Summary
Her presenterer vi en protokoll for å studere i Patofysiologien ved proliferativ diabetisk retinopati med pasient-avledede, inngrep forbrukeravgift, fibrovascular vev for tredimensjonale innfødt vev karakterisering og ex vivo kultur. Dette ex vivo kultur modell er også mottakelig for testing eller utvikle nye behandlinger.
Abstract
En av årsakene til blindhet i yrkesaktiv alder voksne diabetisk retinopati (DR) er den vanligste mikrovaskulær komplikasjonen av diabetes. Ingen gjeldende dyr modeller av diabetes og oksygen-indusert retinopati utvikle fulltone progressive endringer manifestert i menneskelig proliferativ diabetisk retinopati (PDR). Derfor forståelse av sykdommen patogenesen og patofysiologi har støttet seg hovedsakelig på bruk av histologiske seksjoner og glasslegemet prøver tilnærminger som bare gir stabil informasjon på involvert sykdomsfremkallende faktorer. Økende bevis indikerer at dynamisk celle-celle og celle-ekstracellulær matrix (EFM) interaksjoner i konteksten av tredimensjonale (3D) microenvironments er avgjørende for den mekanistiske og funksjonelle studier mot utviklingen av nye behandling strategier. Derfor hypotesen vi at patologisk fibrovascular vevet inngrep forbrukeravgift fra øynene med PDR kan utnyttes til å pålitelig rakne cellulære og molekylære mekanismer for denne ødeleggende sykdommen og teste potensialet for romanen klinisk intervensjoner. Mot dette formål utviklet vi en ny metode for 3D ex vivo kultur av inngrep forbrukeravgift pasient-avledede fibrovascular vev (FT), som vil tjene som en relevant modell av menneskelig PDR patofysiologi. FTs deles opp i explants og innebygd i fibrin matrise for ex vivo kultur og 3D karakterisering. Hele-mount immunofluorescence opprinnelige FTs og sluttpunktet kulturer kan av vevssammensetning og flercellet prosesser, fremheve betydningen av 3D vev-nivå karakterisering av avdekke relevante funksjoner i PDR patofysiologi. Denne modellen tillater samtidig vurdering av molekylære mekanismer, mobilnettet/vev prosesser og behandlingstiltak i kompleks sammenheng med dynamisk biokjemiske og fysiske interaksjoner i PDR vev arkitekturen og microenvironment. Siden denne modellen viser PDR patofysiologi, vil det også være mottakelig for testing eller utvikle nye behandlinger.
Introduction
DR er en alvorlig okulær komplikasjoner av diabetes, en sykdom som har nådd enorme proporsjoner i de siste tre tiårene1. Tyve år etter diagnose, nesten hver pasient med type 1 diabetes og 60% av pasienter med type 2 diabetes stede tegn på retinopati, gjør diabetes sådan en av årsakene til blindhet i arbeider age voksne2. Ifølge nivået på mikrovaskulær degenerasjon og iskemiske skader, er DR klassifisert i ikke-proliferativ DR (ikke-PDR) og proliferativ DR (PDR). Sluttstadiet sykdommen, PDR, er preget av ischemia - og betennelse-indusert neovascularization og fibrotiske svar på vitreoretinal grensesnittet. I ubehandlet forhold, vil disse prosessene føre til blindhet glasslegemet blødning, netthinnen fibrose, tractional Netthinneavløsning og neovascular glaukom3,4. Til tross for nylige fremskritt mål gjeldende behandlingstilbud bare DR stadier, inkludert diabetiker macula ødem og PDR, retinal skade har allerede fulgte. Videre nytte en stor andel av DR pasienter ikke fra gjeldende behandling armamentarium, som angir et presserende behov for bedre behandling4,5,6.
Flere andre jegn vivo sykdom/utviklingsmessige modeller og diabetiker dyremodeller har vært utviklet ennå, men ingen av dem viser hele omfanget av patologisk funksjoner i menneskelig PDR7,8. Videre indikerer økende bevis at behandlingstiltak er tett koblet til ECM sammensetningen samt romlige arrangement og samspill mellom mobilnettet og acellular microenvironment9. Vi er derfor å utvikle en klinisk relevante modell av menneskelig PDR ved å benytte FT patologisk materialet som er vanlig forbrukeravgift fra øynene under vitrectomy som en del av kirurgisk behandling av PDR10.
Dette manuskriptet beskriver protokollen for 3D ex vivo kultur og karakterisering av de kirurgisk-forbrukeravgift, PDR pasient-avledede patologisk FT. Metoden beskrevet her har vært brukt i en fersk publikasjon som vellykket dekonstruksjon av innfødte 3D PDR vev landskapet og recapitulation av funksjonene i PDR patofysiologi inkludert angiogenic og fibrotiske svar av unormale vaskulære strukturer11. Denne modellen har også avdekket romanen funksjoner som ikke kan lett nytes fra tynne histologiske seksjoner, som romlig begrenset apoptose og spredning samt vaskulær Holme formasjon11. Glasslegemet væske har blitt brukt av andre 3D endothelial spheroid kulturer å evaluere sin angiogenic potensielle og effekten av angiostatic molekyler12. Kombinert med en i vitro 3D lymfatisk endothelial celle (LEC) spheroid spirende analysen bruker PDR glasslegemet som stimulerende, viste vår modell bidrag av både løselig vitreal faktorer så vel som lokale stikkordene i det neovascular vev som men dårlig forstått LEC engasjement i PDR patofysiologi3,11. I forvaltningen av PDR er vitreoretinal kirurgi en rutinemessig utført ennå utfordrende prosedyre. Som kirurgisk instrumentations og teknikker ser kontinuerlig utvikling og raffinement, tidsriktig og konservative fjerning av fibrovascular proliferativ ikke bare forbedrer visjon resultatet, men gir også uvurderlig vev materiale for den undersøkelse av PDR patofysiologi og behandling svar i komplekse translasjonsforskning aspekter av det levende menneskelige vev microenvironment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskningen ble godkjent av institusjonelle Review Board og etiske komité i Helsinki University Hospital. Signert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
1. forberedelse av løsninger, Media og utstyr
- Klargjør følgende utstyr før samling av fibrovascular vev (FT) å sikre rask behandling.
- Sterile-autoklav to microdissection pinsett.
- Klargjør 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) ved oppløsning 1 pre vektet PBS tavle (0,14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0,010 M PO4-3) i 900 mL deionisert vann og røre å oppløse. Lydstyrken vann opptil 1 L og sterile-autoklav klar løsningen. Butikken på RT.
- Samle ovennevnte løsningen og utstyr i en kurv, sammen med en engangs sterilt skalpell, en steril 6 cm celle kultur parabol og fem sterilt 12-vel celle kultur plater.
- Forberede en 6 mg/mL fibrinogen løsning i Hanks balansert Salt løsning (HBSS) ved å løse opp 30 mg av plasminogen-utarmet menneskelige fibrinogen i 5 mL av HBSS, med en 50 mL tube nedsenket i et vannbad på 37 ° C, minst 1 time.
Merk: Denne løsningen kan holdes i vannbad (37 ° C) 7 h (maksimalt 10 h) før bruk. - Forberede ex vivo kultur medium ved å legge til 5% fosterets kalv serum (FCS) eller 5% humant serum, 0,4% endothelial celle vekst supplement, 10 ng/mL rekombinant menneskelige epidermal vekstfaktor, 1 μg/mL hydrocortisone og 50 μg/mL gentamycin til kommersielt tilgjengelig endothelial celle vekst medium og holde i vannbad på 37 ° C før bruk. Lagre ved 4 ° C i opptil en måned.
2. fibrovascular vev disseksjon
- Samle fibrovascular vev (FT) som har vært forbrukeravgift fra forsøkspersoner gjennomgår trans-conjunctival microincision vitreoretinal kirurgi, etter 23 eller 20 gauge tredelt pars plana vitrectomy som en del av den vitreoretinal kirurgisk behandling av PDR.
Merk: FT er forbrukeravgift segmentering og delaminering, kutte om nødvendig med microscissors, og fjernet fra glasslegemet hulrommet med intraokulært slutten-gripende microforceps av erfarne vitreoretinal kirurg. Ekstreme omsorg må tas for å fjerne intakt, uskadet FT uten forårsaker skade på okulær strukturer inkludert synsnerven eller temporal vaskulær arcade der patologisk neovascular vev er vanligvis plassert. Forbrukeravgift vevet er variabel, vanligvis varierer mellom 3 og 50 mm2. - Hold FT i 6 cm celle kultur parabol eller 1,5 mL tube som inneholder 1 mL steril PBS plassert på våt is, og overføre den umiddelbart til forskning laboratorium for behandling.
Merk: Det er viktig at research unit (lab fasiliteter) er fysisk nær operasjonssalen sykehus (OR) å redusere overføringstiden som oppgis av små forbrukeravgift FT. I dette tilfellet overføringen tar mindre enn 5 minutter og explants er innebygd i fibrin vanligvis i 1-1,5 t (maksimalt 2 timer) etter kirurgisk fjerning. Virkningen av lengre Overføringstidene på 3D kultur må testes. - Plasser FT i en 6 cm celle kultur parabol med 1 mL av PBS ved romtemperatur (RT, 25 ° C) og hente bilder av vev med en omvendt epifluorescence mikroskop med et 5 x mål.
Merk: Bilder er ervervet for kvalitativ vurdering og dokumentasjon. Det vil være mulig å observere vev størrelse, tetthet og generell komposisjon (f.eks vaskulære strukturer). - Skjær FT i ~ 1 mm2 stykker under en oppreist disseksjon stereomicroscope, ved hjelp av et sterilt skalpell og microdissection pinsett. Hold vevet, godt neddykket i PBS, i stedet bruker en microdissection tweezer, og utføre klare kutt bruker sterilt skalpell. Unngå rive FT, da dette ville endre de opprinnelige fibrovascular strukturene.
- Plass enkelte brikke i et godt av en 12-vel celle kultur plate inneholder 1 mL steril PBS.
Merk: Hvis nødvendig, forsiktig spre FT på platen, ved hjelp av microdissection pinsett, før du utfører kutt.
3. casting oppreist Fibrin Gel dråper for karakterisering av innfødte FT og Ex Vivo kultur
- Sterile-filter klar fibrinogen løsningen i trinn 1.2 med en 0.22 μm filter montert i en 10 mL sprøyte.
- Forbered dele fibrinogen løsningen (25 μL per 1,5 mL tube) og holde på RT. forberede en aliquot til fibrin gel / hver FT bit innhentet etter dissection og et par ekstra dele for å teste fibrin gel formasjon.
- Forberede en løsning av HBSS inneholder 4 enheter/mL trombin og 400 μg/mL aprotinin, kalles heretter TA løsning, og holde på RT. forberede så mye tas løsning etter behov, avhengig av antall brikker innhentet etter disseksjon (25 μL tas løsning brukes for hver FT/fibrin gel), og et ekstra beløp (f.eks 250 μL) for testing fibrin gel dannelse og at nok løsning er tilgjengelig i støping av fibrin gel dråper.
Merk: Trombin er nødvendig for fibrin polymerisasjon mens aprotinin legges til hindre nedbrytning av fibrin gel av mobilnettet proteaser uttrykt av FTs13,14. - Teste tidspunktet for fibrin gel formasjon: legge til 25 μL tas løsning til aliquoted 25 μL fibrinogen løsning i trinn 3.2 og bruker en pipette satt til 50 μL, bland i røret av pipettering og dispensere i en 6 cm celle kultur parabol , danner en oppreist slippverktøy.
Merk: Fibrin gel dannelsen bør skje i ~ 1 min. Dette tar over 1,5 min, kan konsentrasjonen av trombin i TA løsningen i trinn 3.3 økes ved å legge mer trombin lagerløsning. En tiendedel av opprinnelig brukt volumet av trombin lagerløsning kan gjentatte ganger, legges til fibrin gel dannelsen oppstår innen 1,5 min. Tidspunktet for fibrin gel formasjon er avgjørende for tre dimensionality of kulturen, som rask gel dannelse (innen 1,5 minutter) forhindrer FT stykket fra synker til bunnen av fibrin gel, og dermed kommer i kontakt med 2D plast overflaten av cellen kultur plate, som kan føre til 2D celleadhesjon og resultatet. - Plassere en FT stykke i midten av en brønn av en 24-vel plate med en bakteriefri tweezer og fjerne alle overflødig PBS ved pipettering med en 0,5-10 μL pipette å unngå å suge på FT. I tilfelle av vev kleber seg til tweezer, bruk en ekstra tweezer for å hjelpe plasseringen av vev stykket på tallerkenen.
Merk: FT/fibrin gels kan også brukes på 48-vel plate å redusere bruken av reagenser. Dette er imidlertid mer utfordrende som plassen er mer begrenset og fibrin vil spre hvis det kommer i kontakt med godt veggen. - Legg 25 μL tas løsning til 25 μL fibrinogen løsning aliquoted i trinn 3.2, og bruker en pipette satt til 50 μL blanding i røret av pipettering. Støte inn i FT stykket plassert på platen godt, og pipette opp og ned 2 - 3 ganger for å inkludere FT stykket i oppreist slippverktøyet, gir en 3D omkringliggende matrise til FT.
Merk: Kontroller at FT ikke er pustende under pipettering og at ingen luftbobler dannes. Kontroller også at miksing, dispensasjon og pipettering utføres raskt som fibrin gel vil danne innen 1,5 min, som testet i trinn 3.4. Hvis støping fibrin gels på 48-vel plate, bruk 20 μL fibrinogen løsning og 20 μL tas løsning. - Gjenta trinn 3.5 og 3.6 for alle FT bitene.
- Tillate fibrin geléer å stivne av rugende plater i en celle kultur inkubator på 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO2.
- Etter 0,5-1 vippe h, kontroller at fibrin gel er helt dannet av nøye platen. Fortsett med trinn 3.10 når gel ikke flyttes når platen holdes på skrå, som angir at fibrin gel dannelsen er fullført.
- Overlegg i FT/fibrin gels med ex vivo kultur medium (600 μL/vel i 24-vel plate) eller 300 μL/brønn i 48-vel plate med 100 μg/mL aprotinin. Pipetter mediet forsiktig av drop-wise dispensasjon.
Merk: Her aprotinin brukes til å hindre nedbrytning av fibrin gel av mobilnettet proteaser uttrykt av FTs13,14. Den ex vivo kultur medium kan i tillegg suppleres med rekombinant vekstfaktorer, som VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (se Tabell for materiale)11. - Plass FT ex vivo kultur plate tilbake i 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator og kultur for den ønskede tidsperioden (f.eks2 - 18 dager, lengre kultur perioder må testes). Erstatte 50% av mediet med friske ex vivo kultur medium hver tredje dag.
4. "i Matrix" Imaging
- Hente bilder av FT ex vivo kulturer på samme dag (dag 0) og ved angitte intervaller (f.eks annenhver dag), bruker et omvendt epifluorescence mikroskop, for å kunne følge 3D veksten.
Merk: Bilder innhentet kan brukes for kvantifisering av FT resultatet som den totale lengden på to vinkelrett diameter over explant11.
5. innfødt FT og Ex Vivo kultur sluttpunktet
Merk: FT/fibrin geléer kan kultivert ex vivo for den ønskede tidsperioden (FT ex vivo kulturer) eller fast på samme dag (native FT) for innfødte FT karakterisering11.
- Fastsette innfødt FT eller FT ex vivo kulturer av erstatter kultur medium med 1 mL/vel av 4% paraformaldehyde i PBS løsningen 1t på RT. For de opprinnelige FT/fibrin geleer, fikse 0,5-1 h etter ex vivo kultur medium (hvis fibrin gels ikke har blitt dynket i medium, fiksering vil skade dem).
Merk: Utføre dette trinnet i avtrekksvifte som paraformaldehyde er etsende, giftige og kreftfremkallende. - Skyll FT/fibrin gels med tre 5 min vasker i PBS (2 mL/vel).
- Erstatt PBS med 2 mL/vel av PBS inneholder 0.02% Natriumazid og lagre fast fibrin geléer på 4 ° C før videre behandling. Forsegle platene med parafin film å sikre at FT/fibrin geléer ikke tørr i lagring.
Merk: Utføre dette trinnet i avtrekksvifte Natriumazid er giftig.
6. hele-Mount Immunofluorescence flekker
Merk: Denne protokollen varer 5 dager og kan avbrytes med overnatting incubations der det er angitt. Ikke la fibrin gels tørr når som helst. Alle trinnene utføres på RT med mindre annet er angitt.
- Klargjør følgende løsninger før du starter fargeprotokoll.
- Etter fiksering løsning: forberede 50/50 aceton: metanol løsning ved å blande like mye aceton og metanol (f.eks 50 mL). Butikken på 20 ° C. Klargjør denne løsningen siste på dagen før den flekker. Denne løsningen kan lagres tilbake på 20 ° C og brukes for påfølgende stainings.
Merk: Forberede denne løsningen i avtrekksvifte som aceton og metanol er lettantennelige og helsefarlige. - Blokkerer løsning: forberede en 15% fosterets bovin serum (FBS), 0,3% octyl fenol ethoxylate løsning på PBS med første legge 15% FBS til PBS. Legg octyl fenol ethoxylate og hisse for å oppløse. Butikken på 4 ° C.
Merk: Denne løsningen kan tilberedes i store mengder på forhånd, lagret i 15 mL aliquotes på 20 ° C og tint før bruk, dagen når fargeprotokoll startes. Bruk en nylaget eller ferske tinte alikvoterer for hver fargeprotokoll. - Vask løsning: forberede 1 L PBS supplert med 0.45% octyl fenol ethoxylate ved å legge til 4,5 mL octyl fenol ethoxylate 995.5 mL PBS. Hisse for å oppløse. Butikken på RT.
- Etter fiksering løsning: forberede 50/50 aceton: metanol løsning ved å blande like mye aceton og metanol (f.eks 50 mL). Butikken på 20 ° C. Klargjør denne løsningen siste på dagen før den flekker. Denne løsningen kan lagres tilbake på 20 ° C og brukes for påfølgende stainings.
- Løft opp dråpene nøye fra platen ved å bruke en rustfritt stål square kanter slikkepott. Koble slippverktøyet først fra kantene løfter sentrum, og overføre til et godt av 12-vel plate som inneholder 1 mL av PBS.
Merk: Utfør etter fiksering, vasker og blokkerer trinnene i dette plate-formatet. - Etter fikse dråper med 1 mL iskald 50/50 aceton: metanol i ~ 1 min (kantlinjen på dråpene vil slå hvit).
Merk: Utføre dette trinnet i avtrekksvifte som aceton og metanol er farlig for helsen. - Skyll med 3-5 vasker i 2 mL PBS (dråpene vil synke i PBS løsningen når utvanning er fullført).
Merk: Unngå å berøre dråper med Pipetter spissen som, etter post fiksering, de er trege til plast. Hele protokollen, unngå aspirating etter-posisjonsavlesning, antistoff, blokkering og vaske løsninger ved å suge, så dette kan skade eller ødelegge dråpene. I stedet vipper platen og fjern forsiktig løsninger ved hjelp av en 500-5000 μL pipette. - Sentrifuge blokkerer løsningen i 15 min på 21000 x g og 4 ° C for å fjerne rester.
Merk: Løsningen kan være aliquoted i 1,5 mL rør for sentrifugering. Ubrukte løsningen kan lagres på 4 ° C og brukes for alle relevante fremgangsmåten. - Inkuber dråper i 500 μL blokkerer løsning for 2t på RT.
Merk: For å redusere volumet av blokkering løsning brukes,-plate, kan vippes på en støtte og så lite som 300 μL løsning/slippverktøy kan brukes. - Forbered den primære antistoff blandingen (minst 30 μL/slippverktøy) på aktuelle fortynning i blokkering løsning og sentrifuge for 15 min 21000 x g og 4 ° C.
- Overføre dråper i runde (U)-bunn 96-brønns plate ved hjelp av en runde kanter slikkepott og ruge med minst 30 μL/dråpe primære antistoff blandingen overnatting på 4 ° C.
- På dagen overføring dråper i 12-vel plate inneholder 2 mL vaske løsning/Vel, vasker skyll med tre 5 min først og deretter med ni 30 min vasker. La siste vask (2 mL) over natten på 4 ° C.
- Dagen, skyll tre ganger med PBS og overføre dråper i runde (U)-bunn 96-brønns plate.
- Under vasker, forberede riktig fluorophore-konjugerte sekundære antistoff blandingen (utvannet 1:500, minst 30 μL/slippverktøy) i blokkering løsning og sentrifuger i 15 min på 21000 x g og 4 ° C.
- Overføre dråpene til en runde (U)-bunnen 96-brønns plate ved hjelp av en runde kanter slikkepott og ruge med minst 30 μL sekundære antistoff blandingen, 4 h på RT, beskyttet mot lyset.
Merk: Utføre alle etterfølgende incubations og vask skritt beskyttet mot lyset. - Overføre dråpene til 12-vel plate inneholder 2 mL av vask løsning/godt med en runde kanter slikkepott, skyll med tre 5 min vasker først og deretter med fire 30 min vasker. La siste vask (2 mL) over natten på 4 ° C.
- Dagen, skyll gels med fem 30 min vasker og deretter tre ganger med PBS. La siste vask (2 mL) over natten på 4 ° C.
- Dagen, overføre dråpene til en runde (U)-bunn 96-brønns plate ved hjelp av en runde kanter spatula og counterstain kjerner ved rugende med 10 μg/mL Hoechst kjernefysiske flekk (minst 30 μL/slippverktøy) i 30 minutter på RT.
Merk: Montering medium med 4', kan 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for kjerner counterstaining også brukes. I så fall dette trinnet og trinn 6.16 hoppes, går direkte til trinn 6.17. - Overføre dråpene til 12-vel plate inneholder 2 mL PBS/godt med en runde kanter slikkepott og skyll tre ganger med PBS.
- Monter dråpene på microscope skyve som følger:
- Påfør et smalt lag med quick-herding montering medium på kantene av en firkantet 22 x 22 mm coverglass og la tørke ~ 1 minutt. Utføre dette trinnet for hver dråpe, for å unngå overdreven herding av montering medium.
Merk: Utføre dette trinnet i avtrekksvifte idet rask-herding montering mediet er farlig for helsen. - Skyll slippverktøyet av dipping i en godt av en 12-vel plate som inneholder 2 mL deionisert vann og overføre på et mikroskop lysbilde, bruker en runde kanter slikkepott. Fjern overflødig vann ved hjelp av et lite stykke tørkepapir.
- Dispensere 15 μL av ikke-herding antifade montering medium på slippverktøyet.
Merk: Alternativt, hvis Hoechst kjernefysiske flekken ikke er brukt, montering medium som inneholder 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kan brukes. - Forsiktig plassere dekket glasset, med rask-herding montering mediet mot mikroskopiske lysbildet over slippverktøyet og la bosette.
Merk: Rask-herding mediet vil holde seg til mikroskopiske lysbildet og holde slippverktøyet på plass.
- Påfør et smalt lag med quick-herding montering medium på kantene av en firkantet 22 x 22 mm coverglass og la tørke ~ 1 minutt. Utføre dette trinnet for hver dråpe, for å unngå overdreven herding av montering medium.
- Gjenta trinn 6.17 for alle dråper. Montere to dråper på hver microscope skyve.
- La lysbildene air-dry på RT ~ 2 h og lagre på 4 ° C over natten. Kontroller at lysbildene er plassert vannrett og beskyttet mot lyset.
- Bildet farget native eller sluttpunktet FT ex vivo kulturer AC confocal mikroskop eller en oppreist epifluorescence mikroskop utstyrt med en optisk snitting funksjon og 20 x eller 40 x mål. Bruk flis-funksjonen til å fange opp et større område av vev samtidig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dypere forståelse av PDR fibrovascular vev egenskaper og protein uttrykk er basert hovedsakelig på glasslegemet prøver og tynn histologiske FT punkt3,15,16,17. Å utvikle en metode for grundig undersøkelse av 3D vev organisasjonen og flercellet physiopathological prosesser av PDR, setter vi opp for å utnytte den inngrep forbrukeravgift, avledede pasient-patologisk FTs for 3D karakterisering og ex vivo kultur. De ferske FTs overført til forskningslaboratoriet og behandlet som vist skjematisk arbeidsflyten i figur 1.
FTs kan avbildes før disseksjon for kvalitativ vurdering og dokumentasjon (figur 2). Som vist i figur 2, viser FTs stor Inter pasienten variasjon i størrelse, tetthet og overflod av vaskulære strukturer. I noen vev, løs celler, antagelig inflammatorisk/immun celler eller røde blodlegemer, likeledes idet pervious vaskulære strukturer av annet kaliber kan også være enkelt utmerket (figur 2). Etter disseksjon må en beslutning gjøres på nedstrøms bruken av begrenser antall fått explants. En del av explants er innebygd i fibrin matrise og fast etter fibrin gel formasjon mens de resterende explants kan utsettes for ex vivo kultur på en separat plate (figur 1). De ferske FTs har også vært vellykket brukes for ultrastructural karakterisering av elektronmikroskop. Eksemplene kan være enten behandlet for konvensjonelle overføring elektronmikroskop (TEM) ultrathin deler eller seriell blokk ansikt-skanning elektronmikroskop (SBF-SEM)3,11.
Fast fibrin geléer kan lagres i flere uker og farget av hele-mount immunofluorescence18,19. Farget prøvene er likeledes stabile når lagret på 4 ° C i mørket. Tykk FT/fibrin geléer kan avbildes tid effektivt med epifluorescence mikroskop utstyrt med en optisk snitting funksjon, for å fjerne spredt ut-av-fokusere lys. Bildebehandling med denne metoden gir fine visualisering av strukturer. Alternativt AC confocal mikroskopi, om mer tid-krevende, kan tillate fangst av finere detaljer. Karakterisering av fersk fibrin-embedded og fast, uncultured, opprinnelige FTs av hele-mount immunofluorescence lar karakterisering av vaskulære strukturer, flere celletyper og deres gjensidige arrangement i 3D PDR vevet liggende11. For eksempel CD31 antistoffer kan brukes til å vise endotelet og NG2 å vise pericytes (Figur 3) mens Lyve1 antistoffer visualisere nylig oppdaget lymfatiske-lignende endothelial strukturer (Figur 4)11. Flere kombinasjoner av antistoffer kan brukes til å visualisere flere strukturer og celletyper (se Tabell for materiale); for eksempel kan ERG også visualisere endotelet, som har et discontinuos uttrykksmønster i den unormale PDR neovasculature. Vaskulære strukturer med en membran markør (f.eksCD31 og Lyve1) som kan analyseres kvantitativt for bevaring og tetthet, ved hjelp av Angiotool, en fri kildekode programvare utviklet av National Cancer Institute for NIH11, 20. 3D volumer kan også gjengis fra dataset innhentet (se Video 1). Hvis et antistoff ikke passer for hele-mount immunofluorescence, kan fibrin dråpene også innebygd i parafin, skjær tynne delene og analyseres av immunhistokjemi. I dette tilfellet nytte dråpene overnatting fiksering på 4 ° C i stedet for 1 h på RT.
Ex vivo opprettholder kultur veksten av fibrin-embedded FTs, utvikle mobilnettet utvekster allerede etter to dager (figur 5). I vitro fibrin gel brukes som matrix for ex vivo kultur, siden det er typisk i vivo provisoriske ECM, dannet etter trombin spalting av serum fibrinogen ved vaskulær lekkasje, i direkte kontakt med den lekk PDR neovessels i den betent fibrotiske miljøet15,21,22.
PDR er en mikrovaskulær komplikasjon preget av en angiogenic og fibrotiske svar og FT explants beholde denne mobilnettet repertoar i kultur, samt å reagere effektivt på ytre stimuli til kultur medier11. Representant dataene i figur 6 viser at PDR ex vivo kulturer indusert spirende av CD31-positive endotelet og blodkar bevaring svar på VEGFA, mens TGFβ indusert fibrotiske svar reflektert av resultatet NG2-positive pericytes/SMCs. Flere ytre stimuli kan testes og, når informert av målinger av sin i vivo vitreal overflod, den her utviklet PDR ex vivo kultur modell kan avsløre romanen microenvironment og kontekst avhengige PDR patologisk mekanismer som ikke kan visualisert i fast vev materiale.
Figur 1. Ex vivo PDR fibrovascular vev kultur modell. Skjematisk fremstilling av arbeidsflyten fra vitreoretinal kirurgi (pars plana vitrectomy) for excision av FT sin disseksjon i explants og innebygging i fibrin for tredimensjonale karakterisering og ex vivo kultur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fersk forbrukeravgift PDR fibrovascular vev før disseksjon. Fase contast micrographs av fersk forbrukeravgift FTs tatt før disseksjon. FTs er svært variabel størrelse, tetthet og overflod av vaskulære strukturer. Pilspisser angir vaskulære strukturer av annet kaliber. Den røde delvis gjennomsiktig linjen høydepunkter to enkeltskip av annet kaliber. Bildene ble tatt med en omvendt epifluorescence mikroskop med 5 x, 0,15 numeriske blenderåpning (NA), mål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Hele-mount immunofluorescence av en innfødt PDR fibrovascular vev. Epifluorescence mikroskop-bilde av en innfødt PDR FT farget av hele-mount immunofluorescence. CD31 (A, grønn) visualiserer endotelet mens NG2 (B, rød) visualiserer pericytes i uregelmessige neovascular strukturer. Flettede bilder vises i (C). DAPI (blå) counterstain visualiserer kjerner. Bildet ble tatt med en stående epifluorescence mikroskop med optisk snitting funksjon og kombinert med en datastyrt 1,3 megapiksler monokrom CCD kamera og bilde oppkjøpet programvare, bruker en 40 x, 1,4 NA, oljeobjektiv. Ni optisk deler var kombineres ved hjelp bildebehandling ImageJ. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Hele-mount immunofluorescence av en innfødt PDR fibrovascular vev. Epifluorescence mikroskop-bilde av en innfødt PDR FT farget av hele-mount immunofluorescence. CD31 (A, grønn) visualiserer endotelet mens Lyve1 (B, rød) visualiserer nyoppdagede lymfatiske-lignende endothelial strukturer. Flettede bilder vises i (C). Hoechst-33342 (blå) counterstain visualiserer kjerner. Bildet ble tatt med en stående epifluorescence mikroskop med optisk snitting funksjon og kombinert med en datastyrt 1,3 megapiksler monokrom CCD kamera og oppkjøp programvare, ved hjelp av en 20 x 0,8 NA, målsetting. Fire optiske deler var kombineres ved hjelp bildebehandling ImageJ. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Ex vivo vekst av PDR fibrovascular vev. Fase kontrast micrographs to FT ex vivo kulturer på angitt tidspunkt (dag). FTs vokser ex vivo kultur, utvikle mobilnettet utvekster allerede etter to dager. Bildene ble tatt med en omvendt epifluorescence mikroskop med et 5 x, 0,15 NA, mål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Hele-mount immunofluorescence PDR fibrovascular vev kultivert ex vivo ubehandlet (CTRL) eller VEGFA eller TGFβ. Epifluorescence mikroskop-bilde av FT kultivert ex vivo ubehandlet (CTRL) eller i VEGFA eller TGFβ for 9 dager og deretter farget av hele-mount immunofluorescence. CD31 (grønn) visualiserer endotelet mens NG2 (rød) visualiserer pericytes. DAPI (blå) counterstain visualiserer kjerner. VEGFA stabilisert er blodkar mens TGFβ indusert fibrotiske svar. Bildene ble tatt med en stående epifluorescence mikroskop med optisk snitting funksjonen og kombinert med en datastyrt 1,3 megapiksler monokrom CCD kamera og oppkjøp programvare, ved hjelp av en 20 x 0,8 NA, målsetting. Ni optisk deler var kombineres ved hjelp bildebehandling ImageJ. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1. 3D-volum rekonstruksjon av en innfødt FT farget av hele-mount immunofluorescence. CD31 (grønn), Lyve1 (rød). Hoechst-33342 counterstain (blå) visualiserer kjerner. Bildet ble tatt med en stående epifluorescence mikroskop med optisk snitting funksjon og kombinert med en datastyrt 1,3 megapiksler monokrom CCD kamera og oppkjøp programvare, ved hjelp av en 20 x 0,8 NA, målsetting. 3D-volum gjenoppbygging og videogjengivelse ble utført ved hjelp av en kommersiell programvare. En del av videoen er gjengitt med tillatelse fra Gucciardo et al. 11. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vurderer betydningen av relevante vev microenvironment for pålitelig funksjonelle cellen og molekylære mekanistisk resultater er det viktig å finne passende eksperimentelle modeller som gir dette vev-miljøet. Her beskrives ex vivo PDR kultur modell for fibrin-embedded FTs lar etterforskningen av mekanismer for PDR patofysiologi i innfødte, komplekse og flercellet sammenheng PDR klinisk prøvene.
Avgjørende skritt i protokollen er riktig fibrin gel dannelsen, plasseringen av FT og tilstrekkelig vask under den flekker. Siden fibrin gel formasjon avhenger mest på trombin aktiviteten, påvirket av konsentrasjon og temperatur, må mengden trombin justeres for hver gruppe med fibrin gel forberedelse. Fibrin gel formasjon bør være raske nok til å hindre 2D veksten av FT explants men også treg nok til at plasseringen av FT til midten av dråpene vertikalt og horisontalt. I tilfellet FT skjer å finne på kanten av slippverktøyet kan ekstra pipettering hjelpe plasseringen av FT til sentrum. FTs som fortsatt ytterst på dråpene eller som vokser i 2D må ekskluderes. Tilstrekkelig vask under farging og unngå tørking av dråpene er igjen kritiske for å optimalisere flekker og minimere bakgrunn signal. Overføringstidene kan også være avgjørende. Vi har innebygd FTs opp til to timer etter vitrectomy og dette ikke påvirke ex vivo vekst. Virkningen av lengre Overføringstidene kultur suksessen må testes.
Denne protokollen kan endres ved hjelp av alternative matriser for FT innebygging. In vivo, PDR neovessels vokse mot glasslegemet cortex rike i kollagen23. Men på vaskulær lekkasje serum komponenter, inkludert fibrinogen, oppløses i glasslegemet i nærheten fartøyene der fibrotiske svaret startes. Derfor i vitro fibrin blodpropp ble benyttet her ex vivo kultur for å typisk provisoriske ECM dannet i betente fibrotiske miljøet PDR15,21,22. Alternativt fibrin clots kan suppleres med laminin og fibronectin å endre stabiliteten av spirende kapillærene, eller explants kan være innebygd i type I-kollagen og andre blandede matriser til typisk de mest fibrotiske microenvironments i neovascular vev. Disse matriser er generelt egnet for 3D kultur og hele-mount immunofluorescence men påvirker PDR FTs gjenstår å bli testet og betraktninger om timingen av 3D matrix formasjon må foretas for å holde seg innenfor grensene for å hindre 2D vekst18,19. Når research unit fysisk nærhet til sykehuset representerer en begrensning, kan lengre Overføringstidene kompenseres med teamarbeid; TA løsning forberedelse, fibrinogen sterilt-filtrering og fibrin gel formasjonstestet kan utføres under FT overføring. Hvis fibrin geléer ikke utgjør selv etter 1 time, kan det ha oppstått et problem med fibrinogen eller TA løsning forberedelse. I dette tilfellet kan ikke FT/fibrin geléer brukes.
Begrensninger av denne tilnærmingen, som med alle ex vivo tilnærming, er variabel kvaliteten av primære vev over personer samt intra tålmodig og mellom pasienten vev heterogenitet. Ved diabetespasienter omfatter denne variasjonen omfanget av endometrial blodkar og fibrose som avhenger av mange faktorer som varigheten av sykdommen, metabolske tilstand, genetisk/epigenetic faktorer, diabetes og systemiske terapi. Størrelsen på kirurgisk PDR FT gjenopprettet er også en begrensende faktor i å bestemme antall betingelser som kan undersøkes for hver prøven. Samtidig som gjensidige romlig informasjon, lar hele-mount immunofluorescence etterforskningen av bare en begrenset mengde funksjoner/markører per slippverktøy. Kompromisset fibrin dråpene kan også bygges inn i parafin, skjær tynne delene og analysert av immunhistokjemi.
Eksisterende diabetiker musen modeller utvikle mange funksjoner i tidlig stadium DR men ikke omfattende recapitulate progressiv endringene skjer i menneskelig PDR, dermed hindre studier av PDR sykdom mekanismer7,8. Videre er murine øyet fundamentalt forskjellig fra det menneskelige øyet, i at det mangler makula, ytterligere understreker viktigheten av studerer menneskelig sykdom24. Den kirurgiske PDR FTs enten tidligere er forkastet eller brukt for parafinsnitt, overføring elektronmikroskop, seriell blokk ansikt-skanning elektronmikroskop, bulk RNA sekvensering eller 2D kultur dissosiert celler3,25 . Her beskrives modellen gir 3D karakterisering av denne dyrebare kirurgisk materialet og etterforskning av PDR patofysiologi i den opprinnelige syke vev microenvironment. Når kombinert med bruk av glasslegemet væske, kan denne modellen også etterforskningen av bidrag fra både den cellulære og acellular PDR microenvironment. Siden kulturer reagere effektivt til vekstfaktorer oppdaget i linsen, som VEGFA, bFGF, er VEGFC og TGFβ, dermed recapitulating funksjoner i PDR patofysiologi, denne PDR ex vivo kultur modell mottakelig for testing eller utvikle nye PDR behandlinger 11. i denne modellen, anti-VEGFA hindret kapillær spirende og indusert tegn på kapillære regresjon, svar som stemmer overens med de forventede kliniske utfallene anti-VEGFA behandling26,27. Denne modellen kan derfor også brukes for å bedre forstå virkningen av gjeldende behandlinger, inkludert anti-VEGFA og kortikosteroid.
Med live-celle tenkelig instrumentering, her beskrevet ex vivo kultur modellen kan bli utsatt for time-lapse mikroskopi tillate sanntid undersøkelse av prosesser som vaskulær regresjon, spirende og cellulær plastisitet. Kombinert med i vitro og in vivo modeller, samt kliniske data, dette ex vivo PDR modell vil hjelpe i gransker pasient svar basert på bestemte sett identifisere markører, et skritt nærmere å avenue for personlig medisin. Identifisere pasient-spesifikke tiltak og/eller svar-spesifikke indikatorer er spesielt relevant i PDR, som er en multifaktoriell sykdom med et komplekst samspill av mikrovaskulær, nevrodegenerative, metabolsk, genetisk/epigenetic, immunologiske og betennelse-relaterte faktorer, dermed krever stadig tverrfaglige innsatsen for utvikling av forbedret terapeutiske mål og sykdom. Foruten hele-mount immunofluorescence analyserer ex vivo kultivert FTs kan også være Hentet fra fibrin av plasmin/nattokinase behandling og utsatt for transcriptomic og proteomic28. Hensiktsmessigheten av her beskrevet modell for ex vivo studier av fibrovascular vev utviklet i andre okulær tilstander, slik som i alvorlige tilfeller av sigd celle retinopati, kan også bli undersøkt i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er mest takknemlig til medisinsk og kirurgisk netthinnen kolleger, sykepleiere og av diabetiker enheten og Vitreoretinal kirurgi enhet ved Institutt for Oftalmologi, Helsinki University Hospital for å aktivt delta i rekrutteringen pasienter. Vi takker Biomedicum molekylær Imaging enheten for imaging anlegg. Vi takker Anastasiya Chernenko for utmerket kundestøtte. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Academy i Finland (KL), Universitetet i Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), finsk Cancer Institute (KL), Karolinska Institutet (KL), finsk øye Foundation (SL), øyne og Vev Bank Foundation (SL), Mary og Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) og HUCH klinisk forskning tilskudd (TYH2018127 etter TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) samt doktorgradsprogram i biomedisin (EG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels - Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
