Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד הפתופיזיולוגיה של רטינופתיה סוכרתית proliferative באמצעות רקמות החולה נגזר, טוחנות בניתוח, fibrovascular לתרבות vivo לשעבר ואפיון רקמות יליד תלת מימדי. Ex-vivo תרבות דגם זה גם לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים.
Abstract
רטינופתיה סוכרתית (ד ר) microvascular. הסיבוך הנפוץ ביותר של מחלת הסוכרת, אחד המובילים גורמת לעיוורון אצל מבוגרים בגיל העבודה. אין מודלים בבעלי חיים הנוכחי של סוכרת, רטינופתיה חמצן-induced לפתח את השינויים מתקדמת טווח מלא בא לידי ביטוי אנושי proliferative רטינופתיה סוכרתית (PDR). לכן, הבנה של המחלה פתוגנזה ו פתופסיולוגיה הסתמכה בעיקר על השימוש של מקטעים היסטולוגית ודוגמאות בזגוגית, גישות מספקים רק מידע מצב יציב על הגורמים פתוגניים המעורבים. הוכחה גוברת מציין כי התא דינמי-תא ואינטראקציות מטריצה חוץ-תאית תא (ECM) בהקשר של תלת מימד (3D) microenvironments הם חיוניים עבור המחקרים מכניסטית ופונקציונליים לקראת הפיתוח חדש אסטרטגיות טיפול. לכן, שיערנו כי יכול להיות מנוצל הרקמה fibrovascular פתולוגית טוחנות בניתוח עיניים עם PDR לפענח בצורה אמינה את המנגנונים תאית ומולקולרית של המחלה ההרסנית הזאת, כדי לבחון את פוטנציאל קליני רומן התערבויות. למטרה זאת, פיתחנו שיטה עבור תלת-ממד ex-vivo תרבות של טוחנות בניתוח החולה נגזר fibrovascular רקמה (FT), אשר ישמש מודל הרלוונטיים של פתופסיולוגיה PDR האנושי. FTs ביתר explants, בתוך מטריצת פיברין ex-vivo אפיון תרבות ותלת מימד. Immunofluorescence כולה-הר של FTs יליד ותרבויות מובילים מאפשר חקירה יסודית של רקמת חיבור ותהליכים multicellular, הדגשת חשיבות האפיון רקמות ברמת תלת-ממד עבור חשיפת התכונות הרלוונטיות של פתופסיולוגיה PDR. מודל זה יאפשר את ההערכה סימולטני של המנגנונים המולקולריים, תהליכים סלולרי/רקמות ותגובות לטיפול בהקשר מורכבים של אינטראקציות הביוכימי ופיזית דינאמיים בתוך PDR רקמות אדריכלות, microenvironment. מאז מודל זה recapitulates PDR פתופיזיולוגיה, זה יהיה גם לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים.
Introduction
ד ר הוא סיבוך עינית רציני של סוכרת, מחלה אשר הגיעה לממדים עצומים בשלושת העשורים האחרונים1. עשרים שנה אחרי האבחנה, כמעט בכל חולה עם סוכרת מסוג 1 ו- 60% של חולים עם סוג 2 סוכרת סימנים הנוכחי של רטינופתיה, הפיכת סוכרת כשלעצמה אחד המובילים גורמת לעיוורון בקרב עובדים מבוגרים גיל2. בהתאם לרמה של ניוון microvascular נזק איסכמי, מסווגים ד ר ד ר לא שגשוג (הלא-PDR) ואת ד ר המקדימות (PDR). המחלה בשלב הסופי, PDR, מאופיין כורוידאלית איסכמיה - ו דלקת-induced ותגובות שהותירה את הממשק vitreoretinal. בתנאי שלא טופלו, תהליכים אלה תוביל לעיוורון עקב דימום בזגוגית, פיברוזיס ברשתית, tractional הרשתיות ו- neovascular גלאוקומה3,4. למרות ההתקדמות, אפשרויות הטיפול הנוכחי התמקד רק ד ר בשלבים, כולל בצקת מקולרית סוכרתית ו- PDR, כאשר ברשתית יש כבר התפתח. יתר על כן, שיעור גדול של חולים ד ר לא תועלת armamentarium הטיפול הנוכחי, המציין צורך דחוף טיפולים משופרים4,5,6.
מרובות אניn vivo מחלות התפתחותיות מודלים אחרים, מודלים בעלי חיים סוכרתיים פותחו עד כה, אך אף אחד מהם לא recapitulates בטווח המלא של תכונות פיפטות שנצפו. PDR האנושי7,8. יתר על כן, הוכחה גוברת מציין כי הטיפול תגובות מחוברים בחוזקה את ההרכב ECM כמו גם סידור מרחבי ואינטראקציה בין הסלולר, acellular microenvironment9. לפיכך, אנו, פיתוח מודל הרלוונטית קלינית של PDR האנושי על-ידי ניצול החומר פתולוגיים מטרים הוא בדרך כלל טוחנות מעיני העוברים vitrectomy כחלק הנהלת PDR10כירורגי.
כתב יד זה מתאר הפרוטוקול עבור 3D ex-vivo תרבות, אפיון ניתוח-טוחנות, PDR החולה נגזר מטרים פתולוגי. השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש בפרסום האחרונות הראו דקונסטרוקציה מוצלחת של הנוף רקמות PDR 3D מקורי, החוק הביוגנטי מהתכונות של פתופסיולוגיה PDR כולל האנגיוגנזה ותגובות שהותירה של פרובי מבנים וסקולרית11. מודל זה התגלה גם תכונות רומן לא יכול להיות בקלות מוערכת ממקטעים היסטולוגית דק, כגון במרחב מוגבל אפופטוזיס, התפשטות, כמו גם היווצרות כלי דם איון11. נוזל בזגוגית כבר בשימוש בהצלחה על תרבויות ספרואיד אנדותל תלת-ממד כדי להעריך שלה האנגיוגנזה פוטנציאליים והיעילות של מולקולות angiostatic12על ידי אחרים. בשילוב עם במבחנה 3D תא אנדותל הלימפה (לץ) ספרואיד הלבלוב assay באמצעות PDR הזגוגיות כמו ממריץ, המודל שלנו חשף שהתרומה של שני vitreal מסיסים גורמים כמו גם מקומיים כמו רמזים בתוך רקמת neovascular כדי כמו עדיין ממעטים להבין לץ מעורבות PDR פתופסיולוגיה3,11. ניהול של PDR, ניתוח vitreoretinal הוא הליך שגרתי שבוצעו עדיין מאתגרת. כפי instrumentations כירורגית וטכניקות רואים התקדמות רציפה ותחכום, הסרה שמרנית ובמועד של הדגימה proliferative fibrovascular לא רק משפר את החזון התוצאה, אלא גם מספק חומר רקמות שלא יסולא בפז חקירת PDR תגובות פתופיזיולוגיה וטיפול בהיבטים translational מורכבים של microenvironment רקמה אנושית חיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושרה על ידי הועד המוסדי והוועדה האתית של בית החולים של אוניברסיטת הלסינקי. חתום מדעת היה המתקבלים לכל מטופל.
1. הכנת פתרונות, מדיה וציוד
- להכין את הציוד הבא: לפני אוסף של הרקמה fibrovascular (FT) כדי להבטיח עיבוד מהיר.
- סטרילי-החיטוי שני microdissection פינצטה.
- להכין 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על ידי המסת 1 מראש שנשקל PBS טבליה (0.14 M NaCl, אשלגן כלורי, מ' 0.010 פו4-3מ' 0.0027) ב- 900 מ של מים יונים ומערבבים להתמוסס. התאם את עוצמת המים עד 1 L וסטריליים-החיטוי הפתרון מוכן. החנות RT.
- אסוף את הפתרון שהוזכרו לעיל וציוד בסל, יחד עם אזמל חד-פעמי סטרילי, לצלחת תרבות עקרה תא 6 ס מ, חמש צלחות תרבות עקרה תא 12-. טוב.
- להכין 6 מ"ג/מ"ל פיברינוגן פתרון ב הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS) על ידי המסת 30 מ"ג של plasminogen מדולדל פיברינוגן אנושי לתוך 5 מ של HBSS, באמצעות שפופרת 50 מ ל שקוע לתוך אמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס, במשך לפחות שעה.
הערה: פתרון זה יכול להישמר באמבט מים (37 ° C) במשך 7 שעות (מקסימום 10 h) לפני השימוש. - להכין את האקס vivo בינוני תרבות על-ידי הוספת סרום עגל העוברי 5% (FCS) או בנסיוב אדם 5%, 0.4% תא אנדותל הצמיחה תוספת, 10 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס, הידרוקורטיזון μg/mL 1 ו- 50 gentamycin μg/mL כדי זמינים מסחרית מדיום הגידול תא אנדותל ולשמור באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C עד השימוש. לאחסן ב 4 ° C עבור עד חודש.
2. fibrovascular רקמות לנתיחה
- לאסוף את הרקמה fibrovascular (FT) כי יש כבר חתכתם ניסויים שעברו ניתוח טרנס-conjunctival microincision vitreoretinal, על-ידי 23 או 20 מד 3 יציאות pars plana vitrectomy כחלק vitreoretinal כירורגית הנהלת PDR.
הערה: רגל הוא טוחנות באמצעות פילוח ו- delamination, לחתוך אם צורך עם microscissors, להסיר חלל בזגוגית עם microforceps מרתק-סוף תוך-עיני על ידי מנתח מנוסה vitreoretinal. נקטו זהירות צריך לנקוט כדי להסיר ללא פגע, ניזוק FT ללא גרימת נזק למבנים עינית כולל את עצב הראייה או טמפורלית ארקייד כלי הדם שבו הרקמה neovascular פתולוגיים ממוקם בדרך כלל. הגודל של רקמת נכרת הוא משתנה, בדרך כלל הנעים בין 3 ו 50 מ מ2. - לשמור את רגל 6 ס מ תא תרבות מאכל או 1.5 mL שפופרת המכילה 1 מ"ל של PBS סטרילי המוטלות על קרח רטוב, ולהעביר אותו מיד מחקר מעבדה לעיבוד.
הערה: זה חיוני כי יחידת המחקר (מתקני המעבדה) קרובים פיזית מחדר ניתוח בבית החולים (או אר) כדי למזער את זמני ההעברה של רגל נכרת קטן. במקרה זה ההעברה לוקח פחות מ-5 דקות, explants מוטבעות בתוך פיברין בדרך כלל 1-1.5 h (מקסימום 2 h) לאחר הסרה כירורגית. ההשפעה של זמני ההעברה יותר על התרבות תלת-ממד יצטרך להיבדק. - הכנס את רגל לצלחת תרבות 6 ס מ תא המכיל 1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר (RT, 25 ° C), לרכוש תמונות של הרקמה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה עם מטרה 5 x.
הערה: תמונות נרכשים עבור הערכה איכותני ותיעוד. זה יהיה ניתן לצפות את גודל רקמות, צפיפות ואת כללי הקומפוזיציה (למשל, מבני כלי הדם). - חותכים רגל ~ 1 מ מ2 חתיכות תחת stereomicroscope לנתיחה זקוף, בעזרת פינצטה סטרילי אזמל, microdissection. . תחזיק את הרקמה, ובכן שקועים הציבורית, במקום באמצעות פינצטה microdissection, ולבצע חתכים ברור באמצעות אזמל סטרילי. הימנע קורע FT, כמו זה. תתאים את המבנים fibrovascular מקורי.
- מקם כל חתיכה בודדים לבאר של צלחת תרבות 12-ובכן התא המכיל 1 מ"ל של PBS סטרילי.
הערה: אם יש צורך, בעדינות להפיץ את רגל לצלחת, באמצעות פינצטה microdissection, לפני ביצוע חתכים.
3. יציקה פיברין זקוף ג'ל טיפות אפיון מטרים יליד והתרבות לשעבר Vivo
- סטרילי-מסנן הפתרון פיברינוגן מוכן מוכן בשלב 1.2 עם מסנן μm 0.22 רכוב לתוך מזרק 10 מ"ל.
- הכן aliquots של פיברינוגן פתרון (25 μL למחזור 1.5 מ ל), תתמיד הכן RT. aliquot עבור פיברין ג'ל / כל חתיכה מטרים שהושג לאחר הקרע, זוג aliquots נוספת לבדיקה של פיברין ג'ל היווצרות.
- הכן פתרון של HBSS המכילה 4 יחידות/mL של תרומבין, 400 μg/mL של aprotinin, שנקרא פתרון מכאן והלאה TA, שתמשיכו RT. להכין כמה שיותר פתרון ת א לפי הצורך, בהתאם למספר חתיכות שהושג לאחר ניתוח (25 μL של ת א פתרון משמש עבור כל אחד FT/fibrin ג'ל), ואת סכום נוסף (למשל, 250 μL) עבור בדיקות היווצרות ג'ל פיברין ולהבטיח כי מספיק פתרון זמין ברחבי הליהוק של טיפות ג'ל פיברין.
הערה: תרומבין נדרש פיברין הפילמור בזמן aprotinin נוספת כדי למנוע השפלה של הג'ל פיברין על ידי פרוטאזות הסלולר לידי FTs13,14. - מבחן העיתוי של פיברין ג'ל היווצרות: להוסיף μL 25 ת א לפתרון הפתרון פיברינוגן 25 μL aliquoted מוכן בשלב 3.2, באמצעות פיפטה אחר מוגדר 50 μL, לערבב בצינור על-ידי pipetting, לוותר על תוך תבשיל התרבות של תאים 6 ס מ , ויוצרים של droplet זקוף.
הערה: היווצרות ג'ל פיברין צריך להתבצע ~ 1 דקות. אם זה לוקח יותר מ 1.5 דקות, הריכוז של תרומבין בפתרון ת א מוכן בשלב 3.3 יכול להיות מוגברת על ידי הוספת פתרון מלאי נוסף של תרומבין. עשירית של הכרך בתחילה בשימוש של תרומבין פתרון מניות ניתן להוסיף, שוב ושוב, עד היווצרות ג'ל פיברין מתבצע בתוך דקות 1.5. הזמן של פיברין ג'ל היווצרות הוא קריטי עבור שלוש-ממדיות של התרבות, כמו ג'ל מהירה היווצרות (במרחק 1.5 דקות) מונע את החתיכה מטרים מן לשקוע לקרקעית של הג'ל פיברין, ובכך בא במגע עם משטח הפלסטיק 2D של התא צלחת תרבות, אשר יכול להוביל אדהזיה תא 2D ותוצר. - המקום מטר אחד פיסת במרכז אחד טוב של צלחת 24-ובכן באמצעות פינצטה סטרילי ולהסיר כל PBS עודף על-ידי pipetting עם פיפטה μL 0.5-10 כדי להימנע כוח היניקה רגל. במקרה שהרקמה ומודבקת פינצטה, להשתמש עם פינצטה נוספים כדי לסייע את המיקום של פיסת רקמה על הצלחת.
הערה: ג'לים מטרים/פיברין גם ניתן לצקת בצלחת 48-טוב כדי להפחית את השימוש של נוגדנים. עם זאת, זה יותר מאתגר כפי הרווח מוגבל יותר ויופצו פיברין, אם הוא בא במגע עם הקיר היטב. - להוסיף 25 μL של פתרון ת א 25 μL פיברינוגן הפתרון aliquoted בשלב 3.2, ולהגדיר באמצעות פיפטה עוד 50 מיקס μL בצינור על-ידי pipetting. לוותר על היצירה מטרים מניחים על הצלחת, ובכן, פיפטה לאורך 2 - 3 פעמים על מנת לכלול את החתיכה מטרים בתוך ה-droplet זקוף, מתן מטריצה תלת-ממדיים המקיפים רגל.
הערה: ודא כי רגל לא aspirated במהלך pipetting כי אין בועות אוויר נוצרות. ודא גם כי ערבוב, היתר, pipetting מבוצעות במהירות כמו הג'ל פיברין יהוו בתוך 1.5 דק ', כפי שנבדקו בשלב 3.4. אם השלכת פיברין ג'לים בצלחת 48-ובכן, השתמש במקום זאת 20 μL של פתרון פיברינוגן וμl 20 ת א פתרון. - חזור על הצעדים 3.5, 3.6 כל החלקים מטרים.
- לאפשר את ג'לים פיברין שבמהלכו מאת המקננת הצלחות בסדרה חממה התרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO2.
- לאחר 0.5-1 h, בדוק כי הג'ל פיברין נוצר לחלוטין על ידי בקפידה הטיית הלוח. המשך לשלב 3.10 כאשר הג'ל לא זזה כאשר מטים את הצלחת, המציינת כי היווצרות ג'ל פיברין מלאה.
- מכסים את רגל/פיברין ג'לים עם ex-vivo תרבות בינוני (600 μL/טוב בצלחת. ובכן 24) או 300 μL טוב בצלחת. ובכן 48 בתוספת 100 aprotinin μg/mL. Pipette של המדיום בעדינות על ידי היתר drop-wise.
הערה: כאן, aprotinin משמש כדי למנוע השפלה של הג'ל פיברין פרוטאזות הסלולר לידי FTs13,14. Ex-vivo תרבות בינוני בנוסף ניתן להשלים עם גורמי גדילה רקומביננטי, כגון VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (ראה טבלה של חומרים)11. - מקם את רגל ex-vivo תרבות צלחת בחזרה לתוך 37 ° C, 5% CO2 תא תרבות חממה ותרבות עבור תקופת הזמן הרצוי (למשל, 2 - 18 ימים, תרבות יותר תקופות תצטרך להיבדק). להחליף 50% של המדיום טריים ex-vivo תרבות בינוני כל שלושה ימים.
4. "במטריצת" הדמיה
- לרכוש תמונות של רגל ex-vivo תרבויות באותו יום (יום 0), במרווחי זמן קבועים (למשל, כל יום אחר), באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוך, על מנת לעקוב אחר הגידול תלת-ממד.
הערה: התמונות שהתקבלו יכול לשמש עבור כימות של תוצר מטרים כמו האורך הכולל של שני קטרים בניצב מעבר explant11.
5. יליד מטרים ונקודת תרבות Vivo לשעבר
הערה: ג'לים מטרים/פיברין שניתן תרבותי שמחוץ לתקופת הזמן הרצוי (רגל ex-vivo תרבויות) או קבוע באותו יום (יליד FT) עבור מטרים יליד אפיון11.
- לתקן את רגל מקורית או את רגל ex-vivo תרבויות על-ידי החלפת המדיום תרבות 1 מ"ל/טוב של 4% paraformaldehyde בפתרון PBS, עבור h 1-RT. עבור ג'ל מטרים/פיברין מקורית, לתקן 0.5-1 h לאחר תוספת של האקס vivo תרבות בינוני (אם יש לא ספוג של ג'לים פיברין בינוני, קיבוע יפגע להם).
הערה: לבצע שלב זה בשכונה fume כמו paraformaldehyde הוא מאכל, רעילים ומסרטנים. - לשטוף את ג'לים מטרים/פיברין עם שלושה שוטף 5 דקות ב- PBS (2 מ ל/טוב).
- להחליף את PBS עם 2 מ"ל/טוב ל- PBS המכיל אזיד הנתרן 0.02% ולאחסן את ג'לים פיברין קבוע ב 4 ° C עד עיבוד נוסף. חותם הצלחות עם הסרט פרפין על מנת להבטיח ג'לים מטרים/פיברין לא לייבש באחסון.
הערה: ביצוע שלב זה בשכונה fume כמו אזיד הנתרן הוא רעיל.
6. כולה-הר Immunofluorescence מכתים
הערה: פרוטוקול זה נמשך 5 ימים, יכול להיות מופרע עם incubations לילה במקומות המסומנים. אל תתנו את פיברין ג'לים יבש בכל נקודה. כל השלבים מתבצעים ב- RT, אלא אם צוין אחרת.
- הכינו את הפתרונות הבאים לפני תחילת פרוטוקול מוכתמים.
- קיבוע שאחרי פתרון: להכין 50: 50 אצטון: מתנול פתרון על ידי ערבוב כמויות שוות של אצטון מתנול (למשל, 50 מ ל). חנות ב-20 ° C. להכין פתרון זה האחרון ביום שלפני ההכתמה. פתרון זה ניתן לאחסן חזרה ב-20 ° C, ניתן להשתמש עבור stainings הבאים.
הערה: להכין פתרון זה בשכונה fume כמו אצטון, מתנול דליק, מסוכנים לבריאות. - חסימת פתרון: להכין 15% עוברית שור נסיוב (FBS), 0.3% תמצית פנול ethoxylate פתרון ב- PBS מאת הראשון-הוספת 15% FBS כדי PBS. להוסיף תמצית פנול ethoxylate ומערבבים להתמוסס. חנות ב 4 º C.
הערה: פתרון זה ניתן להכין כמות גדולה מראש, המאוחסן ב- 15 מ"ל aliquotes ב-20 ° C, הקרת לפני השימוש, ביום כאשר מופעל פרוטוקול מוכתמים. השתמש aliquote טריות או טרי המופשרים עבור כל פרוטוקול מוכתמים. - שטיפת פתרון: להכין 1 ליטר ל- PBS בתוספת 0.45% תמצית פנול ethoxylate על-ידי הוספת 4.5 מ ל תמצית פנול ethoxylate מ 995.5 ל- PBS. מערבבים כדי להמיס. החנות RT.
- קיבוע שאחרי פתרון: להכין 50: 50 אצטון: מתנול פתרון על ידי ערבוב כמויות שוות של אצטון מתנול (למשל, 50 מ ל). חנות ב-20 ° C. להכין פתרון זה האחרון ביום שלפני ההכתמה. פתרון זה ניתן לאחסן חזרה ב-20 ° C, ניתן להשתמש עבור stainings הבאים.
- הרם את טיפות בקפידה מהצלחת באמצעות מרית עם קצוות כיכר פלדת אל-חלד. ניתוק ה-droplet קודם מהקצוות לפני הרמת המרכז ולאחר להעביר טוב של 12-ובכן צלחת המכיל 1 מ"ל ל- PBS.
הערה: לבצע קיבוע שאחרי, שוטף והשלבים חסימה בתבנית זו צלחת. - פוסט-לתקן את טיפות עם 1 מ"ל של 50: 50 קר כקרח פתרון אצטון: מתנול עבור מין ~ 1 (גבול טיפות יהפוך לבן).
הערה: לבצע שלב זה בשכונה fume כמו אצטון, מתנול הם מסוכנים לבריאות. - לשטוף עם 3-5 מנקי ב 2 מ"ל ל- PBS (טיפות תטבע בפתרון PBS השלמת התייבשות).
הערה: להימנע מלגעת את טיפות עם קצה פיפטה, כמו לאחר קיבוע שאחרי, שהם נדבקים לפלסטיק. לאורך כל הפרוטוקול, להימנע נוגדן שלאחר תיקון, שואבת, חסימת ושטיפת פתרונות ביניקה, כמו זה עלול לגרום נזק או להשמיד לחלוטין את טיפות. במקום זאת, להטות את הצלחת, הסר בזהירות פתרונות באמצעות פיפטה μL 500-5000. - Centrifuge הפתרון חסימה למשך 15 דקות על 21,000-g ו- 4 ° C כדי להסיר את הלכלוך.
הערה: הפתרון יכול להיות aliquoted 1.5 mL צינורות עבור צנטריפוגה. הפתרון שאינם בשימוש ניתן להיות מאוחסנים ב 4 ° C, המשמש עבור כל השלבים הבאים הרלוונטיים. - דגירה את טיפות ב- 500 μL חוסם פתרון 2 h-RT.
הערה: כדי להפחית את עוצמת הקול של חסימת פתרון בשימוש, הצלחת יכול להיות מוטה על תמיכה, ניתן להשתמש μL קטנה כמו 300 של פתרון/רביב. - להכין לתערובת נוגדן ראשוני (לפחות 30 μL/רביב)-דילול המתאים בחסימה פתרון וצנטריפוגה עבור 15 דקות ב 21,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
- להעביר את טיפות לתוך עגול (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן באמצעות מרית עם קצוות עגול, דגירה לפחות 30 μL droplet של תערובת נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 º C.
- למחרת, העברת טיפות לבאר-12 צלחת המכילה 2 מ"ל לרחוץ את הפתרון/טוב, שטיפה עם 5 שלוש דקות שוטף הראשון ולאחר מכן עם שוטף 30 תשע דקות. להשאיר בכביסה האחרונה (2 מ"ל) בן לילה ב 4 º C.
- למחרת, לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולהעביר את טיפות לתוך עגול (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן.
- במהלך מנקי, להכין לתערובת נוגדנים משניים fluorophore מצומדת המתאים (שבערך מדולל, μL לפחות 30/רביב) בחסימה פתרון וצנטריפוגה למשך 15 דקות על 21,000-g ו- 4 מעלות צלזיוס.
- להעביר את טיפות לתוך סיבוב (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן באמצעות מרית עם קצוות עגול, דגירה לפחות 30 μL של תערובת נוגדנים משניים, במשך 4 שעות ב- RT, מוגן מפני אור.
הערה: לבצע כל incubations הבאים והשלבים כביסה מוגן מפני אור. - להעביר את טיפות לתוך צלחת 12-ובכן המכיל 2 מ"ל של כביסה פתרון/טוב בעזרת מרית עם קצוות עגול, שטיפה עם שלושה שוטף 5 דקות קודם ואחר כך עם ארבעה שוטף 30 דקות. להשאיר בכביסה האחרונה (2 מ"ל) בן לילה ב 4 º C.
- למחרת היום, יש לשטוף את ג'ל עם חמש שוטף 30 דקות, ואז שלוש פעמים עם PBS. להשאיר בכביסה האחרונה (2 מ"ל) בן לילה ב 4 º C.
- למחרת, להעביר את טיפות לתוך סיבוב (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן באמצעות עם קצה עגול, מרית counterstain גרעינים המקננת עם 10 μg/mL הכסט גרעינית (לפחות 30 μL/רביב) במשך 30 דקות ב- RT.
הערה: הרכבה בינונית בתוספת 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) עבור גרעינים counterstaining לחילופין ניתן להשתמש. בכל מקרה, זה צעד וצעד 6.16 מושמטים, ממשיך ישירות אל שלב 6.17. - להעביר את טיפות לתוך צלחת 12-ובכן המכיל 2 מ של PBS/טוב בעזרת מרית עם קצוות סיבוב ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
- טען את טיפות על גבי שקופיות מיקרוסקופ כדלקמן:
- למרוח שכבה צרה של הקשחת מהיר הרכבה בינונית בקצוות של coverglass מרובע בצורת 22 מ"מ x 22 מ"מ ותנו יבש ~ 1 דקה. לבצע שלב זה עבור כל טיפה בנפרד, כדי להימנע התקשות מוגזמת של המדיום הרכבה.
הערה: ביצוע שלב זה בשכונה fume כמו המדיום הרכבה מהירה-התקשות הוא מסוכנים לבריאות. - לשטוף את ה-droplet בטבילת בטוב של צלחת 12-ובכן המכיל 2 מיליליטר מים יונים והעבר לשקופית מיקרוסקופ, בעזרת מרית עם קצוות עגול. להסיר עודפי מים באמצעות חתיכה קטנה של נייר סופג.
- לוותר על μL 15 הרכבה antifade ללא הקשחת בינוני על גבי ה-droplet.
הערה: לחלופין, אם לא נעשה שימוש הכסט גרעינית, הרכבה בינונית המכיל 4 אינץ ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) יכול לשמש. - בעדינות למקם את מכסה הזכוכית, עם המדיום הרכבה מהירה-הקשחה מול השקופית מיקרוסקופיים, על ה-droplet ואפשר להתפשר.
הערה: המדיום הקשחת מהיר לדבוק השקופית מיקרוסקופיים, לשמור את ה-droplet במקום.
- למרוח שכבה צרה של הקשחת מהיר הרכבה בינונית בקצוות של coverglass מרובע בצורת 22 מ"מ x 22 מ"מ ותנו יבש ~ 1 דקה. לבצע שלב זה עבור כל טיפה בנפרד, כדי להימנע התקשות מוגזמת של המדיום הרכבה.
- חזור על צעד 6.17 כל טיפות. הר שתי טיפות בכל שקופית מיקרוסקופ.
- תן את השקופיות מילה נהדרת-RT עבור ~ 2 h ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא שהשקופיות הם מוצבים באופן אופקי מוגן מפני אור.
- התמונה הילידים מוכתם או שמגבלת מטרים ex-vivo תרבויות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ epifluorescence זקוף מצויד עם פונקצית אופטים אופטי ו 20 x או 40 x אובייקטיבי. השתמש בפונקציה אריח כדי ללכוד אזור רחב יותר של רקמת בבת אחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבנה עמוקה יותר של מאפייני הרקמה fibrovascular PDR וביטוי חלבונים הסתמכה בעיקר על דק היסטולוגית מטרים סעיפים3,15,16,17ודוגמאות בזגוגית. כדי לפתח שיטה מעמיקה של הארגון רקמות 3D והתהליכים physiopathological multicellular PDR, יצאנו כדי לנצל את ניתוח נכרת, החולה נגזר FTs פתולוגיים על אפיון 3D ו- ex-vivo תרבות. FTs טריים להעביר את מעבדת המחקר, מעובד כמופיע בזרימת העבודה סכמטית באיור1.
FTs יכולה לדימות לפני ניתוח עבור הערכה איכותני ותיעוד (איור 2). כפי שמוצג באיור2, FTs התצוגה וקצרה בין המטופל גודל, צפיפות, שפע של מבנים כלי הדם. כמה רקמות, תאים רופף, תאים דלקתיים/החיסון כפי הנראה או כדוריות דם אדומות, כמו גם חסינה נגד מבנים כלי הדם של קליבר שונה גם ניתן בקלות להבחין (איור 2). לאחר ניתוח, החלטה צריך להתבצע על השימוש במורד הזרם של הגבלת מספר explants שהושג. חלק explants מוטבע בתוך מטריקס פיברין, קבוע לאחר היווצרות ג'ל פיברין, ואילו explants הנותרים יכולה להיות נתונה ל ex-vivo תרבות על צלחת נפרדת (איור 1). FTs טריים יש גם בהצלחה מנוצל עבור אפיון ultrastructural על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. הדגימות ניתן שגם מעובד במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים קונבנציונאלי (TEM) סעיפים ודק במיוחד או בלוק טורי סריקת הפנים מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM)3,11.
ג'לים פיברין קבוע יכול להיות מאוחסנים במשך מספר שבועות, מוכתמת כולה-הר immunofluorescence18,19. הדגימות מוכתם יציבים באופן דומה כאשר הוא מאוחסן ב 4 ° C בחושך. ג'לים מטרים/פיברין עבה יכולה לדימות זמן-ביעילות עם מיקרוסקופ epifluorescence מצויד עם פונקצית אופטים אופטי, שימושי עבור הסרת פזורים out-of-להתמקד אור. הדמיה בשיטה זו מספק בסדר ויזואליזציה של המבנים. לחלופין, מיקרוסקופיה קונפוקלית, למרות הזמן-תובעני יותר, באפשרותך לאפשר לכידתו של הפרטים הקטנים. האפיון של טרי פיברין-מוטבע, קבוע, FTs מחציתה, מקורית מאת כולה-הר immunofluorescence מאפשרת אפיון מבנה כלי הדם, סוגי תאים מרובים ובפיזור הדדיים בתוך רקמת PDR תלת-ממד הנוף11. למשל, נוגדנים CD31 יכול לשמש כדי להציג את אנדותל וגילה NG2 להצגת pericytes (איור 3), בעוד Lyve1 נוגדנים לדמיין שזה עתה הלימפה-אנדותל מבני (איור 4)11. צירופים מרובים של נוגדנים יכול לשמש כדי להמחיש כמה מבנים, סוגי תאים (ראה טבלה של חומרים); לדוגמה, ארג יכולה גם לדמיין את אנדותל, אשר יש דפוס ביטוי discontinuos neovasculature PDR חריג. המבנים וסקולרית צבעונית עם סמן ממברנה (למשל, CD31 ו- Lyve1) ניתן באופן כמותי לנתח עבור שימור וצפיפות באמצעות Angiotool, תוכנה חינם-מקור שפותחה על ידי מכון הסרטן הלאומי NIH11, 20. אמצעי אחסון תלת-ממד שיכול להתבצע גם מן הנתונים (dataset) שהושג (ראה וידאו 1). אם נוגדן אינו מתאים immunofluorescence כולה-הר, טיפות פיברין ניתן לחלופין להיות מוטבע פרפין, לגזור לסעיפים דק, נותחו על ידי אימונוהיסטוכימיה. במקרה זה טיפות תועלת קיבוע לילה ב 4 ° C במקום האחד עשר-RT.
Ex-vivo תרבות ומקיימת את הצמיחה של FTs פיברין-מוטבע, פיתוח outgrowths הסלולר כבר אחרי יומיים (איור 5). הג'ל פיברין במבחנה משמשת גם המטריצה עבור ex-vivo תרבות, מאז זה מאפיינת את ECM הזמנית ויוו, נוצר אחרי תרומבין המחשוף של פיברינוגן סרום באתרים של דליפה וסקולרית, במגע ישיר עם neovessels PDR דולפים ב דלקתי וחשש שהותירה15,21,22.
PDR הוא סיבוך microvascular מאופיין האנגיוגנזה והתגובה שהותירה, explants מטרים לשמר את רפרטואר הסלולר בתרבות, כמו גם להגיב ביעילות לגירויים אקסוגני הוסיף את תרבות המדיה בגרסה11. הנתונים נציג איור 6 מראה כי התרבויות לשעבר vivo PDR המושרה לבלוב CD31-חיוביות אנדותל, להערכת השימור בתגובה VEGFA, בעוד TGFβ המושרה לתגובה שהותירה בא לידי ביטוי תוצר NG2-חיוביות pericytes/SMCs. כמה גירויים אקסוגני יכול להיבדק ו, כאשר הודיע על ידי מדידות של שפע vitreal ויוו שלהם, PDR בזאת מפותחת ex-vivo המודל יכול לחשוף הרומן microenvironment ולהקשר התלויים PDR פתולוגיים מנגנונים שלא ניתן דמיינו בחומר רקמות קבוע.
איור 1. Ex-vivo PDR תרביות רקמה fibrovascular דגם- ייצוג סכמטי של זרימת העבודה מהניתוח vitreoretinal (pars plana vitrectomy) עבור הכריתה של רגל לנתיחה שלה לתוך explants, הטמעה לתוך פיברין לתרבות אפיון ו- ex-vivo תלת מימדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. טרי טוחנות PDR רקמות fibrovascular לפני ניתוח. שלב contast micrographs של FTs טרי נכרת נלקח לפני ניתוח. FTs הם משתנה מאוד גודל, צפיפות, שפע של מבנים כלי הדם. ראשי חצים מצביעות על מבנה כלי הדם של קליבר שונה. הקו האדום שקופים חלקית מדגיש שתי ספינות בודדות של קליבר שונה. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה עם 5 x, מפתח נומרי 0.15 (NA), המטרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. כולה-הר immunofluorescence של טישו PDR מקורי fibrovascular. Epifluorescence micrograph של יליד PDR מטרים מוכתם על ידי כולה-הר immunofluorescence. CD31 (A, ירוק) מדמיין את אנדותל תוך NG2 (B, אדום) מדמיין את pericytes בתוך המבנים neovascular לא סדיר. התמונות הממוזגות מוצגים (C). דאפי (כחול) counterstain מדמיין גרעינים. התמונה שצולמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence זקופה עם פונקציית אופטים אופטי, בשילוב עם מבוקר-מחשב 1.3 מגה פיקסל בשחור-לבן CCD מצלמה ותמונה רכישת תוכנה, באמצעות סימן x 40, נה 1.4, שמן אובייקטיבי. לתשעה חלקים אופטי משולב באמצעות תוכנת עיבוד תמונה ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. כולה-הר immunofluorescence של טישו PDR מקורי fibrovascular. Epifluorescence micrograph של יליד PDR מטרים מוכתם על ידי כולה-הר immunofluorescence. CD31 (A, ירוק) מדמיין את אנדותל תוך Lyve1 (B, אדום) מדמיין את שהתגלתה הלימפה-אנדותל מבני. התמונות הממוזגות מוצגים (C). Counterstain (כחול) Hoechst-33342 מדמיין גרעינים. התמונה שצולמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence זקופה עם פונקציית אופטים אופטי, בשילוב עם מבוקר-מחשב 1.3 מגה פיקסל מונוכרום מצלמת CCD ואת התמונה רכישת התוכנה, באמצעות מטרה x 20, 0.8 NA. ארבעה מקטעים אופטי משולב באמצעות תוכנת עיבוד תמונה ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. Ex-vivo הצמיחה של הרקמות PDR fibrovascular. שלב החדות micrographs של שני מטרים ex vivo תרבויות בנקודות הזמן המצוין (יום). FTs לגדול ex-vivo תרבות, פיתוח outgrowths הסלולר כבר אחרי יומיים. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה עם מטרה 5 x, 0.15 NA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. כולה-הר immunofluorescence של רקמות fibrovascular PDR תרבותי ex-vivo לא מטופל (CTRL), או נוכחות של VEGFA או TGFβ. Epifluorescence micrograph רגל תרבותי ex-vivo לא מטופל (CTRL) או בנוכחות של VEGFA או TGFβ 9 ימים, לאחר מכן מוכתמת כולה-הר immunofluorescence. CD31 (ירוק) מדמיין את אנדותל בזמן NG2 (אדום) מדמיין את pericytes. דאפי (כחול) counterstain מדמיין גרעינים. VEGFA התייצב על להערכת בזמן TGFβ המושרה לתגובה שהותירה. התמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence זקופה עם פונקציית אופטים אופטי, בשילוב עם מבוקר-מחשב 1.3 מגה פיקסל מונוכרום מצלמת CCD ואת התמונה רכישת התוכנה, באמצעות מטרה x 20, 0.8 NA. לתשעה חלקים אופטי משולב באמצעות תוכנת עיבוד תמונה ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1. שחזור תלת-ממדי של מטרים יליד מוכתמת כולה-הר immunofluorescence. CD31 (ירוק) Lyve1 (אדום). Counterstain Hoechst-33342 (כחול) מדמיין גרעינים. התמונה שצולמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence זקופה עם פונקציית אופטים אופטי, בשילוב עם מבוקר-מחשב 1.3 מגה פיקסל מונוכרום מצלמת CCD ואת התמונה רכישת התוכנה, באמצעות מטרה x 20, 0.8 NA. שחזור תלת-ממדי, עיבוד הווידאו בוצעה באמצעות תוכנה מסחרית. חלק הווידאו מודפס ברשות Gucciardo. et al. 11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהתחשב החשיבות של רקמות הרלוונטיים microenvironment עבור תוצאות מכניסטית מולקולרית ותא פונקציונלי אמין, זה הכרחי כדי למצוא גרסאות ניסיוניות המתאימות המספקים סביבה זו רקמה. המתוארים במסמך זה שמחוץ PDR תרבות המודל FTs פיברין-מוטבע מאפשר החקירה על מנגנוני PDR פתופסיולוגיה בהקשר מקורית, מורכבים ולא multicellular של הדגימות PDR קליניים.
השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול הם היווצרות ג'ל פיברין תקין, המיקום של מטרים, כביסה נאותה במהלך ההכתמה. מאז היווצרות ג'ל פיברין תלויה בעיקר הפעילות תרומבין, מושפעות על ידי ריכוז טמפרטורה, כמות תרומבין צריך להיות מותאם עבור כל אצווה של תכשיר ג'ל פיברין. היווצרות ג'ל פיברין צריך להיות מספיק מהיר למנוע צמיחה דו-מימדית של explants מטרים אך גם איטי מספיק כדי לאפשר מיקום רגל למרכז טיפות אנכית או אופקית. במקרה שרגל יקרה לאתר בקצה ה-droplet, pipetting נוספים יכול לסייע הצבת רגל למרכז. FTs נשארים עדיין בקצה טיפות או זה לגדול ב- 2D יהיה צורך ייכללו. נאותה שוטף במהלך צביעת והימנעות ייבוש של טיפות הם בתורו קריטיים כדי למטב את צביעת ולצמצם את הרקע אות. זמני ההעברה עשוי גם להיות קריטי. אנחנו שהטבעת של FTs עד שעתיים לאחר vitrectomy, לא השפיעה על האקסית vivo צמיחה. ההשפעה של זמני ההעברה יותר על הצלחה התרבות צריכים להיבדק.
פרוטוקול זה יכול להיות שונה באמצעות מטריצות חלופי להטבעת מטרים. אין ויוו, neovessels PDR להתעשר לעבר קליפת בזגוגית קולגן23. עם זאת, על בריחת הדם סרום הרכיבים, כולל פיברינוגן, להתמוסס אל תוך הזגוגיות בסמיכות כלי לפיה התגובה שהותירה מאותחלת. לכן, קריש פיברין במבחנה היה מנוצל כאן עבור האקס תרבות vivo כדי typify את ה-ECM הזמנית שהוקמה ב חצרו שהותירה דלקתי של PDR15,21,22. לחלופין, קרישי פיברין יכול להיות בתוספת laminin ו- fibronectin לשנות את היציבות של לבלוב נימים, או explants יכול להיות מוטבע בתוך מסוג קולגן, מטריצות מעורבים אחרים כדי typify את microenvironments ביותר שהותירה ב neovascular רקמות. מטריצות אלה מתאימים בדרך כלל תרבות 3D ו immunofluorescence כולה-הר אבל השפעתם על FTs PDR נשארים להיבדק שיקולים על העיתוי היווצרות מטריקס תלת-ממד יצטרך להיעשות כדי להישאר בגבולות למניעת 2D צמיחה18,19. כאשר הקרבה הפיזית של יחידת המחקר לבית החולים מייצג מגבלה, זמני ההעברה יותר יכול לקבל פיצוי עם עבודת צוות; ת א פתרון הכנה, פיברינוגן סטרילי-סינון ובדיקות פיברין ג'ל היווצרות ניתן לבצע במהלך העברה מטרים. אם ג'לים פיברין לא בצורת גם אחרי שעה, ייתכן שאירעה בעיה עם פיברינוגן או ת א פתרון הכנה. במקרה זה, אינו יכול לשמש את ג'לים מטרים/פיברין.
מגבלות של גישה זו, כמו עם כל לשעבר vivo להתקרב, נמצאים האיכות משתנה של דגימות רקמה העיקרי מעבר אנשים, כמו גם רקמות החולה התוך וסבלני הבין-הטרוגניות. במקרה של חולי סוכרת, חלק ההשתנות כוללת את מידת vascularization, פיברוזיס אשר תלויים בגורמים רבים כמו משך המחלה, מצב מטבולי, גורמים גנטיים/epigenetic, סוג של סוכרת טיפול מערכתית. גודל רגל PDR כירורגי התאושש הוא גם גורם מגביל בקביעת מספר תנאים יכול ייחקרו עבור כל דגימה. תוך מתן מידע מרחבי הדדיים, immunofluorescence כולה-הר מאפשר החקירה של רק כמות מוגבלת של תכונות/סמנים לכל droplet. בתור פשרה, טיפות פיברין יכולים לחלופין להיות מוטבע פרפין, חותכים למקטעים דק ועוברים אימונוהיסטוכימיה.
קיים עכבר סוכרתית מודלים לפתח תכונות רבות של שלב מוקדם ד ר אבל להיכשל באופן מקיף לסכם את השינויים מתקדמת המתרחשים PDR אנושי, ובכך פוגע המחקרים של7,8מנגנוני המחלה PDR. יתר על כן, העין מאתר שונה באופן מהותי מן העין האנושית, כי חסר בו המקולה, בהמשך הדגשת החשיבות של הלומדים את מחלות אנושיות24. FTs PDR כירורגי בעבר או בוטלו, או שימוש עבור מקטעים פרפין, במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת הפנים בלוק טורי, לרשימת תפוצה רצפי RNA או 2D התרבות של תאים חלופה מועדפת3,25 . המודל המתואר במסמך זה מאפשרת אפיון 3D חומר זה ניתוח יקר, כמו גם את חקירת PDR פתופסיולוגיה microenvironment יליד רקמות חולות. בשילוב עם השימוש של נוזל בזגוגית, מודל זה גם מאפשר החקירה של התרומה של שניהם הסלולר, acellular PDR microenvironment. מאז התרבויות להגיב ביעילות ל גורמי גדילה זוהה הזגוגיות, כגון VEGFA, bFGF, VEGFC, TGFβ, ובכך recapitulating תכונות של PDR פתופיזיולוגיה, זו PDR ex-vivo המודל הוא לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים PDR 11. במודל זה, anti-VEGFA מנעו הלבלוב נימי, המושרה סימני רגרסיה נימי, תגובות כי הם תואמים התוצאות הקליניות הצפויות של אנטי-VEGFA טיפול26,27. לכן, מודל זה יכול לשמש גם עבור יותר להבין את ההשפעות של טיפולים שוטפים, כולל טיפולים אנטי-VEGFA, הסטרואידים.
עם מכשור הדמיה לחיות תאים, המתואר במסמך זה שמחוץ המודל יכול יהיה נתון זמן לשגות מיקרוסקופ כדי לאפשר חקירה בזמן אמת של תהליכים כגון כלי דם רגרסיה, נבטי וסלולריות פלסטיות. בשילוב עם דגמים במבחנה ויוו, כמו גם נתונים קליניים, זה ex-vivo PDR דגם יעזור בחקירת תגובות החולה המבוסס על קבוצות מסוימות של זיהוי סמנים, צעד אחד קדימה אבניו עבור אישית רפואה. זיהוי תגובות המטופל הספציפי ו/או סמני תגובה ספציפית היא רלבנטית במיוחד במקרה של PDR, שהיא מחלה multifactorial עם המרצד מורכבים microvascular, ניווניות, מטבולית, גנטי/epigenetic. אימונולוגי, הקשורות דלקת גורמים, וכך מצריכים יותר ויותר רב תחומיים מאמצים לפיתוח של ניהול מיקוד ומחלות טיפולית משופר. חוץ immunofluorescence כולה-הר, לשעבר FTs vivo תרבותי יכול גם להיות מאוחזר פיברין על ידי טיפול nattokinase פלסמין/, נתון transcriptomic פרוטיאומיה מבנית מנתח28. ההתאמה של המודל שתואר בזאת ex-vivo מחקרים של fibrovascular עם רקמות בתנאים עינית אחרים, כגון במקרים חמורים של רטינופתיה חרמשית, יכול להיות גם חוקרים בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים אסירי רשתית רפואי וכירורגי עמיתים, אחיות, כל הצוות של יחידת סוכרת, יחידת הניתוח Vitreoretinal מחלקת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי הלסינקי עבור המשתתפים באופן פעיל בלשכת הגיוס של חולים. אנו מודים Biomedicum יחידת הדמיה מולקולרית על מתקני הדמיה. אנו מודים זולטן צ'רניינקו לסיוע טכני מעולה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים האקדמיה של פינלנד (KL), אוניברסיטת הלסינקי (KL), סיגריד Juselius קרן (KL), קרן ג'והנסון אלבין ק' (KL), מכון הסרטן פינית (KL), קרולינסקה Institutet (KL), פינית העין קרן (SL), עין, קרן בנק רקמות (SL), מרי, קרן Ehrnrooth ג גאורג (SL) ו מענקי מחקר קליני HUCH (TYH2018127 לאחר TYH2016230, SL), לסוכרת (SL, KL, AK, למשל), כמו גם את תכנית הדוקטורט וההתערבות (למשל).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels - Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
