Summary
该方案包括解剖小鼠长骨和骨髓分离, 生成骨髓巨噬细胞, 并产生破骨细胞使用巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF) 和受体激活剂的核因子 Kapa-b 配体 (RANKL) 或肿瘤坏死因子α (tnf-Α) 及其通过抗 c-fms 抗体、M-CSF 受体的抑制。
Abstract
骨重塑是一个复杂的过程, 它涉及到沉积和吸收的时期。骨吸收是一个过程, 通过破骨细胞分解骨, 以响应不同的刺激。破骨体前体分化为多核破骨细胞, 以响应巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF) 和核因子 Kpaba-b 配体 (RANKL) 受体激活剂。在病理条件下, 细胞因子的轮廓是不同的, 涉及炎症细胞因子的混合物。肿瘤坏死因子α (tnf-Α) 是最重要的细胞因子之一, 因为它存在于大量涉及炎症性骨溶解的区域。该协议的目的是提供一种方法, 通过 M-CSF 和 rankl 或 tnf-α诱导, 分离小鼠骨髓产生破骨细胞, 从而通过增加剂量的抗 c-fms 抗体 (受体) 来抑制这种情况。为 M-CSF。本实验重点介绍了抗 c-fms 抗体在炎症性骨吸收疾病中的治疗价值。
Introduction
破骨细胞是高度专业化的细胞, 它们通过多种破骨细胞前体的融合与造血干细胞区分开来。他们是必不可少的健康骨重塑, 并有助于病理骨吸收相关的炎症性骨溶解性疾病, 如类风湿关节炎和牙周病1。
骨细胞形成和破骨细胞功能是由两个关键因素介导的;巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF) 和核因子 kappa-B 配体 (RANKL) 受体激活剂。M-CSF 和 RANKL 对破骨细胞的分化都很重要.另一个已被证明能诱导骨髓巨噬细胞体外形成破骨细胞的因素是肿瘤坏死因子α (tnf-α)3,4,5。tnf-α介导的破骨细胞形成已被证明是破坏性骨溶解的关键, 如类风湿关节炎6, 牙周病 7, 绝经后骨质疏松症 8.
C-fms 是 M-CSF 的膜受体, 它的作用是介导的。c-fms 的作用在文献中得到了很好的记录, 因为它已经证明, 在关节炎模型中以及 tnf-α诱导的骨侵蚀中, 针对 C-fms (c-fms 抗体) 的抗体的给药完全阻止了骨细胞的发生。远离发炎关节的破骨形成仍然是稳健的 9。抗 c-fms 抗体的使用抑制了脂多糖 (LPS) 诱导的破骨细胞形成和骨吸收, 小鼠钙质10以及 lps 诱导的牙周炎模型11.此外, 抗 c-fms 抗体抑制机械应激诱导的牙根吸收在正畸牙齿运动12, 以及正畸牙齿运动和骨吸收与正畸牙齿运动13。
据报道, M-CSF 还具有对宿主免疫反应至关重要的其他功能。细菌性肺炎小鼠缺乏 M-CSF, 导致细菌负担增加, 细菌传播到肝脏, 并伴有14例肝坏死.因此, M-CSF 对免疫反应在预防感染中具有重要意义。
本研究表明了抗 c-fms 抗体对 M-CSF 和 RANKL 或 tnf-α诱导的破骨细胞体外形成和 M-csf 诱导的破骨细胞前体增殖的影响。该方案证明了小鼠骨髓细胞与长骨的分离, 以及生成骨髓巨噬细胞 (BMM) 的步骤, 这些巨噬细胞被认为是破骨细胞的前体, 并通过两个步骤诱导骨髓巨噬细胞分化为多核破骨细胞方法;要么是 RANKL 要么是 tnf α该协议还比较了这两种方法中使用抗 c-fms 抗体的骨细胞生成的抑制情况。
骨髓提取并随后用于产生破骨细胞前体的过程是可靠的, 可以生产大量的纯破骨细胞培养物, 可用于药物检测等多种下游应用。在本协议中, 使用 RANKL 或 tnf-Α诱导破骨细胞生成, 将作为生理过程 (RANKL) 的骨细胞生成与作为病理过程的破骨细胞生成 (tnf-Α) 区分开来, 这反过来又提供了两种替代程序来指导就下游应用中使用的试剂而言, 决定哪一种是优越的。该协议还提供了一种方法, 通过这种方法, 我们可以确定适当的抗 c-fms 抗体浓度, 可以安全地用于以后参与骨吸收和骨溶解疾病的研究。
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Protocol
所有动物程序和动物护理都是按照东北大学的规则和条例进行的。
1. 小鼠下肢解剖及处理
- 解剖前, 根据容器的大小, 在盘子中填充大约50毫升的Α-mL, 并将其放置在冰上。这将作为一个集合容器, 直到所有骨骼的解剖完成。在这一实验和随后的实验中, 使用α-mem, 其中含有10% 的胎牛血清 (FBS)、100 uuml 青霉素 g 和100μgml 链霉素。
- 吸入过量5% 异氟醚对 C57blse-6j 小鼠进行安乐死。
- 使用刺穿手掌和脚部的针脚将鼠标固定在仰角位置, 并用70% 的乙醇彻底喷洒。
- 在臀部的水平上使用无菌手术剪刀和推子做皮肤切口, 并将其延伸到露出肌肉的脚。
- 将肌腱连接到股四头肌和将腿筋肌肉连接到骨骼上的肌腱。剥去肌肉露出髋关节和膝关节。找到这些肌腱将轻松地将两个肌肉从其附件中释放, 而无需留下软组织标签。不要切入骨头。
- 将剪刀放置在股骨头部和关节空间之间, 切入其中释放股骨, 但保持骨骼完整。这将使骨骼脱离, 而不会暴露骨髓的风险。
- 同样, 切断连接在胫骨上的肌肉。切断胫骨, 使其在踝关节的附着物失去, 保持骨骼完整, 以避免污染。
- 使用剪刀刀片和金巾从股骨和胫骨中刮掉任何剩余的软组织, 并将其放入盘子中, 并将α-mem 放在冰上。
2. 小鼠下肢骨髓分离
- 用Α-mem 填充 30 G 针头注射器。
- 断开胫骨和股骨与膝关节的连接。
- 用剪刀把长骨头的两端从两边剪下来。
- 用推拿器将从轴上取出骨头, 将针头插入骨髓空间, 然后将骨髓的含量慢慢冲洗成6厘米的培养盘。骨头将出现白色, 表明提取所有骨髓的内容。对所有骨骼重复此操作。
- 使用40μm 尼龙电池过滤器将骨髓提取物滤入50毫升锥形离心管, 并以 300 x g的速度将离心机滤入其中5分钟。
- 丢弃上清液, 用α-mL 的5毫升清洗, 以 300 x g 清洗5分钟的离心机. 重复清洗共2次。
-
在Α-mL 的10毫升中重新注入颗粒, 并使用血细胞计进行细胞计数, 如下所示:
- 在 1.5 mL 管和移液器中加入10μl 的细胞悬浮液, 使细胞悬浮液加入10μl 的溶液-l, 达到0.4% 的色氨蓝色10Μl。
- 用滑盖覆盖血细胞仪室, 并将染料悬浮液转移到血细胞仪上。重要的是不要过度填充或填充腔, 并允许悬浮液填补腔内的毛细管作用。
- 将血细胞仪放在显微镜下的舞台上。使用10倍的目标, 将重点放在中心正方形上。对由3行绑定的所有单元格进行计数。若要确保单元格不被计数两次, 请计算每个正方形的上角和右角。死的单元格将显示为深蓝色, 这些单元格将从计数中排除。
- 根据下游的应用, 将细胞播种到适当的培养容器中。对于此特定实验, 请按照第3节操作。
3. BMM 的生成
- 种子 1 x 10 7 cellsss\ 10 ml 在一个10厘米培养皿中, 并加入 m-csf 100 Ng/ml。M-CSF 的最终浓度为培养基 100 ngml。在 37°c, 5% co2下培养3天。
- 3天后, 取出培养基, 用10毫升的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 大力清洗细胞, 两次去除非粘附性细胞, 在 PBS 中加入室温0.02% 的胰蛋白酶-edta, 在37°c 孵育 5% co 2 5分钟.
- 通过彻底移液分离细胞。通过观察显微镜下的培养物, 确保细胞已被分离 (细胞应呈圆形, 并在介质中漂浮)。如果细胞仍然连接, 则彻底重复移液以分离它们。当细胞被分离后, 加入5毫升的Α-mL 来灭活反应。
- 将细胞收集到一个50毫升的锥形管和离心机在 300 x g下 5分钟, 丢弃上清液, 并用Α-mL 的5毫升清洗。
- 以 300 x g离心 5分钟, 并在Α-mL 的10毫升中重新悬浮颗粒。
- 按照步骤2.7.1 中所述执行单元格计数。
- 种子 1 x 10 6 细胞在一个10厘米培养皿中, 加入 m-csf 100 Ng/ml。M-CSF 的最终浓度为培养基 100 ngml。在 37°c, 5% co2下培养3天。
4. BMM 成骨细胞前体的生成
- 3天后, 按照步骤 3.2-3.7, 收获作为破骨细胞前体的附骨细胞。
- 种子 BMM 在 5x104细胞200Μl 的α-mem 在96井板。添加 RANKL 的最终浓度为 50 ngml 或 TNF-α, 最终浓度为 100 Ng/ml。添加 M-CSF, 使每口井的最终浓度为 100 ngml。
- 在每口井加入抗 c-fms 抗体 (最终浓度为0、1、10、100、1000 ngml)。
- 在37°c 下孵化, 5% CO2 , 为期4天。在4天内每隔一天更改媒体。
5. 耐酒石酸磷酸酶 (TRAP) 染色
- 孵育4天后, 轻轻吸吸每口井的培养基。用200Μl 室温 1x PBS 清洗每口井一次。
- 在每口井中加入 200μl 10% 福尔拉林, 用于固定, 并在室温下孵育1小时。吸收福尔拉林, 用去离子水清洗每口井3次。
- 在 PBS 中添加 200μl 0.2% Triton X-100, 在每口井中进行渗透, 并在室温下孵育1小时。吸走 Triton X-100, 用去离子水清洗每口井3次。
- 在每口井中加入200Μl 的 TRAP 染色溶液。在显微镜下观察污渍。染色需要10-30 才能正常发育。
- 吸色污渍, 用去离子水清洗每口井 3次, 空气干燥。保持室温下使用, 以便进一步观察。
6. 扩散检测
- 种子 BMM 作为破骨细胞前体在 5 x10 3 细胞200μl 的Α-mem 在96井板。添加 M-CSF, 使每口井的最终浓度为 100 ngml。
- 加入抗 c-fms 抗体 (最终浓度为0、1、10、100、1, 000 Ng/ml), 在37°c、5% co2下孵育 3天, 无介质变化。
- 3天后, 用 1x PBS 清洗细胞。在每口井中加入100Μl 的Α-mem。
- 加入10Μl 的细胞计数试剂盒溶液, 在37°c 孵育, 5% CO2 2小时, 并使用微板读取器确定每口井在450纳米的吸收率。
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Representative Results
本方案的目的是评估抗 c-fms 抗体在 RANKL 或 TNF-α存在的情况下对破骨细胞形成的影响, 并确定 M-CSF 对破骨细胞前体增殖的影响。在这个协议中, 我们提供了一个可靠的过程, 通过这个过程产生大量的纯破骨细胞培养物。我们还提供了一种方法, 测试抗 c-fms 抗体的合适浓度, 以抑制破骨细胞的形成在不同的培养条件下。
图 1显示了 M-CSF + rankl 具有抗 fms 抗体的破骨细胞的形成。在 1, 10 ngml 抗 c-fms 抗体时, 破骨细胞的数量与对照组相比没有明显下降 (0 ng/mL)。虽然在 100, 000 纳克抗 c-fms 抗体, 但与对照相比, 破骨细胞的数量显著减少。图 2显示了具有抗 C-FMS 抗体的 M-csf + TNF-α培养中的破骨细胞形成。在 1 ngml 抗 c-fms 抗体中, 破骨细胞的数量与对照相比没有明显下降 (0 ng/mL)。而在 10, 100, 1, 000 ngml 抗 c-fms 抗体时, 破骨细胞的数量与对照相比显著减少。
用 M-CSF + 抗 c-fms 抗体培养成骨细胞前体如图 3所示。在 1, 10, 100 ngml 时, 破骨细胞前体的数量与对照相比没有明显减少 (0 ng/mL), 而在 1, 000 Ng/ml, 与对照相比, 破骨细胞前体的数量显著减少。这表明, 需要高达 1, 000 ngml 的浓度来显著抑制破骨细胞前体的增殖。
这些结果提供了关于 RANKL 在生产破骨细胞方面的鲁棒性的信息, 同时使用了 50 NGML 的 rankl 浓度, 需要 100 ngml 的 tnf-Α浓度才能获得相同数量的破骨细胞。这两种方法都适用于破骨细胞的生成, 但其决定的优越性取决于下游应用的背景下的试剂将在以后使用。结果表明, 使用 RANKL 并不等同于使用 tnf-Α生成破骨细胞。
在该协议中, 我们使用抗 c-fms 抗体来抑制破骨细胞生成, 并通过观察结果, 我们发现需要 100 Ng\ ml 的抗 c-fms 抗体浓度, 以显著降低 RANKWELL l 中的破骨细胞数量。在 MCSF 增殖试验中, 需要 1, 000 ngml 的抗 c-fms 抗体浓度来抑制破骨细胞前体增殖, 而只有 10 ngml 的抗 fms 抗体浓度需要浓度, 才能显著降低破骨细胞的含量tnf α井中的数。
图 1: 抗 c-fms 抗体对 rankl 诱导的破骨细胞形成的影响.用 M-CSF、RANKL 和各种剂量的抗 c-fms 抗体 (0、1、10、100和 1, 000 Ng/ml) 对破骨细胞前体进行4天的显微观察。用 TRAP 染色固定细胞并染色。用 M-CSF、RANKL 和各种浓度的抗 c-fms 抗体 (0、1、10、100和 1, 000 Ng/ml) 培养4天的 trap 阳性细胞的数量。用 TRAP 染色固定细胞并染色。评估了 trap 阳性细胞的数量。结果表示为四种培养物的平均值± sd。通过舍夫的测试检测到统计差异 (n = 4;*p < 0.01)。刻度条 = 200μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 抗 c-fms 抗体对 Tnf-α诱导的破骨细胞形成的影响.用 M-CSF、tnf-Α和各种剂量的抗 c-fms 抗体 (0、1、10、100和 1, 000 Ng/ml) 对破骨细胞前体进行4天的显微观察。用 TRAP 染色固定细胞并染色。用 M-CSF、tnf-Α和各种浓度的抗 c-fms 抗体 (0、1、10、100和 1, 000 Ng/ml) 培养4天的 trap 阳性细胞的数量。用 TRAP 染色固定细胞并染色。评估了 trap 阳性细胞的数量。结果表示为四种培养物的平均±sd.。通过舍夫的测试检测到统计差异 (n = 4;*p < 0.01)。刻度条 = 200μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 抗 c-fms 抗体对破骨细胞前体增殖的影响.用 M-CSF 和各种剂量的抗 c-fms 抗体 (0、1、10、100和 1, 000 Ng/ml) 治疗的破骨细胞前体的细胞活力为3天。细胞计数 kit-8 被用来测量活力。数据以百分比的形式提供, 比较了含有 M-CSF + 抗 c-fms 的井与仅含有 M-CSF 的井的相对活性, 并以四种培养物的均值± s. d. 表示。通过舍夫的测试检测到统计差异 (n = 4;*p < 0.01)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在本研究中, 我们研究了抗 c-fms 抗体对 rankl 诱导的破骨细胞形成、tnf-α诱导的破骨细胞形成和 M-csf 诱导的破骨细胞前体增殖的影响。我们发现, 抗 c-fms 抗体的有效量抑制破骨细胞形成 rankl 诱导的破骨细胞形成, tnf-Α诱导的破骨细胞形成和 M-csf 诱导的破骨细胞前体增殖是不同的。
rankl 在 m-csf 存在的情况下进行体外的破骨细胞生成, 而 rank-空鼠由于破骨细胞发育失败而经历严重的骨质疏松症,因此 rankl 是破骨细胞生成的强制性细胞因子, 并且具有在骨骼稳态中的重要调节作用。因此, 如果可以控制 rankl 诱导的破骨细胞形成, 就可以控制骨量的减少。但是, 如果发生过度抑制, 骨稳态将无法维持。在本实验中, 我们表明, 抗 c-fms 抗体需要在高浓度 100 ng/mL, 以减少破骨细胞的形成 rankl。
tnf-α介导的破骨细胞形成已被证明是在破坏性骨疾病的骨溶解至关重要的, 如类风湿关节炎6, 牙周病7 和绝经后骨质疏松症 8 , 在这里我们表明, 抗 c-fms抗体可以很容易地抑制由 tnf-Α介导的破骨细胞形成, 浓度较低, 浓度为 10 ngml。结果表明, 低浓度的抗 fms 抗体在病理条件下降低骨细胞生成过程, 但对正常条件下骨细胞生成的影响最小, 具有治疗价值。
M-CSF 是破骨细胞形成的关键因素, 因为由于完全缺乏破骨细胞 16, 缺乏 csf1 的 m-csf 基因编码显示出骨质疏松表型. M-CSF 还促进破骨细胞前体的存活 2。患有严重强直性脊柱炎17的类风湿关节炎患者的血清中 M-CSF 水平升高,松关节假体周围的滑膜液中的 m-csf水平增加 18。tnf α增加了体内破骨细胞前体的数量, 这是诱导 M-CSF 基因在基质细胞 9中表达的结果。根据这些数据, 我们可以得出结论, M-CSF 是炎症的重要中介, 因为 tnf-Α对基质细胞的影响导致 M-CSF 从这些细胞产生的增加。
据报道, M-CSF 在14岁肺炎期间肺和肝单核吞噬细胞的抗菌功能等宿主免疫反应中发挥着重要作用.因此, 如果发生过度抑制 M-CSF, 免疫反应有可能减少。在这个实验中, 我们表明, 需要一个非常高浓度的抗 c-fms 抗体 (1000 ng/mL), 以抑制破骨细胞前体的生存和增殖介导的 M-CSF。这些结果并排表明, 抗 c-fms 抗体可能作为一种治疗药物, 以抑制骨细胞分裂发生在 tnf-α诱导的低浓度的骨溶解性疾病, 同时这种浓度将节省破骨细胞的形成诱导RANKL 和 M-CSF, 这将允许进行骨重塑。
协议中的关键步骤必须小心执行, 以确保实验的成功。在协议的开始, 在解剖的时候, 重要的是要避免切割到骨头, 以避免对骨髓的污染。在提取骨髓的过程中, 为了确保所有骨髓都被提取出来, 应重复冲洗过程, 直到所有骨髓都被提取出来, 这将提供高产量的细胞。该协议可用于试剂检测等多个下游应用, 也提供了一种检测抗 c-fms 抗体浓度的方法, 避免对结果的错误解释。正如我们所表明的, 抑制破骨细胞形成所需的抗 c-fms 抗体的浓度在获得破骨细胞的方法 (RANKL 或 TNF-α) 中并不相等, 因此在抗 c-fms 浓度方面获得的任何结果都是不相等的。在未来的实验中进行仔细的检查。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了日本科学促进会 JPS KAKENHI 赠款的部分支持 (编号). 16K11776 至 H. k., No. 17K17306 至 K. s., No. 16K11776 至 k., No. 16K11776 至 M. s., No. 18K09862 至 i. m.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
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