Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Effekten av Anti-c-fms antistoff på Osteoclast formasjon og spredning av Osteoclast forløper In Vitro

Published: March 18, 2019 doi: 10.3791/59089
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Department of Translational Medicine, Tohoku University Graduate School of Dentistry

Summary

Denne protokollen inkluderer Disseksjon av murine lange ben og benmarg isolasjon, å generere benmarg makrofager og produsere osteoklast med macrophage koloni stimulerende faktor (M-CSF) og reseptor aktivator av kjernefysiske faktor Kappa-B ligand (RANKL) eller alpha tumor nekrose faktor (TNF-α) og deres arrestasjon av anti-c-fms antistoff, M-CSF reseptor.

Abstract

Ubalanse er en komplisert prosess, og det innebærer avsettelse og benresorpsjon. Benresorpsjon er en prosess som bein er brutt ned av osteoklast svar på ulike stimuli. Osteoclast forløpere skille ut multinuclear osteoklast svar på macrophage koloni stimulerende faktor (M-CSF) og reseptor aktivator av kjernefysiske faktor Kappa-B ligand (RANKL). Patologisk tilfeller cytokin profilen er forskjellige og innebærer en blanding av inflammatoriske cytokiner. Alpha tumor nekrose faktor (TNF-α) er en av de viktigste cytokiner som det finnes i store mengder i områder med inflammatorisk osteolysis. Formålet med denne protokollen er en metode som murine benmargen er isolert for å generere osteoklast gjennom induksjon med M-CSF og RANKL eller TNF-α som vil bli deretter hemmet av økende doser av anti-c-fms antistoff, reseptoren for M-CSF. Dette eksperimentet høydepunkter terapeutisk verdi av anti-c-fms antistoff sykdommer i inflammatorisk benresorpsjon.

Introduction

Osteoklast er svært spesialiserte celler, og de skiller fra blodkreft stamceller gjennom fusjon av flere osteoclast prekursorer. De er avgjørende for sunn ubalanse og bidra til patologisk benresorpsjon forbundet med inflammatorisk osteolytic sykdommer som revmatoid artritt og periodontal sykdom1.

Osteoclastogenesis og osteoclast er formidlet av to viktige faktorer; macrophage koloni stimulerende faktor (M-CSF) og reseptor aktivator av kjernefysiske faktor kappa-B ligand (RANKL). Både M-CSF og RANKL er viktig for osteoclast differensiering2. En annen faktor som har blitt vist å skape osteoclast fra benmargen makrofager i vitro er tumor nekrose faktor alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α mediert osteoclast formasjon har vist seg å være avgjørende for osteolysis i destruktive bein sykdommer som revmatoid artritt6, periodontal sykdom7og postmenopausal osteoporose8.

C-fms er membran reseptor for M-CSF og formidler handlingen. Rollen av c-fms er godt dokumentert i litteraturen som det ble vist at administrasjon av et antistoff mot c-fms (anti-c-fms antistoff) helt arrestert osteoclastogenesis i en leddgikt modell samt i TNF-α indusert bein erosjoner mens osteoclastogenesis fjerne fra betent felles var likevel robust9. Administrasjon av anti-c-fms antistoff hemmet osteoclast formasjon og bein benresorpsjon indusert av lipopolysakkarid (LPS) i musen calvariae10 så vel som LPS-indusert periodontitt modellen11. Videre hemmet anti-c-fms antistoff mekanisk stress-indusert rot benresorpsjon ortodontiske tann bevegelse12, samt ortodontiske tann bevegelse og benresorpsjon forbundet med ortodontiske tann bevegelse13.

M-CSF er rapportert å ha andre funksjoner som er avgjørende for verten immunrespons. Fravær av M-CSF i op/op mus med bakteriell lungebetennelse føre til økning av bakteriell byrden og bakteriell spredning til leveren med nedsatt nekrose14. M-CSF er derfor viktig for immunologiske respons i beskyttelse mot infeksjon.

Denne studien viser effekten av anti-c-fms antistoff på M-CSF og RANKL eller TNF-α indusert osteoclast formasjon i vitro og M-CSF indusert spredning av osteoclast prekursorer. Denne protokollen demonstrerer isolasjon murine beinmargen celleområde fra lange ben, og fremgangsmåten til å generere benmarg makrofager (BMM) som er ansett som osteoclast prekursorer og å indusere differensiering av BMM i multinuclear osteoklast to metoder; enten RANKL eller TNF-α. Protokollen sammenligner også arrestasjonen av osteoclastogenesis i begge metoder å bruke anti-c-fms antistoff.

Prosessen som benmarg trekkes ut og senere brukes til å generere osteoclast prekursorer er pålitelig i å produsere store mengder rent osteoclast kulturer som kan brukes i flere nedstrøms applikasjoner som narkotikatesting. Bruk av enten RANKL eller TNF-α å indusere osteoclastogenesis i denne protokollen skiller osteoclastogenesis som en fysiologiske prosess (RANKL) fra osteoclastogenesis som en patologisk prosess (TNF-α), som igjen gir to alternative prosedyrer å veilede avgjørelsen som er overlegen i form av reagensene i nedstrøms programmer. Denne protokollen gir også en metode som vi kan fastslå en egnet konsentrasjon av anti-c-fms antistoff som kan brukes for senere studier benresorpsjon og osteolytic sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer og dyr omsorg ble utført Tohoku University reglene og forskriftene.

1. murine Hindlimb disseksjon og håndtering

  1. Før disseksjon, fylle en plate med ca 50 mL av α-MEM avhengig av beholderen og legg den på is. Dette vil tjene som en samling beholder til Disseksjon av alle bein er fullført. For dette og etterfølgende bruker eksperimenter, α-MEM inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS), 100 IU/mL penicillin G og 100 μg/mL streptomycin.
  2. Euthanize C57Bl/6J musen ved inhalasjon av en overdose av 5% isoflurane.
  3. Fastsette musen i supine posisjon med pinner gjennomboret gjennom håndflatene og føtter og spray godt med 70% etanol.
  4. Gjør en huden snitt ved hjelp av sterile kirurgisk saks og pinsett nivået av hoften og utvide den til føttene utsette musklene.
  5. Kutt senen feste quadriceps muskel og sene feste hamstring muskelen til beinet. Skrelle bort musklene utsette både hoften og kneet leddene. Finne disse sener vil lette frigjøre både musklene vedleggene uten å forlate bløtvev koder. Ikke kutt i benet.
  6. Plasser saksen mellom hodet av femur og felles plass og skåret i det frigjøre femur men beholder benet. Dette vil aktivere avdeling av bein uten risikoen av å utsette benmargen.
  7. Tilsvarende kuttet bort musklene vedlegges tibia. Kuttet tibia fri fra sine vedlegg i ankelleddet beholder bein å unngå forurensning.
  8. Skrape eventuelle gjenværende bløtvev fra femur og tibia ved hjelp av saks kniver og kimwipe og legg den i en plate med α-MEM plassert på is.

2. murine Hindlimb benmarg isolasjon

  1. Fyll en 30 G nål sprøyte med α-MEM.
  2. Koble tibia og femur fjerne fra kneleddet.
  3. Skjær endene av den lange beinet fra begge sider ved hjelp av saks.
  4. Hold bein fra akselen ved hjelp av pinsett, sette inn nålen inn i margtransplantasjon løpet av bein og sakte tømme innholdet i margen i en 6 cm kultur parabol. Benet vises hvit, indikerer utvinning av alle benmarg innhold. Gjenta for alle bein.
  5. Belastning benmargen Pakk ut med en 40 μm nylon celle sil i en 50 mL konisk sentrifuge rør og sentrifuge på 300 x g for 5 min.
  6. Forkaste nedbryting, vaske med 5 mL α-MEM og sentrifuge 300 x g for 5 min. Gjenta vask for totalt 2 ganger.
  7. Resuspend pellet i 10 mL α-MEM og utføre en celletall bruker en hemocytometer som følger:
    1. Lag en 1:1 fortynning av cellen suspensjon ved å legge 10 μL celle suspensjon 10 μL 0,4% trypan blå i en 1,5 mL tube og Pipetter en gang.
    2. Dekker hemocytometer kammeret med en skyve dekselet og overføre fargestoff suspensjon til hemocytometer. Det er viktig ikke å overfylle underfill kammeret eller tillate suspensjon å fylle kammeret av kapillær handling.
    3. Plasser hemocytometer på et mikroskop scenen. Bruker 10 x mål, Fokuser på torget center. Tell alle celler bundet av 3 linjer. Sikre at celler ikke telles to ganger, Tell de øvre og høyre hjørnene i hver rute. Døde celler vises mørk blå, disse er unntatt fra teller.
  8. Avhengig av programmet nedstrøms frø cellene i et passende kultur fartøy. For denne bestemte eksperimentet, følg del 3.

3. generasjon BMM

  1. Frø 1 x 107 celler/10 mL i en 10 cm kultur parabol og Legg til M-CSF 100 ng/mL. Siste konsentrasjonen av M-CSF er 100 ng/mL kultur medium. Inkuber kulturen ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 dager.
  2. Etter 3 dager, fjerne kultur medium, vaske cellene kraftig med 10 mL fosfat bufret saltoppløsning (PBS) å fjerne ikke-tilhenger celler, legge til 5 mL av romtemperatur 0.02% trypsin-EDTA i PBS og ruge på 37 ° C, 5% CO2 i 5 min.
  3. Koble cellene av grundig pipettering. Kontroller at cellene har blitt frakoblet ved å observere kulturen under et mikroskop (cellene skal komme avrundet og flytende i media). Hvis cellene være knyttet, gjenta pipettering grundig for å løsne dem. Når cellene har blitt frakoblet, kan du legge til 5 mL α-MEM å deaktivere reaksjonen.
  4. Samle cellene i en 50 mL konisk rør og sentrifuge på 300 x g for 5 min. Forkast nedbryting og vaskes med 5 mL α-MEM.
  5. Sentrifuge på 300 x g i 5 min og resuspend pellet i 10 mL α-MEM.
  6. Utføre en celletall som tidligere beskrevet i trinn 2.7.1.
  7. Frø 1 x 106 celler/10 mL i en 10 cm kultur parabol og Legg til M-CSF 100 ng/mL. Siste konsentrasjonen av M-CSF er 100 ng/mL kultur medium. Inkuber kulturen ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 dager.

4. generasjon av osteoklast fra BMM som Osteoclast forløpere

  1. Etter 3 dager, høste tilknyttede cellene som representerer BMM som osteoclast forløpere, følge trinnene 3.2-3.7.
  2. Frø BMM på 5 x 104 celler/200 μL av α-MEM i en 96 godt plate. Legge til RANKL for en siste konsentrasjon av 50 ng/mL eller TNF-α for en siste konsentrasjon 100 ng/ml. Legg til M-CSF for en siste konsentrasjon 100 ng/ml i hver brønn.
  3. Legg til anti-c-fms antistoff (siste konsentrasjoner av 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) i hver brønn.
  4. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 for 4 dager. Endre media annenhver dag 4 dager.

5. tartrate-resistente sure fosfatase (TRAP) flekken

  1. Etter 4 dager med inkubering, forsiktig Sug opp kultur medium for hver brønn. Vask godt når med 200 μL av romtemperatur 1 x PBS.
  2. Tilsett 200 μL av 10% formalin i hver brønn for fiksering og ruge 1t ved romtemperatur. Sug opp formalin og vask hver vel 3 ganger med deionisert vann.
  3. Tilsett 200 μL på 0,2% Triton X-100 i PBS hver godt for permeabilization og Inkuber 1t ved romtemperatur. Sug opp den Triton X-100 og vask hver vel 3 ganger med deionisert vann.
  4. Tilsett 200 μL FELLE flekk løsning i hver brønn. Visualisere flekken under mikroskopet. Det vil ta fra 10-30 min for flekken å utvikle riktig.
  5. Sug opp den flekken og vask hver godt med deionisert vann 3 ganger, og lufttørke. Holde ved romtemperatur å bruke i videre observasjon.

6. spredning analysen

  1. Frø BMM som osteoclast forløpere på 5 x 103 celler/200 μL av α-MEM i en 96 godt plate. Legg til M-CSF for en siste konsentrasjon 100 ng/ml i hver brønn.
  2. Legg til anti-c-fms antistoff (siste konsentrasjoner av 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) og Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 3 dager uten medium endring.
  3. Etter 3 dager, vaske cellene med 1 x PBS. Tilsett 100 μL av α-MEM i hver brønn.
  4. Tilsett 10 μL av cellen teller kit løsning og ruge på 37 ° C, 5% CO2 for 2t og Bestem absorbansen i hver brønn ved 450 nm likner en microplate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med denne protokollen er å vurdere effekten av anti-c-fms antistoff på osteoclast formasjon i nærvær av RANKL eller TNF-α og å bestemme effekten av M-CSF på osteoclast forløpere spredning. I denne protokollen, har vi gitt en pålitelig prosess som store mengder rent osteoclast kulturer er generert. Vi har også gitt en måte å teste anti-c-fms antistoff egnet konsentrasjon for hemme osteoclast formasjon under annen kultur forhold.

Osteoclast dannelsen i M-CSF + RANKL kultur med anti-c-fms antistoff er vist i figur 1. 1, 10 ng/mL anti-c-fms antistoff, det var ingen betydelig reduksjon i antall osteoklast forhold til kontroll (0 ng/mL). Mens på 100, 1000 ng anti-c-fms antistoff, det var en betydelig reduksjon i antall osteoklast forhold til kontroll. Osteoclast dannelsen i M-CSF + TNF-α kultur med anti-c-fms antistoff er vist i figur 2. På 1 ng/mL anti-c-fms antistoff var det ingen betydelig reduksjon i antall osteoklast forhold til kontroll (0 ng/mL). Mens 10, 100, 1000 ng/mL anti-c-fms antistoff, det var en betydelig reduksjon i antall osteoklast forhold til kontroll.

Osteoclast forløpere kultur med M-CSF + anti-c-fms antistoff vises i Figur 3. 1, 10, 100 ng/mL, det var ingen betydelig reduksjon i antall osteoclast forløpere sammenlignet kontroll (0 ng/mL), mens på 1000 ng/mL, var det en betydelig reduksjon i antall osteoclast forløpere sammenlignet med kontrollen. Dette indikerer at en konsentrasjonen så høy som 1000 ng/mL er nødvendig for å hindre spredning av prekursorer osteoclast betydelig.

Disse resultatene gir informasjon om robuste natur av RANKL produsere osteoklast mens en konsentrasjon av 50 ng/mL av RANKL ble brukt, og en konsentrasjon av 100 ng/mL av TNF-α var nødvendig for å få samme antall osteoklast. Begge disse metodene er egnet for osteoclast generasjon, men avgjørelsen som er overordnet avhenger av nedstrøms programmet i konteksten av reagensene skal brukes senere. Som resultatene viser, er bruker RANKL ikke tilsvarende bruk av TNF-α for å generere osteoklast.

I denne protokollen, vi brukte anti-c-fms antistoff for å hemme osteoclastogenesis og ser resultatene, finner vi at en konsentrasjon av 100 ng/mL anti-c-fms antistoff var nødvendig å produsere betydelig reduksjon i osteoclast tallet i RANKL brønner. En konsentrasjon av 1000 ng/mL anti-c-fms antistoff var nødvendig å hemme osteoclast forløper spredning i MCSF spredning analysen, mens en konsentrasjon av bare 10 ng/mL anti-c-fms antistoff var nødvendig for å produsere betydelig reduksjon i osteoclast tall i TNF-α brønner.

Figure 1
Figur 1: effekten av anti-c-fms antistoff på RANKL-indusert osteoclast formasjon. Mikroskopiske observasjon av osteoclast prekursorer som ble behandlet med M-CSF, RANKL og ulike dose anti-c-fms antistoff (0, 1, 10, 100 og 1000 ng/mL) for 4 dager. Cellene ble fast og farget med FELLE flekker. Antall FELLE-positive celler kultivert med M-CSF, RANKL og ulike konsentrasjoner av anti-c-fms antistoff (0, 1, 10, 100 og 1000 ng/mL) for 4 dager. Cellene ble fast og farget med FELLE flekker. Antall FELLE-positive celler ble vurdert. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittlig ± SD fire kulturer. Statistisk forskjeller ble funnet ved hjelp av Scheffes tester (n = 4; * p < 0,01). Skalere barer = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: effekten av anti-c-fms antistoff på TNF-α-indusert osteoclast formasjon. Mikroskopiske observasjon av osteoclast prekursorer som ble behandlet med M-CSF, TNF-α og ulike dose anti-c-fms antistoff (0, 1, 10, 100 og 1000 ng/mL) for 4 dager. Cellene ble fast og farget med FELLE flekker. Antall FELLE-positive celler kultivert med M-CSF, TNF-α og ulike konsentrasjoner av anti-c-fms antistoff (0, 1, 10, 100 og 1000 ng/mL) for 4 dager. Cellene ble fast og farget med FELLE flekker. Antall FELLE-positive celler ble vurdert. Resultatene ble uttrykt som meanv ± SD fire kulturer. Statistisk forskjeller ble funnet ved hjelp av Scheffes tester (n = 4; * p < 0,01). Skalere barer = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: effekten av anti-c-fms antistoff på spredning av osteoclast forløper. Levedyktigheten til osteoclast prekursorer som ble behandlet med M-CSF og ulike dose av anti-c-fms antistoff (0, 1, 10, 100 og 1000 ng/mL) for 3 dager. Cellen teller kit-8 ble brukt til å måle levedyktighet. Dataene presenteres i prosent sammenligne den relative aktiviteten til brønnene som inneholder M-CSF + anti-c-fms versus brønnene som inneholder M-CSF alene og uttrykt i mener ± SD fire kulturer. Statistisk forskjeller ble funnet ved hjelp av Scheffes tester (n = 4; * p < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien undersøkte vi effekten av anti-c-fms antistoff på RANKL-indusert osteoclast formasjon, TNF-α-indusert osteoclast formasjon og M-CSF-indusert osteoclast forløper spredning. Vi fant at effektive anti-c-fms antistoff for hemming av osteoclastogenesis blant RANKL-indusert osteoclast formasjon, TNF-α indusert osteoclast formasjon og M-CSF-indusert spredning osteoclast prekursorer er forskjellige.

RANKL formidler osteoclastogenesis i nærvær av M-CSF i vitro, og RANK null mus erfaring alvorlig osteopetrosis på grunn av osteoklast å utvikle15, dermed RANKL er en obligatorisk cytokin for osteoclastogenesis og har en viktige forskrifter rolle i bein homeostase. Derfor, hvis RANKL-indusert osteoclast formasjon kan kontrolleres, nedgangen i benet masse kan styres. Men hvis overdreven undertrykkelse, bevares bein homeostase ikke. I dette eksperimentet viser vi at anti-c-fms antistoff må være på høy konsentrasjon 100 ng/mL kunne redusere osteoclast dannelsen av RANKL.

TNF-α mediert osteoclast formasjon har vist seg å være avgjørende for osteolysis i destruktiv bein sykdommer som revmatoid artritt6, periodontal sykdom7og postmenopausal osteoporose8 og her viser vi at anti-c-fms antistoff kan lett hemme osteoclast formasjon formidlet av TNF-α ved en lav konsentrasjon av 10 ng/mL. Resultatet antyder at en lav konsentrasjon av anti-c-fms antistoff kan være terapeutisk verdi å redusere prosessen med osteoclastogenesis i patologisk forhold, men ville ha minimal effekt på osteoclastogenesis i normale forhold.

M-CSF er en nøkkelfaktor for osteoclast formasjon som op/op musene som mangler Csf1 genet koding for M-CSF viser en osteopetrotic fenotypen på grunn fullstendig mangel på osteoklast16. M-CSF fremmer også overlevelse av osteoclast forløpere2. M-CSF nivåene er økt i serum av pasienter med revmatoid artritt som har alvorlige Bekhterevs sykdom17 og i synovial væske rundt løs felles protese18. TNF-α øker antallet osteoclast forløpere i vivo som følge av inducing M-CSF genuttrykk i stromal celler9. I lys av disse dataene kan vi konkludere med at M-CSF er en viktig formidler av betennelse på grunn av virkningen av TNF-α på stromal celler som forårsaker en økning i M-CSF produksjon fra disse cellene.

Det har blitt rapportert at M-CSF spiller en viktig rolle i vert immunforsvaret som antimicrobial funksjoner av både lunge og lever mononukleære phagocytes under lungebetennelse14. Derfor hvis overdreven undertrykkelse av M-CSF skjer, er det en mulighet som immunforsvaret reduseres. I dette eksperimentet viste vi at en svært høy konsentrasjon av anti-c-fms antistoff (1000 ng/mL) var nødvendig å hemme osteoclast forløpere overlevelse og spredning formidlet av M-CSF. Disse resultatene tatt side ved side tyder på at anti-c-fms antistoff fungerer som en terapeutisk å arrestere osteoclastogenesis i TNF-α indusert osteolytic sykdommer på lav konsentrasjon, samtidig denne konsentrasjonen vil spare osteoclast dannelsen av RANKL og M-CSF som vil tillate for bein remodeling oppstår.

Avgjørende skritt i protokollen må utføres nøye for å sikre suksess for eksperimentet. I begynnelsen av protokollen mens dissekere er det viktig å unngå kutte i benet å unngå forurensning i benmargen. Under utpakking benmargen, for å sikre at alle benmargen er hentet, rødme prosedyren skal gjentas behov til alle benmargen er hentet, som gir en høy avkastning av celler. Denne protokollen kan brukes i flere nedstrøms programmer, for eksempel reagens tester, og det gir også en måte som konsentrasjonen av anti-c-fms antistoff kan bli testet unngå av resultatene. Som vi viste, konsentrasjonen av anti-c-fms antistoff som var nødvendig for å hemme osteoclast formasjon er ikke lik blant metodene som osteoklast ble innhentet (RANKL eller TNF-α), dermed alle resultatene som oppnås med hensyn til konsentrasjonen av anti-c-fms har å være nøye undersøkt i fremtiden eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet var støttes delvis av en JSPS KAKENHI grant fra Japan Society for fremme av vitenskap (nr. 16K 11776 H. K., nr. 17K 17306 til K. S., nr 16K 20637 til K. K., nr 16K 20636 til M. S., nr 18K 09862 I. m.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-c-Fms antibody AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)
TNF-α Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.
RANKL PEPROTECH 315-11 Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli
M-CSF Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish.
α-MEM Wako with L-Glutamine and phenol red
Fetal Bovine Serum Biowest s1820-500 Fetal Bovine Serum French Origin
Culture dish Corning 100 mm x 20 mm style dish
96-well plate Thermofischer Scientific Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8 Dojindo, Kumamoto, Japan
Microplate reader Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cell strainer Corning 40 μm Nylon
Centrifuge tube Corning 50 mL CentriStar cap
Triton X-100 Wako Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
  2. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  3. Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).
  4. Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).
  5. Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).
  6. Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).
  7. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  8. Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
  9. Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).
  10. Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).
  11. Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).
  12. Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).
  13. Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).
  14. Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).
  15. Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).
  16. Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).
  17. Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).
  18. Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 145 osteoclast benresorpsjon benmarg macrophage M-CSF RANKL TNF-α anti-c-fms antistoff
Effekten av Anti-c-fms antistoff på Osteoclast formasjon og spredning av Osteoclast forløper In Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida,… More

Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida, M., Shima, K., Kishikawa, A., Ogawa, S., Shen, W. R., Qi, J., Ohori, F., Noguchi, T., Nara, Y., Mizoguchi, I. Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e59089, doi:10.3791/59089 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter