك ± ميانف المرسوم العالي من أربع ثقافات. تم الكشف عن الاختلافات الإحصائية باستخدام اختبارات شيف (n = 4؛ * ف < 0.01). تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تأثير الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة على انتشار السلائف اوستيوكلاست- خلية بقاء السلائف اوستيوكلاست التي كانت تعامل مع M-CSF والجرعات المختلفة للأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة (0، 1، 10، 100 و 000 1 نانوغرام/مل) لمدة 3 أيام. خلية العد 8 مواد استخدمت لقياس جدوى. يتم عرض البيانات كنسبة مئوية لمقارنة النشاط النسبي من الآبار التي تحتوي على السائل النخاعي م + المضادة-ج-fms مقابل الآبار التي تحتوي على السائل النخاعي م وحدها وأعرب يعني ± التنمية المستدامة من أربع ثقافات. تم الكشف عن الاختلافات الإحصائية باستخدام اختبارات شيفي (n = 4؛ * ف < 0.01). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن التحقيق في تأثير الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة على تشكيل المستحثة رانكل اوستيوكلاست، اوستيوكلاست تنف α-المستحثة بتشكيل وانتشار السلائف اوستيوكلاست CSF المستحثة م. وجدنا أن المبلغ الفعلي للأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة لتثبيط أوستيوكلاستوجينيسيس بين تشكيل المستحثة رانكل اوستيوكلاست وتنف-α التي يسببها اوستيوكلاست تشكيل وانتشار الخدمات القطرية المستحثة م السلائف اوستيوكلاست مختلفة.
رانكل يتوسط أوستيوكلاستوجينيسيس حضور م الخدمات القطرية في المختبر، وتجربة الفئران رتبة خالية null أوستيوبيتروسيس شديدة بسبب فشل الآكلة لتطوير15، وهكذا رانكل سيتوكين إلزامية أوستيوكلاستوجينيسيس وقد دور تنظيمي هام في التوازن العظام. ولذلك، إذا كان يمكن التحكم في تشكيل اوستيوكلاست رانكل المستحثة، الانخفاض في العظام يمكن السيطرة على الإعلام. ومع ذلك، في حالة حدوث قمع مفرط، التوازن العظام لا سيستمر. في هذه التجربة، ونظهر أن الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة يجب أن يكون في تركيز عال 100 نانوغرام/مليلتر لتكون قادرة على إنقاص تشكيل اوستيوكلاست الناجمة عن رانكل.
تنف-α تشكيل اوستيوكلاست وساطة قد ثبت أن تكون حاسمة بالنسبة لعظام النهايات في المدمرة العظام أمراض مثل التهاب المفاصل6،7من أمراض اللثة، وترقق العظام بعد سن إلياس8 وهنا نعرض أن مكافحة-ج-الإدارة المالية يمكن بسهولة أن تمنع جسم تشكيل اوستيوكلاست توسط تنف-α بتركيز منخفض من 10 نانوغرام/مل. النتيجة تشير إلى أن تركيز منخفضة من الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة يمكن أن تكون ذات قيمة علاجية لتقليل عملية أوستيوكلاستوجينيسيس في ظروف مرضية ولكن سيكون له أثر ضئيل على أوستيوكلاستوجينيسيس في الظروف العادية.
م-قوات الأمن المركزي هو عامل أساسي لتشكيل اوستيوكلاست كالبروتوكول الاختياري/op الفئران التي تفتقر إلى Csf1 الجين الترميز لإظهار م-CSF النمط الظاهري أوستيوبيتروتيك بسبب الانعدام التام للأكلة16. م-قوات الأمن المركزي يعزز أيضا بقاء سلائف اوستيوكلاست2. يتم زيادة مستويات م-CSF في مصل المرضى المصابين بالتهاب المفاصل الرثياني الذين لديهم شديدة التهاب الفقار المقسط17 وفي السائل الزليلي حول بدلة فضفاضة المشترك18. تنف-α يزيد عدد اوستيوكلاست السلائف في فيفو نتيجة تحريض M-CSF التعبير الجيني في الخلايا اللحمية9. في ضوء هذه البيانات يمكننا أن نستنتج أن م-قوات الأمن المركزي هو وسيط هام من التهاب نتيجة لتأثير تنف-α في الخلايا اللحمية مما يؤدي إلى زيادة في إنتاج الخدمات القطرية م من هذه الخلايا.
وأفيد أن M-CSF يلعب دوراً هاما في الاستجابة المناعية المضيف مثل مضادات الميكروبات وظائف الرئة والكبد البالعات وحيدات النوى أثناء الالتهاب الرئوي14. ولذلك، إذا حدث قمع المفرط من السائل النخاعي م، هناك إمكانية أن تنخفض الاستجابة المناعية. في هذه التجربة، أظهرنا أن هناك حاجة إلى تركيز عال جداً من الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة (1,000 نانوغرام/ملليلتر) تحول دون بقاء سلائف اوستيوكلاست وانتشار توسط م-قوات الأمن المركزي. توحي هذه النتائج تؤخذ جنبا إلى جنب أن الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة قد تعمل كما العلاجية للقبض على أوستيوكلاستوجينيسيس في تنف-α الناجمة عن أمراض عظمية في التركيزات المنخفضة، في نفس الوقت هذا التركيز تدخر تشكيل اوستيوكلاست الناجمة عن رانكل و M-الخدمات القطرية التي سوف تسمح للعظام يعيد البناء أن يحدث.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول يجب أن تتم بعناية لضمان نجاح التجربة. في بداية البروتوكول أثناء تشريح، من المهم تجنب القطع في العظام لتفادي تلوث نخاع العظام. عملية استخراج نخاع العظام، التأكد من أنه تم استخراج جميع نخاع العظام، وينبغي تكرار إجراء التنظيف على كل حاجة حتى تم استخراج جميع نخاع العظام، التي ستقدم عالية غلة من الخلايا. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم في تطبيقات متعددة المتلقين للمعلومات، مثل اختبار كاشف، ويوفر أيضا طريقة التي يمكن اختبار تركيز الأجسام المضادة-ج-fms تجنب تفسير النتائج كاذبة. وكما أظهرنا، تركيز الأجسام المضادة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة التي كانت تحول دون تشكيل اوستيوكلاست ليست متساوية بين الأساليب التي تم الحصول عليها هي الآكلة (رانكل أو تنف-α)، وبالتالي أي النتائج التي تم الحصول عليها فيما يتعلق بتركيز مكافحة-ج-المكتب الاتحادي للهجرة قد درست بعناية في المستقبل التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها جزئيا كاكينهي JSPS منحة من "الجمعية اليابانية" "تعزيز العلوم" (رقم 16 ك 11776 إلى حاء ك، ك 17 رقم 17306 إلى ك. س.، رقم 16 ك 20637 إلى ك. ك.، رقم 16 ك 20636 إلى م. س.، رقم 18 ك 09862 م أولاً.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
- Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
- Teitelbaum, S. L.
- Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).
- Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).
- Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).
- Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).
- Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).
- Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
- Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).
- Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).
- Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).
- Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).
- Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).
- Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).
- Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).
- Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).
- Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).
- Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).
