הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל תרביות רקמה לשעבר Vivo עבור סיבוכים Fibrovascular Proliferative רטינופתיה סוכרתית

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59090

⸱

25 בינואר 2019

 ,  ,  , 
1Research Programs Unit, Genome-Scale Biology, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, 2Unit of Vitreoretinal Surgery, Ophthalmology, University of Helsinki and Helsinki University Hospital, 3Department of Microbiology, Tumor, and Cell Biology (MTC), Karolinska Institutet

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד הפתופיזיולוגיה של רטינופתיה סוכרתית proliferative באמצעות רקמות החולה נגזר, טוחנות בניתוח, fibrovascular לתרבות vivo לשעבר ואפיון רקמות יליד תלת מימדי. Ex-vivo תרבות דגם זה גם לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים.

תקציר

רטינופתיה סוכרתית (ד ר) microvascular. הסיבוך הנפוץ ביותר של מחלת הסוכרת, אחד המובילים גורמת לעיוורון אצל מבוגרים בגיל העבודה. אין מודלים בבעלי חיים הנוכחי של סוכרת, רטינופתיה חמצן-induced לפתח את השינויים מתקדמת טווח מלא בא לידי ביטוי אנושי proliferative רטינופתיה סוכרתית (PDR). לכן, הבנה של המחלה פתוגנזה ו פתופסיולוגיה הסתמכה בעיקר על השימוש של מקטעים היסטולוגית ודוגמאות בזגוגית, גישות מספקים רק מידע מצב יציב על הגורמים פתוגניים המעורבים. הוכחה גוברת מציין כי התא דינמי-תא ואינטראקציות מטריצה חוץ-תאית תא (ECM) בהקשר של תלת מימד (3D) microenvironments הם חיוניים עבור המחקרים מכניסטית ופונקציונליים לקראת הפיתוח חדש אסטרטגיות טיפול. לכן, שיערנו כי יכול להיות מנוצל הרקמה fibrovascular פתולוגית טוחנות בניתוח עיניים עם PDR לפענח בצורה אמינה את המנגנונים תאית ומולקולרית של המחלה ההרסנית הזאת, כדי לבחון את פוטנציאל קליני רומן התערבויות. למטרה זאת, פיתחנו שיטה עבור תלת-ממד ex-vivo תרבות של טוחנות בניתוח החולה נגזר fibrovascular רקמה (FT), אשר ישמש מודל הרלוונטיים של פתופסיולוגיה PDR האנושי. FTs ביתר explants, בתוך מטריצת פיברין ex-vivo אפיון תרבות ותלת מימד. Immunofluorescence כולה-הר של FTs יליד ותרבויות מובילים מאפשר חקירה יסודית של רקמת חיבור ותהליכים multicellular, הדגשת חשיבות האפיון רקמות ברמת תלת-ממד עבור חשיפת התכונות הרלוונטיות של פתופסיולוגיה PDR. מודל זה יאפשר את ההערכה סימולטני של המנגנונים המולקולריים, תהליכים סלולרי/רקמות ותגובות לטיפול בהקשר מורכבים של אינטראקציות הביוכימי ופיזית דינאמיים בתוך PDR רקמות אדריכלות, microenvironment. מאז מודל זה recapitulates PDR פתופיזיולוגיה, זה יהיה גם לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים.

מבוא

ד ר הוא סיבוך עינית רציני של סוכרת, מחלה אשר הגיעה לממדים עצומים בשלושת העשורים האחרונים1. עשרים שנה אחרי האבחנה, כמעט בכל חולה עם סוכרת מסוג 1 ו- 60% של חולים עם סוג 2 סוכרת סימנים הנוכחי של רטינופתיה, הפיכת סוכרת כשלעצמה אחד המובילים גורמת לעיוורון בקרב עובדים מבוגרים גיל2. בהתאם לרמה של ניוון microvascular נזק איסכמי, מסווגים ד ר ד ר לא שגשוג (הלא-PDR) ואת ד ר המקדימות (PDR). המחלה בשלב הסופי, PDR, מאופיין כורוידאלית איסכמיה - ו דלקת-induced ותגובות שהותירה את הממשק vitreoretinal. בתנאי שלא טופלו, תהליכים אלה תוביל לעיוורון עקב דימום בזגוגית, פיברוזיס ברשתית, tractional הרשתיות ו- neovascular גלאוקומה3,4. למרות ההתקדמות, אפשרויות הטיפול הנוכחי התמקד רק ד ר בשלבים, כולל בצקת מקולרית סוכרתית ו- PDR, כאשר ברשתית יש כבר התפתח. יתר על כן, שיעור גדול של חולים ד ר לא תועלת armamentarium הטיפול הנוכחי, המציין צורך דחוף טיפולים משופרים4,5,6.

מרובות אניn vivo מחלות התפתחותיות מודלים אחרים, מודלים בעלי חיים סוכרתיים פותחו עד כה, אך אף אחד מהם לא recapitulates בטווח המלא של תכונות פיפטות שנצפו. PDR האנושי7,8. יתר על כן, הוכחה גוברת מציין כי הטיפול תגובות מחוברים בחוזקה את ההרכב ECM כמו גם סידור מרחבי ואינטראקציה בין הסלולר, acellular microenvironment9. לפיכך, אנו, פיתוח מודל הרלוונטית קלינית של PDR האנושי על-ידי ניצול החומר פתולוגיים מטרים הוא בדרך כלל טוחנות מעיני העוברים vitrectomy כחלק הנהלת PDR10כירורגי.

כתב יד זה מתאר הפרוטוקול עבור 3D ex-vivo תרבות, אפיון ניתוח-טוחנות, PDR החולה נגזר מטרים פתולוגי. השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש בפרסום האחרונות הראו דקונסטרוקציה מוצלחת של הנוף רקמות PDR 3D מקורי, החוק הביוגנטי מהתכונות של פתופסיולוגיה PDR כולל האנגיוגנזה ותגובות שהותירה של פרובי מבנים וסקולרית11. מודל זה התגלה גם תכונות רומן לא יכול להיות בקלות מוערכת ממקטעים היסטולוגית דק, כגון במרחב מוגבל אפופטוזיס, התפשטות, כמו גם היווצרות כלי דם איון11. נוזל בזגוגית כבר בשימוש בהצלחה על תרבויות ספרואיד אנדותל תלת-ממד כדי להעריך שלה האנגיוגנזה פוטנציאליים והיעילות של מולקולות angiostatic12על ידי אחרים. בשילוב עם במבחנה 3D תא אנדותל הלימפה (לץ) ספרואיד הלבלוב assay באמצעות PDR הזגוגיות כמו ממריץ, המודל שלנו חשף שהתרומה של שני vitreal מסיסים גורמים כמו גם מקומיים כמו רמזים בתוך רקמת neovascular כדי כמו עדיין ממעטים להבין לץ מעורבות PDR פתופסיולוגיה3,11. ניהול של PDR, ניתוח vitreoretinal הוא הליך שגרתי שבוצעו עדיין מאתגרת. כפי instrumentations כירורגית וטכניקות רואים התקדמות רציפה ותחכום, הסרה שמרנית ובמועד של הדגימה proliferative fibrovascular לא רק משפר את החזון התוצאה, אלא גם מספק חומר רקמות שלא יסולא בפז חקירת PDR תגובות פתופיזיולוגיה וטיפול בהיבטים translational מורכבים של microenvironment רקמה אנושית חיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושרה על ידי הועד המוסדי והוועדה האתית של בית החולים של אוניברסיטת הלסינקי. חתום מדעת היה המתקבלים לכל מטופל.

1. הכנת פתרונות, מדיה וציוד

  1. להכין את הציוד הבא: לפני אוסף של הרקמה fibrovascular (FT) כדי להבטיח עיבוד מהיר.
    1. סטרילי-החיטוי שני microdissection פינצטה.
    2. להכין 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על ידי המסת 1 מראש שנשקל PBS טבליה (0.14 M NaCl, אשלגן כלורי, מ' 0.010 פו4-3מ' 0.0027) ב- 900 מ של מים יונים ומערבבים להתמוסס. התאם את עוצמת המים עד 1 L וסטריליים-החיטוי הפתרון מוכן. החנות RT.
    3. אסוף את הפתרון שהוזכרו לעיל וציוד בסל, יחד עם אזמל חד-פעמי סטרילי, לצלחת תרבות עקרה תא 6 ס מ, חמש צלחות תרבות עקרה תא 12-. טוב.
  2. להכין 6 מ"ג/מ"ל פיברינוגן פתרון ב הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS) על ידי המסת 30 מ"ג של plasminogen מדולדל פיברינוגן אנושי לתוך 5 מ של HBSS, באמצעות שפופרת 50 מ ל שקוע לתוך אמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס, במשך לפחות שעה.
    הערה: פתרון זה יכול להישמר באמבט מים (37 ° C) במשך 7 שעות (מקסימום 10 h) לפני השימוש.
  3. להכין את האקס vivo בינוני תרבות על-ידי הוספת סרום עגל העוברי 5% (FCS) או בנסיוב אדם 5%, 0.4% תא אנדותל הצמיחה תוספת, 10 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס, הידרוקורטיזון μg/mL 1 ו- 50 gentamycin μg/mL כדי זמינים מסחרית מדיום הגידול תא אנדותל ולשמור באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C עד השימוש. לאחסן ב 4 ° C עבור עד חודש.

2. fibrovascular רקמות לנתיחה

  1. לאסוף את הרקמה fibrovascular (FT) כי יש כבר חתכתם ניסויים שעברו ניתוח טרנס-conjunctival microincision vitreoretinal, על-ידי 23 או 20 מד 3 יציאות pars plana vitrectomy כחלק vitreoretinal כירורגית הנהלת PDR.
    הערה: רגל הוא טוחנות באמצעות פילוח ו- delamination, לחתוך אם צורך עם microscissors, להסיר חלל בזגוגית עם microforceps מרתק-סוף תוך-עיני על ידי מנתח מנוסה vitreoretinal. נקטו זהירות צריך לנקוט כדי להסיר ללא פגע, ניזוק FT ללא גרימת נזק למבנים עינית כולל את עצב הראייה או טמפורלית ארקייד כלי הדם שבו הרקמה neovascular פתולוגיים ממוקם בדרך כלל. הגודל של רקמת נכרת הוא משתנה, בדרך כלל הנעים בין 3 ו 50 מ מ2.
  2. לשמור את רגל 6 ס מ תא תרבות מאכל או 1.5 mL שפופרת המכילה 1 מ"ל של PBS סטרילי המוטלות על קרח רטוב, ולהעביר אותו מיד מחקר מעבדה לעיבוד.
    הערה: זה חיוני כי יחידת המחקר (מתקני המעבדה) קרובים פיזית מחדר ניתוח בבית החולים (או אר) כדי למזער את זמני ההעברה של רגל נכרת קטן. במקרה זה ההעברה לוקח פחות מ-5 דקות, explants מוטבעות בתוך פיברין בדרך כלל 1-1.5 h (מקסימום 2 h) לאחר הסרה כירורגית. ההשפעה של זמני ההעברה יותר על התרבות תלת-ממד יצטרך להיבדק.
  3. הכנס את רגל לצלחת תרבות 6 ס מ תא המכיל 1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר (RT, 25 ° C), לרכוש תמונות של הרקמה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה עם מטרה 5 x.
    הערה: תמונות נרכשים עבור הערכה איכותני ותיעוד. זה יהיה ניתן לצפות את גודל רקמות, צפיפות ואת כללי הקומפוזיציה (למשל, מבני כלי הדם).
  4. חותכים רגל ~ 1 מ מ2 חתיכות תחת stereomicroscope לנתיחה זקוף, בעזרת פינצטה סטרילי אזמל, microdissection. . תחזיק את הרקמה, ובכן שקועים הציבורית, במקום באמצעות פינצטה microdissection, ולבצע חתכים ברור באמצעות אזמל סטרילי. הימנע קורע FT, כמו זה. תתאים את המבנים fibrovascular מקורי.
  5. מקם כל חתיכה בודדים לבאר של צלחת תרבות 12-ובכן התא המכיל 1 מ"ל של PBS סטרילי.
    הערה: אם יש צורך, בעדינות להפיץ את רגל לצלחת, באמצעות פינצטה microdissection, לפני ביצוע חתכים.

3. יציקה פיברין זקוף ג'ל טיפות אפיון מטרים יליד והתרבות לשעבר Vivo

  1. סטרילי-מסנן הפתרון פיברינוגן מוכן מוכן בשלב 1.2 עם מסנן μm 0.22 רכוב לתוך מזרק 10 מ"ל.
  2. הכן aliquots של פיברינוגן פתרון (25 μL למחזור 1.5 מ ל), תתמיד הכן RT. aliquot עבור פיברין ג'ל / כל חתיכה מטרים שהושג לאחר הקרע, זוג aliquots נוספת לבדיקה של פיברין ג'ל היווצרות.
  3. הכן פתרון של HBSS המכילה 4 יחידות/mL של תרומבין, 400 μg/mL של aprotinin, שנקרא פתרון מכאן והלאה TA, שתמשיכו RT. להכין כמה שיותר פתרון ת א לפי הצורך, בהתאם למספר חתיכות שהושג לאחר ניתוח (25 μL של ת א פתרון משמש עבור כל אחד FT/fibrin ג'ל), ואת סכום נוסף (למשל, 250 μL) עבור בדיקות היווצרות ג'ל פיברין ולהבטיח כי מספיק פתרון זמין ברחבי הליהוק של טיפות ג'ל פיברין.
    הערה: תרומבין נדרש פיברין הפילמור בזמן aprotinin נוספת כדי למנוע השפלה של הג'ל פיברין על ידי פרוטאזות הסלולר לידי FTs13,14.
  4. מבחן העיתוי של פיברין ג'ל היווצרות: להוסיף μL 25 ת א לפתרון הפתרון פיברינוגן 25 μL aliquoted מוכן בשלב 3.2, באמצעות פיפטה אחר מוגדר 50 μL, לערבב בצינור על-ידי pipetting, לוותר על תוך תבשיל התרבות של תאים 6 ס מ , ויוצרים של droplet זקוף.
    הערה: היווצרות ג'ל פיברין צריך להתבצע ~ 1 דקות. אם זה לוקח יותר מ 1.5 דקות, הריכוז של תרומבין בפתרון ת א מוכן בשלב 3.3 יכול להיות מוגברת על ידי הוספת פתרון מלאי נוסף של תרומבין. עשירית של הכרך בתחילה בשימוש של תרומבין פתרון מניות ניתן להוסיף, שוב ושוב, עד היווצרות ג'ל פיברין מתבצע בתוך דקות 1.5. הזמן של פיברין ג'ל היווצרות הוא קריטי עבור שלוש-ממדיות של התרבות, כמו ג'ל מהירה היווצרות (במרחק 1.5 דקות) מונע את החתיכה מטרים מן לשקוע לקרקעית של הג'ל פיברין, ובכך בא במגע עם משטח הפלסטיק 2D של התא צלחת תרבות, אשר יכול להוביל אדהזיה תא 2D ותוצר.
  5. המקום מטר אחד פיסת במרכז אחד טוב של צלחת 24-ובכן באמצעות פינצטה סטרילי ולהסיר כל PBS עודף על-ידי pipetting עם פיפטה μL 0.5-10 כדי להימנע כוח היניקה רגל. במקרה שהרקמה ומודבקת פינצטה, להשתמש עם פינצטה נוספים כדי לסייע את המיקום של פיסת רקמה על הצלחת.
    הערה: ג'לים מטרים/פיברין גם ניתן לצקת בצלחת 48-טוב כדי להפחית את השימוש של נוגדנים. עם זאת, זה יותר מאתגר כפי הרווח מוגבל יותר ויופצו פיברין, אם הוא בא במגע עם הקיר היטב.
  6. להוסיף 25 μL של פתרון ת א 25 μL פיברינוגן הפתרון aliquoted בשלב 3.2, ולהגדיר באמצעות פיפטה עוד 50 מיקס μL בצינור על-ידי pipetting. לוותר על היצירה מטרים מניחים על הצלחת, ובכן, פיפטה לאורך 2 - 3 פעמים על מנת לכלול את החתיכה מטרים בתוך ה-droplet זקוף, מתן מטריצה תלת-ממדיים המקיפים רגל.
    הערה: ודא כי רגל לא aspirated במהלך pipetting כי אין בועות אוויר נוצרות. ודא גם כי ערבוב, היתר, pipetting מבוצעות במהירות כמו הג'ל פיברין יהוו בתוך 1.5 דק ', כפי שנבדקו בשלב 3.4. אם השלכת פיברין ג'לים בצלחת 48-ובכן, השתמש במקום זאת 20 μL של פתרון פיברינוגן וμl 20 ת א פתרון.
  7. חזור על הצעדים 3.5, 3.6 כל החלקים מטרים.
  8. לאפשר את ג'לים פיברין שבמהלכו מאת המקננת הצלחות בסדרה חממה התרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO2.
  9. לאחר 0.5-1 h, בדוק כי הג'ל פיברין נוצר לחלוטין על ידי בקפידה הטיית הלוח. המשך לשלב 3.10 כאשר הג'ל לא זזה כאשר מטים את הצלחת, המציינת כי היווצרות ג'ל פיברין מלאה.
  10. מכסים את רגל/פיברין ג'לים עם ex-vivo תרבות בינוני (600 μL/טוב בצלחת. ובכן 24) או 300 μL טוב בצלחת. ובכן 48 בתוספת 100 aprotinin μg/mL. Pipette של המדיום בעדינות על ידי היתר drop-wise.
    הערה: כאן, aprotinin משמש כדי למנוע השפלה של הג'ל פיברין פרוטאזות הסלולר לידי FTs13,14. Ex-vivo תרבות בינוני בנוסף ניתן להשלים עם גורמי גדילה רקומביננטי, כגון VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (ראה טבלה של חומרים)11.
  11. מקם את רגל ex-vivo תרבות צלחת בחזרה לתוך 37 ° C, 5% CO2 תא תרבות חממה ותרבות עבור תקופת הזמן הרצוי (למשל, 2 - 18 ימים, תרבות יותר תקופות תצטרך להיבדק). להחליף 50% של המדיום טריים ex-vivo תרבות בינוני כל שלושה ימים.

4. "במטריצת" הדמיה

  1. לרכוש תמונות של רגל ex-vivo תרבויות באותו יום (יום 0), במרווחי זמן קבועים (למשל, כל יום אחר), באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוך, על מנת לעקוב אחר הגידול תלת-ממד.
    הערה: התמונות שהתקבלו יכול לשמש עבור כימות של תוצר מטרים כמו האורך הכולל של שני קטרים בניצב מעבר explant11.

5. יליד מטרים ונקודת תרבות Vivo לשעבר

הערה: ג'לים מטרים/פיברין שניתן תרבותי שמחוץ לתקופת הזמן הרצוי (רגל ex-vivo תרבויות) או קבוע באותו יום (יליד FT) עבור מטרים יליד אפיון11.

  1. לתקן את רגל מקורית או את רגל ex-vivo תרבויות על-ידי החלפת המדיום תרבות 1 מ"ל/טוב של 4% paraformaldehyde בפתרון PBS, עבור h 1-RT. עבור ג'ל מטרים/פיברין מקורית, לתקן 0.5-1 h לאחר תוספת של האקס vivo תרבות בינוני (אם יש לא ספוג של ג'לים פיברין בינוני, קיבוע יפגע להם).
    הערה: לבצע שלב זה בשכונה fume כמו paraformaldehyde הוא מאכל, רעילים ומסרטנים.
  2. לשטוף את ג'לים מטרים/פיברין עם שלושה שוטף 5 דקות ב- PBS (2 מ ל/טוב).
  3. להחליף את PBS עם 2 מ"ל/טוב ל- PBS המכיל אזיד הנתרן 0.02% ולאחסן את ג'לים פיברין קבוע ב 4 ° C עד עיבוד נוסף. חותם הצלחות עם הסרט פרפין על מנת להבטיח ג'לים מטרים/פיברין לא לייבש באחסון.
    הערה: ביצוע שלב זה בשכונה fume כמו אזיד הנתרן הוא רעיל.

6. כולה-הר Immunofluorescence מכתים

הערה: פרוטוקול זה נמשך 5 ימים, יכול להיות מופרע עם incubations לילה במקומות המסומנים. אל תתנו את פיברין ג'לים יבש בכל נקודה. כל השלבים מתבצעים ב- RT, אלא אם צוין אחרת.

  1. הכינו את הפתרונות הבאים לפני תחילת פרוטוקול מוכתמים.
    1. קיבוע שאחרי פתרון: להכין 50: 50 אצטון: מתנול פתרון על ידי ערבוב כמויות שוות של אצטון מתנול (למשל, 50 מ ל). חנות ב-20 ° C. להכין פתרון זה האחרון ביום שלפני ההכתמה. פתרון זה ניתן לאחסן חזרה ב-20 ° C, ניתן להשתמש עבור stainings הבאים.
      הערה: להכין פתרון זה בשכונה fume כמו אצטון, מתנול דליק, מסוכנים לבריאות.
    2. חסימת פתרון: להכין 15% עוברית שור נסיוב (FBS), 0.3% תמצית פנול ethoxylate פתרון ב- PBS מאת הראשון-הוספת 15% FBS כדי PBS. להוסיף תמצית פנול ethoxylate ומערבבים להתמוסס. חנות ב 4 º C.
      הערה: פתרון זה ניתן להכין כמות גדולה מראש, המאוחסן ב- 15 מ"ל aliquotes ב-20 ° C, הקרת לפני השימוש, ביום כאשר מופעל פרוטוקול מוכתמים. השתמש aliquote טריות או טרי המופשרים עבור כל פרוטוקול מוכתמים.
    3. שטיפת פתרון: להכין 1 ליטר ל- PBS בתוספת 0.45% תמצית פנול ethoxylate על-ידי הוספת 4.5 מ ל תמצית פנול ethoxylate מ 995.5 ל- PBS. מערבבים כדי להמיס. החנות RT.
  2. הרם את טיפות בקפידה מהצלחת באמצעות מרית עם קצוות כיכר פלדת אל-חלד. ניתוק ה-droplet קודם מהקצוות לפני הרמת המרכז ולאחר להעביר טוב של 12-ובכן צלחת המכיל 1 מ"ל ל- PBS.
    הערה: לבצע קיבוע שאחרי, שוטף והשלבים חסימה בתבנית זו צלחת.
  3. פוסט-לתקן את טיפות עם 1 מ"ל של 50: 50 קר כקרח פתרון אצטון: מתנול עבור מין ~ 1 (גבול טיפות יהפוך לבן).
    הערה: לבצע שלב זה בשכונה fume כמו אצטון, מתנול הם מסוכנים לבריאות.
  4. לשטוף עם 3-5 מנקי ב 2 מ"ל ל- PBS (טיפות תטבע בפתרון PBS השלמת התייבשות).
    הערה: להימנע מלגעת את טיפות עם קצה פיפטה, כמו לאחר קיבוע שאחרי, שהם נדבקים לפלסטיק. לאורך כל הפרוטוקול, להימנע נוגדן שלאחר תיקון, שואבת, חסימת ושטיפת פתרונות ביניקה, כמו זה עלול לגרום נזק או להשמיד לחלוטין את טיפות. במקום זאת, להטות את הצלחת, הסר בזהירות פתרונות באמצעות פיפטה μL 500-5000.
  5. Centrifuge הפתרון חסימה למשך 15 דקות על 21,000-g ו- 4 ° C כדי להסיר את הלכלוך.
    הערה: הפתרון יכול להיות aliquoted 1.5 mL צינורות עבור צנטריפוגה. הפתרון שאינם בשימוש ניתן להיות מאוחסנים ב 4 ° C, המשמש עבור כל השלבים הבאים הרלוונטיים.
  6. דגירה את טיפות ב- 500 μL חוסם פתרון 2 h-RT.
    הערה: כדי להפחית את עוצמת הקול של חסימת פתרון בשימוש, הצלחת יכול להיות מוטה על תמיכה, ניתן להשתמש μL קטנה כמו 300 של פתרון/רביב.
  7. להכין לתערובת נוגדן ראשוני (לפחות 30 μL/רביב)-דילול המתאים בחסימה פתרון וצנטריפוגה עבור 15 דקות ב 21,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
  8. להעביר את טיפות לתוך עגול (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן באמצעות מרית עם קצוות עגול, דגירה לפחות 30 μL droplet של תערובת נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 º C.
  9. למחרת, העברת טיפות לבאר-12 צלחת המכילה 2 מ"ל לרחוץ את הפתרון/טוב, שטיפה עם 5 שלוש דקות שוטף הראשון ולאחר מכן עם שוטף 30 תשע דקות. להשאיר בכביסה האחרונה (2 מ"ל) בן לילה ב 4 º C.
  10. למחרת, לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולהעביר את טיפות לתוך עגול (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן.
  11. במהלך מנקי, להכין לתערובת נוגדנים משניים fluorophore מצומדת המתאים (שבערך מדולל, μL לפחות 30/רביב) בחסימה פתרון וצנטריפוגה למשך 15 דקות על 21,000-g ו- 4 מעלות צלזיוס.
  12. להעביר את טיפות לתוך סיבוב (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן באמצעות מרית עם קצוות עגול, דגירה לפחות 30 μL של תערובת נוגדנים משניים, במשך 4 שעות ב- RT, מוגן מפני אור.
    הערה: לבצע כל incubations הבאים והשלבים כביסה מוגן מפני אור.
  13. להעביר את טיפות לתוך צלחת 12-ובכן המכיל 2 מ"ל של כביסה פתרון/טוב בעזרת מרית עם קצוות עגול, שטיפה עם שלושה שוטף 5 דקות קודם ואחר כך עם ארבעה שוטף 30 דקות. להשאיר בכביסה האחרונה (2 מ"ל) בן לילה ב 4 º C.
  14. למחרת היום, יש לשטוף את ג'ל עם חמש שוטף 30 דקות, ואז שלוש פעמים עם PBS. להשאיר בכביסה האחרונה (2 מ"ל) בן לילה ב 4 º C.
  15. למחרת, להעביר את טיפות לתוך סיבוב (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן באמצעות עם קצה עגול, מרית counterstain גרעינים המקננת עם 10 μg/mL הכסט גרעינית (לפחות 30 μL/רביב) במשך 30 דקות ב- RT.
    הערה: הרכבה בינונית בתוספת 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) עבור גרעינים counterstaining לחילופין ניתן להשתמש. בכל מקרה, זה צעד וצעד 6.16 מושמטים, ממשיך ישירות אל שלב 6.17.
  16. להעביר את טיפות לתוך צלחת 12-ובכן המכיל 2 מ של PBS/טוב בעזרת מרית עם קצוות סיבוב ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  17. טען את טיפות על גבי שקופיות מיקרוסקופ כדלקמן:
    1. למרוח שכבה צרה של הקשחת מהיר הרכבה בינונית בקצוות של coverglass מרובע בצורת 22 מ"מ x 22 מ"מ ותנו יבש ~ 1 דקה. לבצע שלב זה עבור כל טיפה בנפרד, כדי להימנע התקשות מוגזמת של המדיום הרכבה.
      הערה: ביצוע שלב זה בשכונה fume כמו המדיום הרכבה מהירה-התקשות הוא מסוכנים לבריאות.
    2. לשטוף את ה-droplet בטבילת בטוב של צלחת 12-ובכן המכיל 2 מיליליטר מים יונים והעבר לשקופית מיקרוסקופ, בעזרת מרית עם קצוות עגול. להסיר עודפי מים באמצעות חתיכה קטנה של נייר סופג.
    3. לוותר על μL 15 הרכבה antifade ללא הקשחת בינוני על גבי ה-droplet.
      הערה: לחלופין, אם לא נעשה שימוש הכסט גרעינית, הרכבה בינונית המכיל 4 אינץ ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) יכול לשמש.
    4. בעדינות למקם את מכסה הזכוכית, עם המדיום הרכבה מהירה-הקשחה מול השקופית מיקרוסקופיים, על ה-droplet ואפשר להתפשר.
      הערה: המדיום הקשחת מהיר לדבוק השקופית מיקרוסקופיים, לשמור את ה-droplet במקום.
  18. חזור על צעד 6.17 כל טיפות. הר שתי טיפות בכל שקופית מיקרוסקופ.
  19. תן את השקופיות מילה נהדרת-RT עבור ~ 2 h ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא שהשקופיות הם מוצבים באופן אופקי מוגן מפני אור.
  20. התמונה הילידים מוכתם או שמגבלת מטרים ex-vivo תרבויות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ epifluorescence זקוף מצויד עם פונקצית אופטים אופטי ו 20 x או 40 x אובייקטיבי. השתמש בפונקציה אריח כדי ללכוד אזור רחב יותר של רקמת בבת אחת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הבנה עמוקה יותר של מאפייני הרקמה fibrovascular PDR וביטוי חלבונים הסתמכה בעיקר על דק היסטולוגית מטרים סעיפים3,15,16,17ודוגמאות בזגוגית. כדי לפתח שיטה מעמיקה של הארגון רקמות 3D והתהליכים physiopathological multicellular PDR, יצאנו כדי לנצל את ניתוח נכרת, החולה נגזר FTs פתולוגיים על אפיון 3D ו- ex-vivo תרבות. FTs טריים להעביר את מעבדת המחקר, מעובד כמופיע בזרימת הע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בהתחשב החשיבות של רקמות הרלוונטיים microenvironment עבור תוצאות מכניסטית מולקולרית ותא פונקציונלי אמין, זה הכרחי כדי למצוא גרסאות ניסיוניות המתאימות המספקים סביבה זו רקמה. המתוארים במסמך זה שמחוץ PDR תרבות המודל FTs פיברין-מוטבע מאפשר החקירה על מנגנוני PDR פתופסיולוגיה בהקשר מקורית, מורכבים ולא multicellular של הדגימות PDR קליניים.

השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול הם היווצרות ג'ל פיברין תקין, המיקום של מטרים, כביסה נאותה במהלך ההכתמה. מאז היווצרות ג'ל פיברין תלויה בעיקר הפעילות תרומבין,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים אסירי רשתית רפואי וכירורגי עמיתים, אחיות, כל הצוות של יחידת סוכרת, יחידת הניתוח Vitreoretinal מחלקת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי הלסינקי עבור המשתתפים באופן פעיל בלשכת הגיוס של חולים. אנו מודים Biomedicum יחידת הדמיה מולקולרית על מתקני הדמיה. אנו מודים זולטן צ'רניינקו לסיוע טכני מעולה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים האקדמיה של פינלנד (KL), אוניברסיטת הלסינקי (KL), סיגריד Juselius קרן (KL), קרן ג'והנסון אלבין ק' (KL), מכון הסרטן פינית (KL), קרולינסקה Institutet (KL), פינית העין קרן (SL), עין, קרן בנק רקמות (SL), מרי, קרן Ehrnrooth ג גאורג (SL) ו מענקי מחקר קליני HUCH (TYH2018127 לאחר TYH2016230, SL), לסוכרת (SL, KL, AK, למשל), כמו גם את תכנית הדוקטורט וההתערבות (למשל).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומר
מיקרו-מלקחייםמדיקון07.60.03משמש לטיפול
באזמל חד פעמי FTs - סטריליSwann-Morton0513משמש לדיסקציה FT
צלחת תרבית, מאווררת, 28 מ"ל (60 מ"מ)Greiner Bio-One391-3210משמש לדיסקציה ולבדיקת היווצרות
ג'ל פיבריןלוחות תרבית תאים, 12 בארותGreiner Bio-One392-0049משמש לדיסקציה FT וצינור ריאגנט/צנטריפוגה אימונופלואורסצנטי בהרכבה שלמה
עם מכסה בורג, 15 מ"לGreiner Bio-One391-3477
צינור ריאגנט/צנטריפוגה עם מכסה בורג, 50 מ"לGreiner Bio-One525-0384
Millex-GV יחידת מסנן מזרק, 0.22  ומיקרו; m, PVDFMilliporeSLGV033RSמשמש לסינון סטרילי של מזרק תמיסת הפיברינוגן
, 10 מ"לבראון4606108Vמשמש לסינון סטרילי של תמיסת הפיברינוגן
צינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן, 1.5 מ"לפישרFB74031
מולטי צ'ינס שטופלו בתרבית תאים, 24 בארותNunc142475משמש ליציקת ג'ל FT/fibrin לאפיון FT מקורי ותרבית ex vivo
לוחות תרבית תאים, 96 בארות, U-bottomGreiner Bio-One392-0019משמש למרית אימונופלואורסצנטית שלמה
/שטוחה, נירוסטהVWR82027-528משמש לכיסויים אימונופלואורסצנטיים שלמים
22x22 מ"מ #1Menzel/Fisher15727582משמש עבור הרכבה
שקופיות מיקרוסקופפישרקינדלר K102משמש להרכבת
נייר סופגVWR115-0202משמש להרכבה
<חזק>שםחזק<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<>חזק>ריאגנטים
טבליות PBSMedicago09-9400-100משמשות להכנת 1x
PBS פיברינוגן, מדולל פלסמינוגן, פלזמה אנושיתCalbiochem341578
Hanks תמיסת מלח מאוזנתSigma-AldrichH9394-500MLמשמש להכנת תמיסת הפיברינוגן ותמיסת TA
סרום בקר עובריGibco10270106משמש להכנת החסימה פתרון
סרום אנושיSigma-AldrichH4522Aliquoted in -20 ° C, להפשיר לפני הכנת אמצעי התרבית ex vivo
Gentamicin Sulfate 10mg/mlBiowestL0011-100
Endothelial Cell Media MV KitPromocellC-22120מכיל 500 מ"ל של מדיום גידול תאי אנדותל MV, 25 מ"ל של סרום עגל עוברי, 2 מ"ל של תוסף צמיחת תאי אנדותל,   500 μ L של גורם גדילה אפידרמלי אנושי רקומביננטי (10 μ g/mL) ו-500 μ L של הידרוקורטיזון (1 גרם/מ"ל)
נתרן אזידSigma-AldrichS2002משמש לאחסון של ה-FTs המקוריים וex vivo מתורבתים. רעיל: ללבוש כפפות מגן ו/או בגדים, והגנה על העיניים ו/או הפנים. השתמש במכסה אדים.
אצטוןסיגמא-אולדריץ'32201-2.5L-Mמשמש להכנת התמיסה שלאחר הקיבוע. מזיק: ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן. השתמש במכסה אדים.
מתנולסיגמא-אולדריץ'32213משמש להכנת התמיסה שלאחר הקיבוע. רעיל: ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן. השתמש במכסה אדים.
טריטון X-100 (אוקטיל פנול אתוקסילט)סיגמא-אולדריץ'T9284משמש לאימונופלואורסצנציה שלמה. מזיק: ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן.
Hoechst 33342, 20mMLife Technologies62249לצביעה נגדית של גרעינים. מזיק: ללבוש כפפות מגן ו/או ביגוד, והגנה על העיניים ו/או הפנים.
VECTASHIELD Antifade הרכבה מעבדות וקטור בינוניH-1000ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן, והגנה על העיניים. השתמש במכסה אדים.
מדיום הרכבה VECTASHIELD Antifade עם DAPIVector LaboratoriesH-1200מדיום הרכבה עם צביעה נגדית של גרעינים. ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן, והגנה על העיניים. השתמש במכסה אדים.
Eukitt מדיום הרכבה מתקשה מהירSigma-Aldrich03989-100mlרעיל: ללבוש כפפות מגן ו/או ביגוד, והגנה על העיניים. השתמש במכסה אדים.
תרומבין מפלזמת בקר, אבקה ליופיליתSigma-AldrichT9549-500UN להמיס ב-100 יחידות/מ"ל, להצטט ולאחסן ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה/הפשרה חוזרת של
אפרוטינין מריאות בקר, אבקה ליופיליתSigmaA3428ממיסים ב-50 מ"ג/מ"ל, מצטטים ומאחסנים ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה חוזרת/ הפשרה
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>תגובות
<חזק>גורמי צמיחה
VEGFA אנושי רקומביננטי D Systems293-VE-01050 ננוגרם/מ"ל ריכוז סופי
רקומביננטי אנושיVEGFC מו"פ D Systems752-VC-025200 ננוגרם/מ"ל ריכוז סופי
רקומביננטי אנושי TGF ובטאMilliporeGF3461 ננוגרם/מ"ל ריכוז סופי
רקומביננטי אנושי bFGFMillipore01-10650 ננוגרם/מ"ל ריכוז סופי
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>נוגדנים ראשוניים
CD31 (JC70A)DakoM0823בשימוש בדילול של 1:100, חמור נגד עכבר Alexa 488 משני
AB CD34 (QBEND10)DakoM716501-2בשימוש בדילול של 1:100, חמור נגד עכבר Alexa 488 Ab משני
CD45 (2B11+PD7/26)DakoM070129-2בשימוש בדילול של 1:100, חמור נגד עכבר Alexa 488 Ab משני
CD68ImmunoWayRLM3161בשימוש בדילול 1:100, חמור נגד עכבר Alexa 488 משני Ab
שסוע caspase-3 (5A1E)איתות תאים9664בשימוש בדילול 1:200, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני Ab
ERG (EP111)DakoM731429-2בשימוש בדילול 1:100, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני
Ab GFAPDakoZ0334בשימוש בדילול 1:100, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני Ab
Ki67Leica MicrosystemsNCL-Ki67pבשימוש בדילול של 1:1500, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני
Ab Lyve1R& D SystemsAF2089בשימוש בדילול 1:100, חמור נגד עז Alexa 568 משני Ab
NG2MilliporeAB5320בשימוש בדילול 1:100, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני Ab
Prox1ReliaTech102-PA32בשימוש בדילול 1:200, עז נגד ארנב Alexa 568 משני
Ab Prox1R& D SystemsAF2727בשימוש בדילול של 1:40, עוף נגד עזים Alexa 594 Ab משני
VEGFR3 (9D9F9)MilliporeMAB3757בשימוש בדילול של 1:100, חמור נגד עכבר Alexa 488 משני Ab
α-SMA (1A4)SigmaC6198בשימוש בדילול של 1:400, Cy3 מצומד
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>קטלוג מספר<חזק>הערות
<חזק>נוגדנים משניים
Alexa Fluor488 חמור נגד עכבר IgGLife TechnologiesA-21202בשימוש ב-1:500 דילול
Alexa Fluor594 עז נגד ארנב IgGInvitrogenA-11012בשימוש ב-1:500 דילול
Alexa Fluor568 חמור נגד עיזים IgGThermo ScientificA-11057בשימוש ב-1:500 דילול
Alexa Fluor568 עז אנטי-ארנב IgGThermo ScientificA-11036בשימוש ב-1:500 דילול
Alexa Fluor594 בדיקותמולקולריותעוף A-21468בשימוש ב-1:500 דילול
<חזק>שם<חזק><חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגיComments
>microscopes
Axiovert 200 מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוךZeissזקוף FT SZX9 טרי ומשובץ פיברין
אולימפוסלדיסקציה FT
LSM 780 מיקרוסקופ קונפוקליZeissלהדמיה של
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף FT AxioImager.Z1Zeissלהדמיה של FT מוכתם חיסוני שלם
מו"פ ; IgG נגד עזים להדמיה של סטריאומיקרוסקופ דיסקציה עם הרכבה חיסונית שלמה עם Apotome

מקורות

  1. Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
  3. Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
  4. Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
  5. Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  6. Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
  7. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
  8. Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
  9. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  10. Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
  11. Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
  12. Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
  13. Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
  14. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
  15. Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
  16. Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
  17. Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
  18. Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
  19. Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
  20. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385(2011).
  21. Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
  22. Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090(2011).
  23. Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
  24. Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
  25. Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
  26. Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
  27. Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
  28. Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

רקמה פיברו-וסקולריתתרבית אקס וובו (Ex Vivo)אפיון תלת-ממדיאימונופלורסצנציה של דגימה שלמה (Whole Mount)השכבה במטריצת פיבריןדיסקציה של רקמהאנדותל חיובי ל-CD31תגובה ל-VEGFAסיגנלינג של TGF Beta
מודל תרביות רקמה לשעבר Vivo עבור סיבוכים Fibrovascular Proliferative רטינופתיה סוכרתית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.