Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ההשפעה של נוגדן Anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט והתפשטות של קודמן אוסטאוקלסט במבחנה

Published: March 18, 2019 doi: 10.3791/59089
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Department of Translational Medicine, Tohoku University Graduate School of Dentistry

Summary

פרוטוקול זה כולל ניתוח של עצמות ארוכות מאתר ובידוד מח עצם, ליצור מקרופאגים מח העצם ולייצר osteoclasts באמצעות המושבה מקרופאג מגרה פקטור (M-CSF), מפעיל קולטן של גרעיני גורם Kappa-B ליגנד (רנקל) או הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNF-α) ועל המעצר על ידי נוגדנים anti-c-fms, קולטן M-CSF.

Abstract

עצם שיפוץ הוא תהליך מורכב, זה כולל תקופות של התצהיר, ספיגת. ספיגת עצם הוא תהליך שבו עצם מתפרק על ידי osteoclasts בתגובה לגירויים שונים. אוסטאוקלסט מבשרי להתמיין osteoclasts multinuclear בתגובה המושבה מקרופאג מגרה פקטור (M-CSF), מפעיל קולטן של גרעיני גורם Kappa-B ליגנד (רנקל). בתנאים פיפטות, לפרופיל ציטוקינים שונים, כולל תערובת של ציטוקינים דלקתיים. הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNF-α) הוא אחד ציטוקינים החשוב ביותר כאשר הוא נמצא בכמויות גדולות באזורים מעורבים עם osteolysis דלקתיות. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה שבאמצעותה מח עצם מאתר מבודד כדי להפיק osteoclasts דרך אינדוקציה עם M-CSF רנקל או TNF-α אשר להיות מעוכבים לאחר מכן על ידי הגדלת מינון של נוגדן anti-c-fms, הקולטן עבור M-CSF. ניסוי זה מדגיש את הערך הטיפולי של נוגדן anti-c-fms במחלות של ספיגת עצם דלקתיות.

Introduction

Osteoclasts הם תאים מאוד מיוחדים, הם להבדיל מתאי גזע hematopoietic באמצעות היתוך גרעיני של מבשרי אוסטאוקלסט מרובים. הם חיוניים עבור עצם בריאה שיפוץ ולתרום ספיגת עצם פיפטות הקשורים במחלות דלקתיות osteolytic כגון דלקת מפרקים שגרונית, מחלת חניכיים1.

Osteoclastogenesis ואוסטאוקלסט הם מתווכת על-ידי שני גורמים מרכזיים; מקרופאג המושבה מגרה פקטור (M-CSF), מפעיל קולטן של גרעיני גורם kappa-B ליגנד (רנקל). M-CSF והן רנקל חשובים עבור אוסטאוקלסט בידול2. גורם נוסף אשר הוכח לגרום אוסטאוקלסט היווצרות של מח העצם מקרופאגים במבחנה הוא הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNF-α)3,4,5. TNF-α אוסטאוקלסט בתיווך היווצרות הוכח להיות קריטי עבור osteolysis עצם הרסני מחלות כגון דלקת מפרקים שגרונית6, מחלת חניכיים7באוסטיאופורוזיס בגיל המעבר8.

C-fms הקולטן ממברנה של M-CSF, ומתווך הפעולה שלה. התפקיד של c-fms מתועד היטב בספרות כפי הוכח כי הממשל של נוגדן נגד c-fms (נוגדן anti-c-fms) לחלוטין נעצר osteoclastogenesis במודל דלקת מפרקים, כמו גם ב- TNF-α המושרה ארוזיות העצם בזמן osteoclastogenesis מרוחק מן המפרק מודלק היה עדיין חזקים9. ניהול של נוגדן anti-c-fms עכבות היווצרות אוסטאוקלסט ספיגת עצם המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS) העכבר calvariae10 באותה מידה כמו חניכיים LPS-induced דגם11. יתר על כן, נוגדן anti-c-fms עכבות ספיגת השורש מפגינות מכני במהלך התנועה השן אורתודונטי12, כמו גם תנועת השן אורתודונטי, ספיגת עצם המזוהים עם תנועת השן אורתודונטי13.

M-CSF דווח שיש פונקציות אחרות החיוניות על התגובה החיסונית של המארח. העדר של M-CSF בעכברים op/המבצע עם דלקת ריאות חיידקית להוביל והגדלת הנטל חיידקי והפצה בקטריאלי בכבד עם נמק בכבד14. לכן, M-CSF הוא חשוב עבור תגובה חיסונית בהגנה מפני הידבקות.

מחקר זה מדגים ההשפעה של נוגדן anti-c-fms על M-CSF ו רנקל או TNF-α המושרה אוסטאוקלסט היווצרות במבחנה ו M-CSF המושרה התפשטות אוסטאוקלסט סימנים מקדימים. פרוטוקול זה מדגים את ניתוקה של תאים במח העצם מאתר עצמות ארוכות, ואת השלבים ליצירת מח עצם מקרופאגים (BMM) אשר נחשבים אוסטאוקלסט מבשרי, כדי לעודד את הבידול של BMM לתוך multinuclear osteoclasts על ידי שניים שיטות; רנקל או TNF-α. הפרוטוקול משווה גם מעצרו של osteoclastogenesis של שתי השיטות באמצעות נוגדן anti-c-fms.

התהליך שבאמצעותו הוא במח העצם חילוצם ואופן השימוש בהם לאחר מכן ליצור סימנים מקדימים אוסטאוקלסט הוא אמין לייצר כמויות גדולות של תרבויות אוסטאוקלסט טהור, אשר ניתן להשתמש ביישומים במורד הזרם מרובות כגון בדיקות סמים. השימוש רנקל או TNF-α כדי לגרום osteoclastogenesis של פרוטוקול זה מבדיל osteoclastogenesis כתהליך הפיזיולוגיות (רנקל) מ- osteoclastogenesis כתהליך פיפטות (TNF-α), אשר בתורו מספק שני הליכים חלופיים כדי להנחות ההחלטה אשר אחד עדיפה מבחינת ריאגנטים ביישומים במורד הזרם. פרוטוקול זה מספק גם שיטה שבאמצעותה אנו יכולים לקבוע ריכוז מתאים של נוגדן anti-c-fms שיכול לשמש בבטחה ללימודים מאוחר יותר מעורב ספיגת עצם ומחלות osteolytic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים, טיפול בבעלי חיים בוצעו על פי אוניברסיטת Tohoku חוקים ותקנות.

1. מאתר Hindlimb ניתוח וטיפול

  1. לפני ניתוח, למלא צלחת עם-50 מ של α-מ בהתאם לגודל המכולה ומניחים אותו על קרח. זה ישמש כגורם מכיל אוסף עד להשלמת ניתוח שכל העצמות. בשביל זה ובעקבות ניסויים, השתמש α-מ המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS), 100 IU/mL פניצילין G, סטרפטומיצין μg/mL 100.
  2. המתת חסד C57Bl/6J העכבר על ידי שאיפה של מנת יתר של 5% איזופלוריין.
  3. לתקן את העכבר במצב פרקדן באמצעות סיכות חדרה מבעד כפות הידיים, הרגליים ואת תרסיס ביסודיות עם 70% אתנול.
  4. עושים חתך בעור באמצעות פינצטה ומספריים כירורגי סטרילי ברמה של הירך ותעלה עד כפות הרגליים לחשוף את השרירים.
  5. חתך הגיד הצמדת את השריר הארבע ראשי והוא הגיד הצמדת שריר שריר הירך עד העצם. לקלף את השרירים חשיפת המפרקים הירך והברך. איתור גידים אלו תקל על פינוי שני השרירים ההחזקות שלהם מבלי להשאיר תגיות רקמות רכות. Not גזור לתוך העצם.
  6. מקם את המספריים בין הראש של עצם הירך לבין המרחב המשותף וחותכים בעניין פינוי עצם הירך אבל שמירה על העצם ללא פגע. זה יאפשר ניתוק של עצמות ללא הסיכון של חשיפת מח העצם.
  7. באופן דומה לחתוך את השרירים הצמדת עצם השוקה. חותכים בשוקיים נטול הקשר שלה המשותפת הקרסול לשמור את העצם שלם כדי למנוע זיהום.
  8. לגרד כל רקמות רכות שנותרו מן הירך שוקה באמצעות להבי מספריים kimwipe ומניחים אותו בתוך צלחת עם דגש על הקרח α-הגברת.

2. מאתר Hindlimb מח עצם בידוד

  1. ממלאים מזרק המחט 30 G α-מ.
  2. נתק את שוקה הירך מן הברך.
  3. חותכים את הקצוות של עצם ארוך משני הצדדים באמצעות מספריים.
  4. להחזיק את העצם מן הפיר באמצעות פינצטה, להכניס את המחט מח עצם ו לאט לרוקן את התוכן של מח לתוך תבשיל תרבות 6 ס מ. העצם יופיע לבן, המציין את החילוץ של כל התוכן מח עצם. חזור על כל העצמות.
  5. זן מח העצם לחלץ באמצעות מסננת תא 40 μm ניילון לתוך צינור חרוטי צנטריפוגה 50 מ ל צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות.
  6. למחוק את תגובת שיקוע לשטוף עם 5 מ של α-מ, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דק חוזר לשטיפת בסך 2 פעמים.
  7. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של α-מ ולבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer כפי שמוצג להלן:
    1. לגרום לדילול 1:1 של התא השעיה על-ידי הוספת 10 μL של השעיה תא μL 10 של 0.4% trypan כחול צינור 1.5 mL, פיפטה פעם אחת.
    2. מכסה תא hemocytometer עם כיסוי שקופיות, להעביר את המתלים לצבוע hemocytometer. חשוב אל תמלא יותר מדי או underfill התא ולאפשר את המתלים למלא את החדר על ידי נימיות.
    3. מניחים את hemocytometer על שלב מיקרוסקופ. באמצעות המטרה x 10, מתמקדים מרכז הריבוע. לספור את כל התאים מחויב על ידי 3 שורות. כדי לוודא כי התאים אינם נספרים פעמיים, לספור את הפינות העליונות וימינה של כל ריבוע. תאים מתים יופיעו כחול כהה, אלה אינם נכללים בספירה.
  8. בהתאם ליישום במורד הזרם, זרע את התאים לתוך כלי קיבול תרבות מתאימה. עבור ניסוי מסוים זה, בצע את סעיף 3.

3. הדור של BMM

  1. זרע עונה 1 פרק 10-7 תאים/10 מ ל 10 ס מ תרבות מאכל ולהוסיף 100 מ'-CSF ng/mL. הריכוז הסופי של M-CSF הוא 100 ננוגרם למ"ל של תרבות בינוני. דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 3 ימים.
  2. לאחר 3 ימים, להסיר את המדיום תרבות, לשטוף את התאים נמרצות עם 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) פעמיים כדי להסיר תאים שאינם מחסידי, הוסף 5 מ של טמפרטורת החדר 0.02% טריפסין-EDTA ב- PBS, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 5 דקות.
  3. ניתוק התאים על ידי pipetting יסודית. ודא כי התאים יש כבר מנותק על ידי התבוננות התרבות תחת מיקרוסקופ (התאים צריכים להופיע מעוגל, צף בתקשורת). אם התאים יישארו מצורפים, חזור pipetting ביסודיות כדי לנתק אותם. כאשר התאים יש כבר מנותק, הוסף 5 מ של α-מ כדי להשבית את התגובה.
  4. לאסוף את התאים לתוך צינור חרוטי 50 מ ל צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דק. להשליך תגובת שיקוע, לשטוף עם 5 מ של α-מ.
  5. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות, resuspend בגדר ב 10 מ"ל של α-מ.
  6. לבצע ספירת תאים כאמור שמתואר בשלב 2.7.1.
  7. זרע עונה 1 פרק 10-6 תאים/10 מ ל 10 ס מ תרבות מאכל ולהוסיף 100 מ'-CSF ng/mL. הריכוז הסופי של M-CSF הוא 100 ננוגרם למ"ל של תרבות בינוני. דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 3 ימים.

4. דור של Osteoclasts מ BMM כמו סימנים מקדימים אוסטאוקלסט

  1. לאחר 3 ימים, לקצור את התאים המצורפת אשר יוגדרו BMM אוסטאוקלסט מבשרי, בעקבות צעדים 3.2-3.7.
  2. BMM הזרע ב 5 x 104 תאים/200 μL של α-מ בצלחת טוב 96. מוסיפים רנקל ריכוז סופי של 50 ng/mL או TNF-α עבור ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ"ל. להוסיף M-CSF עבור ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ"ל מכל קידוח.
  3. הוספת נוגדן anti-c-fms (ריכוזים הסופי של 0, 1, 10, 100, 1000 ננוגרם למ"ל) כדי מכל קידוח.
  4. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 4 ימים. לשנות מדיה בכל יום אחר ארבעה ימים.

5. כתם פוספטאז חומצה tartrate עמידים (השמנה)

  1. לאחר 4 ימי דגירה, בעדינות תשאף המדיום התרבות של כל טוב. לשטוף טוב פעם אחת עם μL 200 ל- PBS 1 x בטמפרטורת החדר.
  2. להוסיף 200 μL של פורמלין 10% מכל קידוח עבור קיבעון, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר. האחות של פורמלין, לשטוף כל טוב 3 פעמים עם מים יונים.
  3. להוסיף 200 μL של 0.2% טריטון X-100 ב- PBS לכל. ובכן permeabilization ואת תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר. האחות X-100 את טריטון, לשטוף כל טוב 3 פעמים עם מים יונים.
  4. להוסיף 200 μL של מלכודת הכתם פתרון טוב לכל. דמיינו את הכתם. מתחת למיקרוסקופ. זה ייקח בין 10-30 דקות על הכתם להתפתח כראוי.
  5. וארוקן את הכתם ואת שטיפת כל טוב עם מים יונים 3 פעמים, ואני אוויר יבש. לשמור בטמפרטורת החדר, כדי להשתמש בהתבוננות נוספת.

6. התפשטות Assay

  1. BMM הזרע כמו אוסטאוקלסט מבשרי ב 5 x 103 תאים/200 μL של α-מ בצלחת טוב 96. להוסיף M-CSF עבור ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ"ל מכל קידוח.
  2. הוספת נוגדן anti-c-fms (ריכוזים הסופי של 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 3 ימים ללא שינוי בינוני.
  3. לאחר 3 ימים, לשטוף את התאים עם 1 x PBS. להוסיף 100 μL של α-מ מכל קידוח.
  4. להוסיף 10 μL של התא סופר קיט פתרון, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ב 2 h ולקבוע את ספיגת של כל טוב ב-450 nm באמצעות קורא microplate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של נוגדן anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט בנוכחות רנקל או TNF-α, וכדי לקבוע את ההשפעה של M-CSF על התפשטות מבשרי אוסטאוקלסט. ב פרוטוקול זה, סיפקנו אמין תהליך שבו נוצרות כמויות גדולות של תרבויות אוסטאוקלסט טהור. גם סיפקנו דרך לבדוק נוגדן anti-c-fms ריכוז מתאים עבור עיכוב היווצרות אוסטאוקלסט בתנאים תרבות אחרת.

היווצרות אוסטאוקלסט ב- M-CSF + רנקל תרבות עם נוגדן anti-c-fms מוצג באיור1. ב- 1, 10 נוגדן anti-c-fms ננוגרם למ"ל, הייתה ירידה משמעותית במספר של osteoclasts לעומת שליטה (0 ng/mL). בעוד כשהמספר הוא 100, 1000 נוגדן anti-c-fms ng, חלה ירידה משמעותית במספר של osteoclasts לעומת שליטה. היווצרות אוסטאוקלסט בתרבות M-CSF + TNF-α עם נוגדן anti-c-fms מוצג באיור2. ב- ng/mL 1 נוגדן anti-c-fms, היתה ירידה משמעותית במספר של osteoclasts לעומת שליטה (0 ng/mL). כאשר 10, 100, 1000 ננוגרם למ"ל נוגדן anti-c-fms, חלה ירידה משמעותית במספר של osteoclasts לעומת שליטה.

אוסטאוקלסט מבשרי תרבות עם נוגדן M-CSF + אנטי-c-fms מוצג באיור3. 1, 10, 100 ננוגרם למ"ל, הייתה ירידה משמעותית במספר סימנים מקדימים אוסטאוקלסט לעומת שליטה (0 ng/mL), ואילו ב 1,000 ng/mL, הייתה ירידה משמעותית במספר סימנים מקדימים אוסטאוקלסט לעומת שליטה. אפשרות זו מציינת כי ריכוז גבוה כמו 1,000 ng/mL יש צורך לעכב את התפשטות אוסטאוקלסט מבשרי באופן משמעותי.

תוצאות אלו לספק מידע אודות הטבע חזקים של רנקל בהפקת osteoclasts תוך ריכוז של 50 ננוגרם למ"ל של רנקל שימש, ריכוז של 100 ננוגרם למ"ל של TNF-α נחוץ כדי להשיג את אותו מספר של osteoclasts. שתי השיטות הללו מתאימים לדור אוסטאוקלסט אבל ההחלטה אשר עדיפה תלוי ביישום במורד הזרם בהקשר של ריאגנטים לשימוש מאוחר יותר. כפי התוצאות מצביעות על, באמצעות רנקל אינה המקבילה של שימוש TNF-α ליצירת osteoclasts.

ב פרוטוקול זה, השתמשנו נוגדן anti-c-fms לעכב osteoclastogenesis, לפי התוצאות, נמצא כי ריכוז של 100 ננוגרם למ"ל של נוגדן anti-c-fms נחוץ כדי לייצר ירידה משמעותית במספר אוסטאוקלסט בבארות רנקל. ריכוז של 1000 ננוגרם למ"ל של נוגדן anti-c-fms נחוץ כדי לעכב את התפשטות קודמן אוסטאוקלסט ב MCSF assay התפשטות, תוך ריכוז רק 10 ננוגרם למ"ל של נוגדן anti-c-fms נחוץ כדי לייצר שינוי משמעותי בירידה אוסטאוקלסט מספר בבארות TNF-α.

Figure 1
איור 1: ההשפעה של נוגדן anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט רנקל-induced. תצפית מיקרוסקופית של מבשרי אוסטאוקלסט שטופלו M-CSF, רנקל והמנה שונים של נוגדנים אנטי-c-fms (0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) ארבעה ימים. התאים היו קבועים, מוכתם מלכודת מכתים. מספר התאים השמנה-חיוביות תרבותי עם M-CSF, רנקל, ריכוזים שונים של נוגדנים אנטי-c-fms (0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) ארבעה ימים. התאים היו קבועים, מוכתם מלכודת מכתים. מספר התאים השמנה-חיובי הוערך. התוצאות היו לבטא זאת אומרת ± ש של ארבע תרבויות. הבדלים סטטיסטיים אותרו באמצעות הבדיקות של Scheffe (n = 4; * p < 0.01). גודל ברים = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: השפעת נוגדן anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט TNF-α-induced. תצפית מיקרוסקופית של מבשרי אוסטאוקלסט שטופלו M-CSF, TNF-α ומנה שונים של נוגדנים אנטי-c-fms (0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) ארבעה ימים. התאים היו קבועים, מוכתם מלכודת מכתים. מספר התאים השמנה-חיוביות תרבותי עם M-CSF, TNF-α, ריכוזים שונים של נוגדנים אנטי-c-fms (0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) ארבעה ימים. התאים היו קבועים, מוכתם מלכודת מכתים. מספר התאים השמנה-חיובי הוערך. התוצאות היו המבוטא meanv ± ש של ארבע תרבויות. הבדלים סטטיסטיים אותרו באמצעות הבדיקות של Scheffe (n = 4; * p < 0.01). גודל ברים = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: השפעת נוגדן anti-c-fms על התפשטות של קודמן אוסטאוקלסט. תא הכדאיות של מבשרי אוסטאוקלסט שטופלו M-CSF והמנה שונים של נוגדנים אנטי-c-fms (0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) למשך 3 ימים. תא סופר קיט-8 שימש כדי למדוד את הכדאיות. הנתונים מוצגים באחוזים כדי להשוות את הפעילות היחסית של הבארות המכיל M-CSF + אנטי-c-fms לעומת הבארות המכיל M-CSF לבד, ביטוי כמו מתכוון ± ש של ארבע תרבויות. הבדלים סטטיסטיים אותרו באמצעות הבדיקות של Scheffe (n = 4; * p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, חקרנו את ההשפעה של נוגדן anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט רנקל-induced, TNF-α-induced אוסטאוקלסט היווצרות והתפשטות קודמן אוסטאוקלסט M-CSF-induced. מצאנו כי כמות נוגדנים anti-c-fms עבור עיכוב של osteoclastogenesis בין היווצרות אוסטאוקלסט רנקל-induced, TNF-α המושרה אוסטאוקלסט היווצרות ו- M-CSF-induced התפשטות אוסטאוקלסט מבשרי יעיל הוא שונה.

רנקל שמתווכת osteoclastogenesis בנוכחות M-CSF במבחנה, ולחוות דרגה-null עכברים osteopetrosis חמורה עקב הכשל של osteoclasts לפתח15, ובכך רנקל ציטוקין חובה עבור osteoclastogenesis ויש לו תפקיד רגולטורי חשוב עצם הומאוסטזיס. לכן, אם יכול להיות נשלט אוסטאוקלסט רנקל-induced היווצרות, הירידה בתוך עצם יכול להיות נשלט מסה. עם זאת, אם מתרחשת דיכוי מופרז, הומאוסטזיס עצם לא ישמר. בניסוי זה, אנו מראים שנוגדן anti-c-fms הזה צריך להיות ריכוז גבוה 100 ננוגרם למ"ל יוכלו להקטין את היווצרות אוסטאוקלסט שנגזרות רנקל.

TNF-α אוסטאוקלסט בתיווך היווצרות הוכח להיות קריטי עבור osteolysis ב הרסניים בעצמות מחלות כגון דלקת מפרקים שגרונית6, מחלת חניכיים7ו באוסטיאופורוזיס בגיל המעבר8 ועל הנה אנחנו מראים את האנטי-c-fms נוגדן בקלות יכול לעכב היווצרות אוסטאוקלסט מתווכת על-ידי TNF-α-ריכוז נמוך של 10 ng/mL. התוצאה מרמזת כי ריכוז נמוך של נוגדן anti-c-fms יכול להיות בעל ערך טיפולי כדי להקטין את התהליך של osteoclastogenesis בתנאים פיפטות אבל תהיה השפעה מינימלית על osteoclastogenesis בתנאים נורמליים.

M-CSF הוא גורם מפתח עבור אוסטאוקלסט היווצרות כמו עכברים op/אופ שחסרה Csf1 הגן קידוד M-CSF הצגה של פנוטיפ osteopetrotic בשל העדר מוחלט של osteoclasts16. M-CSF גם מקדם ההישרדות של סימנים מקדימים אוסטאוקלסט2. M-CSF רמות הוגדלה בהסרום של חולים עם דלקת מפרקים שגרונית, שיש להם חמור ספונדיליטיס ספונדיליטיס17 וב -הנוזל synovial סביב תותבת משותפת רופף18. TNF-α מגבירה את מספר אוסטאוקלסט מבשרי ויוו בשל גרימת ביטוי גנים M-CSF תאי סטרומה9. לאור נתונים אלו ניתן להסיק כי M-CSF הוא מתווך חשוב של דלקת עקב ההשפעה של TNF-α בתאי סטרומה אשר גורמת לעלייה בייצור M-CSF של תאים אלה.

בעבר דווח כי M-CSF ממלא תפקיד חשוב בתגובה החיסונית מארח כגון פונקציות מיקרוביאלית של phagocytes תאי הריאות והכבד במהלך דלקת ריאות14. לכן, אם דיכוי יתר של M-CSF מתרחשת, יש אפשרות התגובה החיסונית יקטן. בניסוי זה, הראינו כי ריכוז גבוה מאוד של נוגדנים אנטי-c-fms (1,000 ng/mL) נחוץ כדי לעכב אוסטאוקלסט מבשרי הישרדות והתפשטות מתווך על ידי M-CSF. תוצאות אלה נלקח לצד מציע שאת נוגדן anti-c-fms יפעלו כפי טיפולית לעצור osteoclastogenesis ב TNF-α המושרה מחלות osteolytic-ריכוז נמוך, באותו זמן שהריכוז הזה ימנע היווצרות אוסטאוקלסט המושרה על ידי רנקל, M-CSF אשר תאפשר עצם שיפוץ להתרחש.

שלבים קריטיים בפרוטוקול חייבים להתבצע בקפידה כדי להבטיח את ההצלחה של הניסוי. בראשית הפרוטוקול תוך כדי לנתח, חשוב למנוע חיתוך לתוך העצם כדי למנוע זיהום של מח העצם. בתהליך שאיבת מח עצם, כדי להבטיח כי כל מח עצם חולצו, ההליך שטיפה יש לחזור לפי הצורך עד מח עצם כל חולצו, אשר יספקו תשואה גבוהה של תאים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון ריאגנט בדיקות, והוא גם מספק דרך שבו ריכוז נוגדן anti-c-fms יכול להיבדק הימנעות שווא פרשנות של התוצאות. כפי שהראנו, ריכוז נוגדן anti-c-fms אשר נחוץ כדי לעכב היווצרות אוסטאוקלסט אינו שווה בין השיטות על-ידי osteoclasts אשר התקבלו (רנקל או TNF-α), יש לכן כל התוצאות המתקבלות לגבי הריכוז של אנטי-c-fms להיות בזהירות בדק בעתיד ניסויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי KAKENHI JSPS מענק של האגודה יפן קידום של מדע (מס 16K 11776 ל ה ק, מס 17K 17306 ל ק. ס., מס 16 קיי 20637 ל ק ק, מס 16 קיי 20636 כדי טרום וסת, מס 18 קאראט 09862 ל מ ט.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-c-Fms antibody AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)
TNF-α Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.
RANKL PEPROTECH 315-11 Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli
M-CSF Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish.
α-MEM Wako with L-Glutamine and phenol red
Fetal Bovine Serum Biowest s1820-500 Fetal Bovine Serum French Origin
Culture dish Corning 100 mm x 20 mm style dish
96-well plate Thermofischer Scientific Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8 Dojindo, Kumamoto, Japan
Microplate reader Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cell strainer Corning 40 μm Nylon
Centrifuge tube Corning 50 mL CentriStar cap
Triton X-100 Wako Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
  2. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  3. Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).
  4. Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).
  5. Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).
  6. Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).
  7. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  8. Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
  9. Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).
  10. Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).
  11. Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).
  12. Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).
  13. Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).
  14. Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).
  15. Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).
  16. Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).
  17. Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).
  18. Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).

Tags

אוסטאוקלסט אימונולוגיה זיהום גיליון 145 ספיגת מח עצם macrophage M-CSF רנקל TNF-α נוגדן anti-c-fms
ההשפעה של נוגדן Anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט והתפשטות של קודמן אוסטאוקלסט במבחנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida,… More

Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida, M., Shima, K., Kishikawa, A., Ogawa, S., Shen, W. R., Qi, J., Ohori, F., Noguchi, T., Nara, Y., Mizoguchi, I. Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e59089, doi:10.3791/59089 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter