Summary
Ce protocole comprend la dissection de murin des os longs et l’isolement de la moelle osseuse, pour générer des macrophages de la moelle osseuse et de produire des ostéoclastes à l’aide de la colonie de macrophages stimulant facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand facteur nucléaire Kappa-B (RANKL) ou facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et leur arrestation par des anticorps anti-c-fms, récepteurs de M-CSF.
Abstract
Remodelage osseux est un processus complexe et implique des périodes de dépôt et de résorption. La résorption osseuse est un processus par lequel osseuse est décomposé par les ostéoclastes en réponse à différents stimuli. Précurseurs ostéoclastiques se différencient en ostéoclastes multinucléaires en réponse à la colonie de macrophages stimulant facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand facteur nucléaire Kappa-B (RANKL). Dans des conditions pathologiques, le profil des cytokines est différent et implique un mélange des cytokines inflammatoires. Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) est l’un des cytokines plus importants que l'on retrouve en grande quantité dans les zones concernées avec ostéolyse inflammatoire. Le but du présent protocole est de fournir une méthode par laquelle murin de moelle osseuse est isolé pour générer les ostéoclastes par induction avec M-CSF et RANKL ou TNF-α, qui est inhibée par la suite en augmentant les doses d’anticorps anti-c-fms, le récepteur pour M-CSF. Cette expérience met en évidence la valeur thérapeutique des anticorps anti-c-fms dans les maladies inflammatoires de la résorption osseuse.
Introduction
Les ostéoclastes sont des cellules très spécialisées, et ils se différencient des cellules souches hématopoïétiques par la fusion de plusieurs précurseurs ostéoclastiques. Ils sont essentiels pour le remodelage osseux sain et contribuent à la résorption osseuse pathologique associée à des maladies ostéolytiques inflammatoires comme l’arthrite rhumatoïde et la maladie parodontale1.
Fonction Osteoclastogenesis et ostéoclastes sont médiés par deux facteurs clés ; macrophages stimulant les colonies facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand de facteur nucléaire kappa-B (RANKL). M-CSF tant RANKL sont importants pour de différenciation ostéoclastique2. Un autre facteur qui a été montré pour induire la formation des ostéoclastes de macrophages de la moelle osseuse in vitro est le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α)3,4,5. TNF-α ostéoclastique médiée par la formation s’est avérée être crucial pour l’ostéolyse en maladies osseuses destructrices comme6de la polyarthrite rhumatoïde, la maladie parodontale7et l’ostéoporose postménopausique8.
C-fms est le récepteur membranaire de M-CSF et intervient dans son action. Le rôle de c-fms est bien documenté dans la littérature comme il a été démontré que l’administration d’un anticorps dirigé contre c-fms (anticorps anti-c-fms) complètement arrêtées osteoclastogenesis dans un modèle de l’arthrite ainsi que de TNF-α induite par les érosions osseuses tout en osteoclastogenesis lointain de l’articulation enflammée a été encore robuste9. L’administration d’anticorps anti-c-fms inhibe la résorption osseuse et de la formation d’ostéoclastes induite par le lipopolysaccharide (LPS) en souris cranienne10 aussi bien que dans la parodontite induite par LPS modèle11. En outre, les anticorps anti-c-fms inhibent résorption mécanique racine induite par le stress pendant la dent orthodontie mouvement12, ainsi que mouvement dentaire orthodontique et la résorption osseuse associée à dents orthodontique mouvement13.
M-CSF a été rapporté ont d’autres fonctions qui sont essentielles à la réponse immunitaire hôte. L’absence de M-CSF chez les souris op/op avec pneumonie bactérienne conduisent à l’augmentation de la charge bactérienne et de la diffusion bactérienne au foie avec nécrose hépatique14. Par conséquent, M-CSF est important pour une réponse immunologique dans la protection contre l’infection.
Cette étude démontre l’effet des anticorps anti-c-fms sur M-CSF et RANKL ou TNF-α a induit la formation d’ostéoclastes in vitro et M-CSF induit la prolifération des précurseurs ostéoclastiques. Ce protocole montre l’isolement des cellules de la moelle épinière murin des os longs et les étapes pour générer des macrophages de la moelle osseuse (BMM) qui sont considérés comme des précurseurs ostéoclastiques et d’induire la différenciation de BMM en ostéoclastes multinucléaires par deux méthodes ; RANKL ou TNF-α. Le protocole compare également l’arrestation d’osteoclastogenesis dans les deux méthodes à l’aide d’anticorps anti-c-fms.
Le processus par lequel la moelle osseuse est extrait et utilisée ultérieurement pour générer des précurseurs ostéoclastiques est fiable en produisant de grandes quantités de cultures d’ostéoclastes pure qui peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que le dépistage des drogues. L’utilisation de RANKL ou TNF-α pour induire l’osteoclastogenesis dans le présent protocole distingue osteoclastogenesis comme un processus physiologique (RANKL) d’osteoclastogenesis comme un processus pathologique (TNF-α), qui à son tour fournit deux procédures alternatives pour guider la décision, dont l’un est supérieur en ce qui concerne les réactifs à utiliser dans les applications en aval. Ce protocole prévoit également une méthode par laquelle nous pouvons déterminer une concentration appropriée d’anticorps anti-c-fms qui peut être utilisé sans danger pour des études ultérieures impliqués dans la résorption osseuse et maladies ostéolytiques.
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Protocol
Toutes les procédures animaux et soins des animaux ont été réalisés selon les règlements et règles de l’Université de Tohoku.
1. manutention et Dissection postérieur murin
- Avant la dissection, remplir une plaque avec environ 50 mL de α-MEM selon la taille du contenant et placez-le sur la glace. Cela servira comme un conteneur de collection jusqu'à la fin de la dissection de tous les os. Pour cela et les expériences, utilisez α-MEM contenant 10 % bovine sérum fœtal (SVF) 100 UI/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine.
- Euthanasier la souris C57Bl/6J par inhalation d’une dose létale d’isoflurane 5 %.
- Fixez la souris dans une position couchée à l’aide de goupilles percés à travers les paumes et les pieds et les vaporiser avec de l’éthanol à 70 %.
- Faire une incision de la peau à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux stériles au niveau de la hanche et étendez-le descendant jusqu’aux pieds, exposant ainsi les muscles.
- Couper le tendon y attacher le muscle quadriceps et le tendon d’y attacher le muscle ischio-jambiers à l’os. Décollez les muscles exposant les articulations des hanches et des genoux. Localiser ces tendons facilitera la libérant les deux muscles de leurs pièces jointes sans laisser les balises des tissus mous. Ne pas couper dans l’os.
- Positionner les ciseaux entre la tête du fémur et de l’espace commun et couper en libérant du fémur mais conservant l’os. Cela permettra de détachement des os sans le risque d’exposer la moelle osseuse.
- De même couper les muscles attachant sur le tibia. Couper le tibia exempt de son attachement à l’articulation de la cheville en conservant l’OS pour éviter la contamination.
- Grattez tout autres tissus mous du fémur et du tibia en utilisant les lames des ciseaux et kimwipe et placez-le dans une assiette avec α-MEM mis dans la glace.
2. isolement de la moelle osseuse du membre postérieur murin
- Remplissez une seringue à aiguille 30 G de α-MEM.
- Déconnectez le tibia et le fémur de l’articulation du genou.
- Couper les extrémités de l’OS long des deux côtés à l’aide de ciseaux.
- Tenez l’os de l’arbre à l’aide de pinces à épiler, introduire l’aiguille dans l’espace de la moelle de l’os et rincer doucement le contenu de la moelle dans une boîte de Petri de 6 cm. L’OS apparaît blanche, indiquant l’extraction de tous les contenus de la moelle osseuse. Répétez pour tous les os.
- Extrait de la souche de la moelle osseuse à l’aide d’une passoire de cellule 40 μm en nylon dans un tube à centrifuger conique de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant, laver avec 5 mL de α-MEM et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. lavage de répétition pour un total de 2 fois.
-
Resuspendre le culot dans 10 mL de α-MEM et effectuer un nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre comme suit :
- Réaliser une dilution au 1:1 de suspension cellulaire en ajoutant 10 μL de la suspension cellulaire à 10 μL de 0,4 % trypan bleu dans un tube de 1,5 mL et pipeter une fois.
- Couvrir la chambre hémocytomètre avec un couvercle coulissant et transférer la suspension de colorant à l’hémocytomètre. Il est important de ne pas trop remplir ou sous-classement de la chambre et laisser la suspension remplir la chambre par capillarité.
- Placez l’hémocytomètre sur une platine du microscope. À l’aide d’objectif 10 x, se concentrer sur la place du centre. Compter toutes les cellules liées par 3 lignes. Pour s’assurer que les cellules ne sont pas comptées deux fois, compter les coins en haut et à droite de chaque carré. Les cellules mortes apparaîtront bleu foncé, ceux-ci sont exclus de la comte.
- Selon l’application en aval, les cellules des graines dans un récipient de culture approprié. Pour cette expérience particulière, suivez la section 3.
3. génération de BMM
- Semences 1 x 107 cellules/10 mL dans un 10 cm culture plat et ajouter le M-CSF 100 ng/mL. La concentration finale de M-CSF est 100 ng/mL de milieu de culture. Incuber la culture à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 jours.
- Après 3 jours, retirez le milieu de culture, laver les cellules vigoureusement avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois pour enlever les cellules non adhérentes, ajouter 5 mL de température ambiante 0,02 % trypsine-EDTA dans du PBS et incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 5 min.
- Détacher les cellules par pipetage approfondie. Assurez-vous que les cellules ont été détachées en observant la culture sous un microscope (les cellules apparaît arrondie et flottant dans les médias). Si les cellules restent attachées, répétez pipetage soigneusement pour détacher. Lorsque les cellules ont été détachés, ajouter 5 mL de α-MEM pour inactiver la réaction.
- Recueillir les cellules dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. jeter le surnageant et laver avec 5 mL de α-MEM.
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et resuspendre le culot dans 10 mL de α-MEM.
- Effectuez un comptage cellulaire comme décrit dans l’étape 2.7.1.
- Semences 1 x 106 cellules/10 mL dans un 10 cm culture plat et ajouter le M-CSF 100 ng/mL. La concentration finale de M-CSF est 100 ng/mL de milieu de culture. Incuber la culture à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 jours.
4. génération des ostéoclastes de BMM comme précurseurs Ostéoclastiques
- Après 3 jours, récolter les cellules attachées qui représentent BMM comme précurseurs ostéoclastiques, suivant les étapes de 3,2 à 3,7.
- BMM semence à 5 x 104 cellules/200 μL de α-MEM dans une plaque 96 puits. Ajouter RANKL pour une concentration finale de 50 ng/mL ou TNF-α pour une concentration finale de 100 ng/mL. Ajouter M-CSF pour une concentration finale de 100 ng/mL dans chaque puits.
- Ajoutez l’anticorps anti-c-fms (la concentration finale de 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) dans chaque puits.
- Incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 4 jours. Modifier les médias tous les deux jours pendant 4 jours.
5. tache de phosphatases acides tartrate-résistantes (TRAP)
- Après 4 jours d’incubation, aspirer doucement le milieu de culture de chaque puits. Laver chaque bien une fois avec 200 μl de PBS 1 x température ambiante.
- Ajouter 200 μl de 10 % de formol dans chaque puits de fixation et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer le formol et laver chaque puits 3 fois avec de l’eau désionisée.
- Ajouter 200 μl de 0,2 % Triton X-100 dans du PBS à chaque bien de perméabilisation et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer le Triton X-100 et laver chaque puits 3 fois avec de l’eau désionisée.
- Ajouter 200 μl de solution de tache de piège à chaque puits. Visualiser la tache sous le microscope. Il faudra de 10 à 30 min pour la tache pour se développer correctement.
- Aspirer la tache et laver chacun bien avec l’eau désionisée 3 fois et sécher à l’air. Conserver à température ambiante à utiliser en observation supplémentaires.
6. essai de prolifération
- BMM semence comme précurseurs d’ostéoclastes à 5 x 103 cellules/200 μL de α-MEM dans une plaque 96 puits. Ajouter M-CSF pour une concentration finale de 100 ng/mL dans chaque puits.
- Ajoutez l’anticorps anti-c-fms (la concentration finale de 0, 1, 10, 100, 1 000 ng/mL) et incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 jours sans changement médiatique.
- Après 3 jours, laver les cellules avec du PBS 1 x. Ajouter 100 μL de α-MEM dans chaque puits.
- Ajouter 10 μL de solution kit de comptage de cellule et incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 2 h et déterminer l’absorbance de chaque puits à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
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Representative Results
Ce protocole vise à évaluer l’effet des anticorps anti-c-fms sur la formation des ostéoclastes en présence de RANKL ou TNF-α et de déterminer l’effet du M-CSF sur la prolifération des précurseurs ostéoclastiques. Dans ce protocole, nous avons fourni un procédé fiable par laquelle de grandes quantités de cultures d’ostéoclastes pure sont générées. Nous fournissons aussi un moyen de tester la concentration appropriée d’anticorps anti-c-fms pour inhiber la formation des ostéoclastes dans des conditions de culture différente.
La formation des ostéoclastes dans M-culture de CSF + RANKL avec anticorps anti-c-fms est illustrée à la Figure 1. À 1, 10 ng/mL d’anticorps anti-c-fms, il n’y avait aucune diminution significative du nombre des ostéoclastes par rapport au témoin (0 ng/mL). Tout en 100, 1 000 anticorps anti-c-fms de ng, il y avait une diminution significative du nombre des ostéoclastes par rapport au témoin. La formation des ostéoclastes dans la culture de M-CSF + TNF-α par l’anticorps anti-c-fms est illustrée à la Figure 2. À 1 ng/mL d’anticorps anti-c-fms, il n’y avait aucune diminution significative du nombre des ostéoclastes par rapport au témoin (0 ng/mL). Certain temps à 10, 100, 1 000 ng/mL d’anticorps anti-c-fms, il y avait une diminution significative du nombre des ostéoclastes par rapport au témoin.
Culture de précurseurs ostéoclastiques avec anticorps M-CSF + anti-c-fms est illustrée à la Figure 3. À 1, 10, 100 ng/mL, il n’y avait aucune diminution significative du nombre des précurseurs ostéoclastiques par rapport au témoin (0 ng/mL), alors qu’à 1 000 ng/mL, il y avait une diminution significative du nombre des précurseurs ostéoclastiques par rapport au témoin. Ceci indique qu’une concentration aussi élevée que 1 000 ng/mL est nécessaire pour inhiber la prolifération des précurseurs ostéoclastiques significativement.
Ces résultats fournissent des informations sur la nature robuste de RANKL en produisant des ostéoclastes alors qu’une concentration de 50 ng/mL de RANKL a été utilisée, et une concentration de 100 ng/mL de TNF-α a été nécessaire pour obtenir le même nombre d’ostéoclastes. Ces deux méthodes ne conviennent pas pour la production d’ostéoclastes mais dont la décision est supérieure dépend de l’application en aval dans le contexte des réactifs à utiliser plus tard. Comme l’indiquent les résultats, à l’aide de RANKL n’est pas l’équivalent de l’utilisation de TNF-α pour générer des ostéoclastes.
Dans ce protocole, nous avons utilisé des anticorps anti-c-fms pour inhiber les osteoclastogenesis, et en regardant les résultats, nous constatons qu’une concentration de 100 ng/mL d’anticorps anti-c-fms était nécessaire pour produire une diminution significative dans nombre des ostéoclastes dans les puits RANKL. Une concentration de 1 000 ng/mL d’anticorps anti-c-fms était nécessaire pour inhiber la prolifération des précurseurs ostéoclastes dans l’analyse de prolifération de MCSF, tandis qu’une concentration de seulement 10 ng/mL d’anticorps anti-c-fms a été nécessaire pour produire la diminution significative des ostéoclastes nombre de puits de TNF-α.
Figure 1 : effet des anticorps anti-c-fms sur la formation des ostéoclastes induite par le RANKL. Observation microscopique des précurseurs ostéoclastiques qui ont été traités avec le M-CSF, RANKL et diverses doses d’anticorps anti-c-fms (0, 1, 10, 100 et 1 000 ng/mL) pendant 4 jours. Les cellules étaient fixes et colorées au piège la coloration. Nombre de séropositifs au piège cellules cultivées avec M-CSF, RANKL et différentes concentrations d’anticorps anti-c-fms (0, 1, 10, 100 et 1 000 ng/mL) pendant 4 jours. Les cellules étaient fixes et colorées au piège la coloration. Le nombre de cellules positives piège a été évalué. Les résultats ont été exprimés en moyenne ± S.D. des quatre cultures. Des différences statistiques ont été détectés en utilisant des tests de Scheffe (n = 4 ; * p < 0,01). Barreaux de l’échelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : effet d’anticorps anti-c-fms sur la formation des ostéoclastes induite par la TNF-α. Observation microscopique des précurseurs ostéoclastiques qui ont été traités avec le M-CSF, TNF-α et diverses doses d’anticorps anti-c-fms (0, 1, 10, 100 et 1 000 ng/mL) pendant 4 jours. Les cellules étaient fixes et colorées au piège la coloration. Nombre de séropositifs au piège cellules cultivées avec M-CSF, de TNF-α et de diverses concentrations d’anticorps anti-c-fms (0, 1, 10, 100 et 1 000 ng/mL) pendant 4 jours. Les cellules étaient fixes et colorées au piège la coloration. Le nombre de cellules positives piège a été évalué. Les résultats ont été exprimés en meanv ± S.D. des quatre cultures. Des différences statistiques ont été détectés en utilisant des tests de Scheffe (n = 4 ; * p < 0,01). Barreaux de l’échelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : effet des anticorps anti-c-fms sur la prolifération des précurseurs ostéoclastiques. Viabilité des précurseurs ostéoclastiques qui ont été traitées avec le M-CSF et diverses doses d’anticorps anti-c-fms des cellules (0, 1, 10, 100 et 1 000 ng/mL) pendant 3 jours. Cellule de comptage kit-8 a été utilisé pour mesurer la viabilité. Les données sont présentées sous forme de pourcentage de comparer l’activité relative des puits contenant du M-CSF + anti-c-fms versus les puits contenant du M-CSF seul et exprimés en moyenne ± S.D. des quatre cultures. Des différences statistiques ont été détectés en utilisant des tests de Scheffe (n = 4 ; * p < 0,01). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons étudié l’effet des anticorps anti-c-fms sur la formation des ostéoclastes induite par le RANKL, formation des ostéoclastes induite par la TNF-α et prolifération des précurseurs des ostéoclastes induite par la M-CSF. Nous avons constaté que le montant effectif des anticorps anti-c-fms pour l’inhibition de l’osteoclastogenesis entre la formation des ostéoclastes induite par le RANKL, formation d’ostéoclastes induite de TNF-α et M-CSF-induit la prolifération des précurseurs ostéoclastiques est différent.
RANKL Médie osteoclastogenesis en présence de M-CSF in vitro, et souris RANK null expérience ostéopétrose sévère en raison de l’échec des ostéoclastes de développer15, ainsi RANKL est une cytokine obligatoire pour osteoclastogenesis et a un rôle régulateur important dans l’homéostasie osseuse. Par conséquent, si la formation des ostéoclastes induite par le RANKL peut être contrôlée, la diminution en os masse peut être contrôlé. Toutefois, en cas de répression excessive, l’homéostasie osseuse ne sera pas maintenue. Dans cette expérience, nous montrons que les anticorps anti-c-fms doivent être à forte concentration de 100 ng/mL pour pouvoir diminuer la formation d’ostéoclastes induite par le RANKL.
TNF-α ostéoclastique médiée par la formation a été établie comme critiques par ostéolyse dans destructrice osseuse maladies telles que la polyarthrite rhumatoïde6,7de la maladie parodontale et l’ostéoporose postménopausique8 et nous démontrons qu’anti-c-fms anticorps peut facilement empêcher la formation d’ostéoclastique médiée par le TNF-α à de faibles concentrations de 10 ng/mL. Les résultats suggèrent qu’une faible concentration d’anticorps anti-c-fms pourrait être la valeur thérapeutique de diminuer le processus d’osteoclastogenesis dans des conditions pathologiques mais aurait une incidence minime sur osteoclastogenesis dans des conditions normales.
M-CSF est un facteur clé pour la formation des ostéoclastes comme les souris op/op qui n’ont pas le gène codant pour le spectacle de M-CSF un phénotype osteopetrotic en raison de l’absence totale d’ostéoclastes16. Csf1 M-CSF favorise également la survie des ostéoclastes précurseurs2. Niveaux de M-CSF sont augmentées dans le sérum des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde qui ont grave la spondylarthrite ankylosante17 et dans le liquide synovial autour d’une prothèse articulaire lâche18. TNF-α augmente le nombre d’ostéoclastes précurseurs in vivo à la suite de l’induction de l’expression des gènes dans les cellules du stroma9M-CSF. À la lumière de ces données, nous pouvons conclure que le M-CSF est un médiateur important d’inflammation due à l’effet de TNF-α sur les cellules du stroma, qui provoque une augmentation de la production de ces cellules de M-CSF.
Il a été signalé que M-CSF joue un rôle important dans la réponse immunitaire hôte telles que les fonctions antimicrobiennes des phagocytes mononuclées du poumon et le foie au cours de la pneumonie14. Par conséquent, en cas de répression excessive du M-CSF, il est possible que la réponse immunitaire diminueront. Dans cette expérience, nous avons montré qu’une très forte concentration d’anticorps anti-c-fms (1 000 ng/mL) est nécessaire pour inhiber la survie des précurseurs ostéoclastiques et prolifération médiée par le M-CSF. Ces résultats prises côte à côte suggèrent que les anticorps anti-c-fms peuvent fonctionner comme une thérapeutique à l’arrestation d’osteoclastogenesis en TNF-α induite maladies ostéolytiques à faible concentration, en même temps par que cette concentration épargnera formation d’ostéoclastes induite RANKL et M-CSF, qui permettra d’os, remodelage se produise.
Des étapes cruciales dans le protocole doivent être réalisées avec soin pour assurer le succès de l’expérience. Au début du protocole tout en disséquant, il est important d’éviter de couper dans l’OS pour éviter la contamination de la moelle osseuse. Dans le processus d’extraction de la moelle osseuse, afin de s’assurer que toute la moelle osseuse ont été extraites, la procédure de rinçage doit être répétée par besoin jusqu'à ce que toute la moelle osseuse ont été extraits, qui offrira un rendement élevé de cellules. Ce protocole peut être utilisé dans de multiples applications en aval, telles que le test réactif, et il fournit également un moyen par lequel la concentration d’anticorps anti-c-fms peut être testée en évitant la fausse interprétation des résultats. Comme nous l’a montré, la concentration d’anticorps anti-c-fms qui était nécessaire pour empêcher la formation des ostéoclastes n’est pas égale entre les méthodes par les ostéoclastes ont été obtenus (RANKL ou TNF-α), donc les résultats obtenus en ce qui concerne la concentration de l’anti-c-fms ont pour être soigneusement examinées à l’avenir des expériences.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par un JSPS KAKENHI don de la société japonaise pour la Promotion de la Science (n ° 16K 11776 à K., n ° 17K 17306 K. S., n ° 16K 20637 à K. K., n ° 16K 20636 à M. S., n ° 18K 09862 à I. M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
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