Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at konstruere lab-skala boble kolonne photobioreactors og bruge dem til kultur mikroalger. Det giver også en metode til bestemmelse af kultur vækstrate og neutral lipid indhold.
Abstract
Der er betydelig interesse for studiet af mikroalger til engineering applikationer såsom fremstilling af biobrændsel, højværdiprodukter, og til behandling af affald. Som de fleste nye forskningsindsats begynder på laboratoriet skala, er der behov for omkostningseffektive metoder til dyrkning mikroalger på en reproducerbar måde. Her, kommunikerer vi en effektiv tilgang til kultur mikroalger i laboratoriet-skala photobioreactors, og at måle vækst og neutral lipid indhold af at alger. Vejledningen er også medtaget på hvordan man opsætter photobioreactor systemet. Selv om eksempel organismer er arter af Chlorella og Auxenochlorella, kan dette system tilpasses for at dyrke en bred vifte af mikroalger, herunder Co kulturer af alger med ikke-alger. Stock kulturer dyrkes først i flasker til at producere inokulum for photobioreactor system. Alger inokulum er koncentreret og overført til photobioreactors til dyrkning i batch-mode. Prøver indsamles dagligt for absorbansaflæsningerne. For enden af batch kultur celler er høstet af centrifuge, vasket, og fryse tørrede at opnå en endelig tørvægt koncentration. Den endelige tørvægt koncentration bruges til at skabe en sammenhæng mellem den optiske tæthed og tørvægt koncentration. En modificeret Folch metode bruges efterfølgende til at udtrække samlede indhold af lipider fra den frysetørrede biomasse og ekstraktet er analyseret for sin neutrale lipid indhold ved hjælp af en mikrotiterplade assay. Denne analyse har været offentliggjort tidligere, men protokollen trin indgik her for at fremhæve vigtige trin i den procedure, hvor der ofte opstår fejl. Den bioreaktor system beskrevet her udfylder en niche mellem simple kolbe dyrkning og fuldt kontrolleret kommercielle bioreaktorer. Selv med kun 3-4 biologiske replikater per behandling, vores tilgang til dyrkning af alger fører til stramme standardafvigelser i vækst og lipid-assays.
Introduction
Anvendelsen af mikroalger i ingeniør- og bioteknologi har tiltrukket sig stor interesse i de seneste år. Mikroalger er undersøgt til brug i spildevand behandling1,2,3,4, biobrændstof produktion5,6,7,8, og den produktion af nutraceuticals og andre høje værdi produkter9,10. Alger er også er genetisk modificerede til højere priser i et forsøg på at forbedre deres egnethed til specifikke tekniske applikationer11,12. Der er derfor stor interesse i eksperimenter med industrielt relevante organismer i kontrolleret indstillinger. Formålet med denne metode er at kommunikere en effektiv tilgang til kultur mikroalger i et kontrolleret laboratoriemiljø og måle vækst og neutral lipid indhold af at alger. Forbedre vækst priser og neutral lipid indhold af mikroalger er blevet identificeret som to centrale flaskehalse mod kommercialisering af alger biobrændstoffer13.
En bred vifte af tilgange har været brugt til kultur alger til forsøgsformål. Generelt er kan disse tilgange opdeles mellem store udendørs dyrkningen og små indendørs dyrkning. Udendørs dyrkningen i photobioreactors og åben damme er egnet til eksperimenter med henblik på optrapning af processer, der allerede er blevet påvist i laboratoriet målestok (f.eks., at teste skala-up af en ny high-lipid stamme af alger)14. Dog, indendørs små dyrkning er relevant ved udviklingen af nye eller forbedrede alger stammer eller udføre eksperimenter til formål at forstå biologiske mekanismer. I disse sidstnævnte tilfælde kræves en høj grad af eksperimentelle kontrol at drille subtile ændringer i biologiske opførsel. Med henblik herpå, er axenic kulturer ofte nødvendige for at minimere de komplekse biotiske faktorer i forbindelse med andre organismer (fx bakterier og andre alger), der uundgåeligt vokser i store udendørs systemer. Selv når man studerer interaktioner blandt alger og andre organismer, har vi fundet, at brug af stærkt kontrollerede forsøgsbetingelser er nyttigt, når undersøge molekylære udveksling mellem organismer15,16,17.
Inden for kategorien af mindre indendørs alger dyrkning, har været brugt en vifte af tilgange. Måske er den mest almindelige metode at dyrke alger i Erlenmeyerkolben kolber på en shakerbord under en lys bank18,19. Udvekslingen af ilt og CO2 finder sted ved passiv diffusion gennem en skum prop i toppen af kolben. Nogle forskere har forbedret dette set-up gennem aktive beluftning af kolberne20. En anden metode er at dyrke alger i flasker, mixet af rør bar og aktive beluftning. Trods deres enkelhed, har vi fundet, at brug af flasker og flasker ofte fører til inkonsistente resultater blandt biologiske replikater. Formentlig skyldes holdning effekter - forskellige positioner modtager forskellige mængder af lys, som også berører intern reaktor temperaturer. Daglige rotation af reaktorer til nye stillinger kan hjælpe, men ikke afhjælpe problemet, fordi visse faser af algevækst (fx tidligt eksponentiel) er mere følsomme over for positionelle effekter end andre (fx log fase).
På den modsatte side af spektret af teknologisk sofistikerede er fuldt kontrolleret kommercielle photobioreactors. Disse systemer løbende overvåge og justere forholdene i reaktoren til at optimere algevækst. De programmerbare lys, real-time temperaturkontrol og pH kontrol. Desværre, de er dyre og koster typisk flere tusinde dollars pr. reaktor. Mest videnskabelige og tekniske tidsskrifter kræver biologiske replikering af resultater, hvilket kræver køb af flere bioreaktorer. Vi præsenterer her en boble kolonne reaktor system at broer kløft mellem simple (kolbe) og sofistikerede (fuldt kontrolleret bioreaktor) tilgange til lab-skala alger dyrkning. Boble kolonner bruger stigende gasbobler til at lette gasudveksling og bland reaktoren. Denne fremgangsmåde giver en vis grad af styring af belysning og temperatur men gør det på en måde, der er omkostningseffektive. Desuden har vi fundet dette system til at give meget ensartede resultater blandt biologiske replikater, at reducere det nødvendige antal biologiske replikater nødvendige for at opnå statistisk signifikante resultater i forhold til metoden kolbe eller flaske. Vi har også brugt dette system med succes dyrker blandinger af alger og bakterier21. Foruden alger dyrkning skitsere vi en procedure til måling af neutrale lipid indhold i de dyrkede alger. Sidstnævnte metode har været offentliggjort andetsteds22, men vi omfatter proceduren her for at give en trinvis vejledning til, hvordan du anvender det med succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opsætning af boble kolonne Photobioreactors
- Konstruere en række udluftet låg fra plast låg, der fulgte med 1 L glasflasker og hybridisering rør (Se figur 1 for skematisk og fotos). Konstruere låg luftfugter, blande fælde, hver luft lift photobioreactor og hver flaske reaktor.
- Bore ¼" huller i låget: 2 huller er nødvendige for bioreaktor og luftfugter låg; 3 huller er nødvendige for at blande fælde.
- Slip en ¼" O-ring over trådene i en 1/8" panel mount Luer montering, og skub det ind i ¼" hul boret i låg (figur 1A).
- Slip en anden ¼" O-ring over trådene så at låget er klemt inde mellem to O-ringene. Slip en låsemøtrikken på trådene og stramme for at fastsætte panel mount Luer i sted.
- Snap lås ringene på den udsatte mandlige Luer projicere fra låget. Gentag trin 1.1.2-1.1.4 for hvert hul i låget.
- For låg, som vil blive brugt på boble kolonne og flaske reaktorer, vedhæfte 1/8" kvindelige Luer til barb fittings til 1,5" stykker af 1/8" ID PVC slange. Knytte disse til hver af de udsatte mandlige Luer fittings på låget.
- Tilslut en kontraventil (peger væk fra låget) til den frie ende af en af 1/8" stykker.
Bemærk: Dette vil tjene som udstødning port for bioreaktor. - Tilslut en mandlig Luer til barb montering til det andet stykke 1/8" slange projicere fra låget. Klik på den roterende lås ringen på plads og fastgøre et 0,2 mm luftfilter til dette.
Bemærk: Dette vil tjene som indløbsstuds til reaktoren.
Figur 1. Skematisk og fotos til at konstruere bioreaktorer. (A) skematisk for opførelsen af bioreaktor låg (B) foto af samlet bioreaktor låget, og (C) foto af samlet låget bruges en luftfugter. Bemærk at luftfugter fittings skal være belagt med vandtæt silikone til at sikre en lufttæt forsegling med låg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Samle luft leveringssystem (Se figur 2A og 2B til en skematisk og foto).
- Tillægge barb fittings til indgange og udgange på bagsiden af hver rotameter 1/8" NPT gevind.
Bemærk: 200-2.500 cm3/min Flowmetre er for luft pres graduering opstrøms af luftfugter, 100-1000 cm3/min Flowmetre er på flaske reaktorer, 50-500 cm3/min Flowmetre er for luft lift bioreaktorer og 5-50 cm3/ min rotemeters er for CO2 flow regulering. Det anbefales at montere Flowmetre til en fast overflade (f.eks. plastfolie) så de ikke falder under drift. - Slukke komprimeret luft kilde, så Tilslut ¼" ID PVC slange til trykluft kilde med et spændebånd. Trin ned slange diameter til 1/8" ID PVC slange ved hjælp af en ¼" kvindelige barb montering og en 1/8" mandlige for barb montering.
- Tilslut den frie ende af 1/8" ID slangen til indgang af en 200-2.500 cm3/min rotameter.
Bemærk: Outlet af denne rotameter vil feed luftfugter flasken via 1/8" ID slanger. - Tilslut den 1/8" slange til en indgang til et udluftet låg (brug en kvindelig Luer til modhager montering at gøre forbindelsen). Tilslut derefter et andet stykke af 1/8" slange på indersiden af panelet mount montering.
Bemærk: Dette stykke vil hænge ned i luftfugter og boble luft gennem vandet. - Vedhæfte 1/8" kvindelige Luer modhager fittings til hver ende af et stykke af 1/8" ID slanger og bruge dette stykke kan tilsluttes indfaldende blanding fælden outlet af befugteren.
- På samme måde som 1.2.5 forbinde outlet af CO2 regulator til en anden port på den blanding fælde.
- Konstruere en manifold brug 1/8" slange og 1/8" multiport barb (Se figur 2 C) for at fodre luft ind i rotameter bankerne.
Bemærk: Disse Flowmetre skal bruges til at levere bioreaktorer. Undgå at konstruere mere end 6 Flowmetre i serien. Brug i stedet parallelle bredden af Flowmetre for at udvide systemet. Sikre, at den samlede gennemstrømning efterspørgsel efter alle reaktorer er mindre end 2.500 cm3/min (eller andet en større rotameter vil være behov for opstrøms af befugteren). - Tilsluttes de nybyggede rotameter banker bruger 1/8" rør og en 1/8" kvindelige til barb Luer outlet (3rd port) af den blanding fælde.
- Tilslut tilstrækkelig lang 1/8" slange til forretninger af hver rotameter i rotameter bank til indblæsning til bioreaktorer. Mærke enderne af slangen samt Flowmetre i banken.
- Anvende vandtæt silikone omkring alle havne på luftfugter og blande fælde låg for at sikre de er air tight.
- Tillægge barb fittings til indgange og udgange på bagsiden af hver rotameter 1/8" NPT gevind.
Figur 2. Skematisk og fotos til at samle boble kolonne system. (A) skematisk af beluftning system (B) foto af luftfugter, blande fælde, og rotameter bank og (C) foto af mangfoldigheder bruges til at forbinde rotameter banker sammen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Opsætning af akvarier, rør plader og lys (figur 3).
Forsigtig: Dette system kræver et stort antal forretninger og tilstrækkelig kredsløb kapacitet til at støtte alle komponenter. Undgå snor sammen flere stikdåser og forlængerledninger i en daisy-chain mode, fordi dette er en elektrisk fare. Brug af GFI type stikkontakter og stikdåser er stærkt opmuntret på grund af tilstedeværelsen af vand i systemet.- Arrangere lavprofil magnetiske omrørere på en plan overflade, der er stærk nok til at holde vægten for vandfyldt akvarier.
- Sted lille træ eller plastik blokke (der er lidt højere end rør pladerne) langs omkredsen af rør plader til at bære vægten af fisk tankene.
Forsigtig: Undgå at placere akvarier direkte på rør plader som vægten vil knuse dem. - Placer fisk tanke over rør plader og støtte blokke og fylde tankene med vand.
- Skær et stykke af en stiv plast ark til at passe på toppen af akvarium som låg. Skære huller i denne dækning til at glide hybridisering rør ind og ud. Også skåret et hul til fisk tank varmer.
- Arrangere fluorescerende lys bankerne ved siden af akvarium at yde horisontal belysning af bioreaktorer. Sæt lys banken i en lys timer til en dag/nat cyklus.
Figur 3. System skematisk for de flaske bioreaktorer (venstre) og boble kolonne photobioreactors (højre). Dette tal er blevet ændret fra Higgins et al. 17. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
2. forberedelse af mikroalger inokulum
- Få mikroalger inokulum fra en cryo-konserveret, forgyldt eller flydende kultur.
Bemærk: Det anbefales, at befrugtede organismer være forgyldt forud for anvendelse som inokulat at sikre at cellerne er levedygtige, og at den resulterende kultur axenic. Agarsubstratet (fx., ATCC #5 sporulating agar)21 er en rig medium, der fungerer godt for genoplivelse arter af Chlorella og Auxenochlorella fra cryo-storage. - Forberede 2,4 L af mineralske medium, der er relevant for bestemte mikroalger arter.
Bemærk: Eksempler N8 medium23 arter af Chlorella, N8-NH4 medium21 for arter af Auxenochlorella. Brug af en medium passer til alger stamme er en af de vigtigste skridt i retning af at sikre robuste algevækst. - Alikvot 2,4 L af mineralske medium lige ind i tre 1 L glasflasker, tilføje rør barer til hver flaske og samle de udluftet låg (figur 1) for hver flaske. Dobbelttjek, at beluftning tube er på indsugningssiden og hver flaske har en røre bar i det.
- Autoklave stock flasker ved hjælp af en flydende sterilisation cyklus (121 ° C) for 30 min. autoklave 100 mL deioniseret vand (dH2O) og nogle 1,5 mL rør på samme tid, som senere bruges til plating. Tillad medium til kølige natten. Alternativt kan du køle reaktoren til stuetemperatur og derefter lufte for 2 h før podning.
- I en biosikkerhed kabinet (BSC), podes mikroalger fra en plade eller axenic flydende kultur i stock-flasker. Brug steril teknik til at opretholde axenic kulturer i følgende trin.
- Der tilsættes 20 mL af autoklaveres dH2O til en steril 50 mL-centrifugerør. Bruge en steril 10 µL engangs løkke til at samle flere enkelt kolonier fra plade fra trin 2.1. Dyp løkken i 50 mL tube og alger cellerne vaskes i 20 mL autoklaveres dH2O. ryste 50 mL tube til at gøre en homogen mikroalger løsning.
- Der afpipetteres 6 mL af mikroalger løsning i hver bestand flaske med 10 mL sterilt serologisk pipette. Hvirvle flasken for at blande mikroalger jævnt i mediet.
- Brug en 2 mL sterilt serologisk pipette trække 1 mL prøver fra hvert lager flaske og overførsel i sterile 1,5 mL rør.
Bemærk: Mikropipetter anbefales ikke til dette trin på grund af risikoen for forurening. Stramme udluftet lågene på lager flasker. - Placere de bestand flasker på rør plader (~ 150 rpm) og justere strømningshastighed, CO2og belysning niveauer som passende for arten. Rotere positionen stock flaske hver dag.
- Fortyndes til 1 mL prøver under trin 2.6 (100-fold fortynding i sterilt vand normalt fungerer godt) og sprede plade på en rig agarsubstratet.
Bemærk: Disse plader kan bruges til at kontrollere, om forekomster af kontaminering samt som tjener som en kilde til fremtidige alger inokulum for yderligere eksperimenter. - Tage prøver fra flasker (i BSC) hver to dage for at kontrollere mikroalger vækst.
Prøver i en 96-brønd mikrotiterplade i tre eksemplarer (200 µL) og måle optisk densitet (OD) ved 550 nm og 680 nm hver to dage indtil OD når 0,2-0,3 (som typisk kræver 5-7 dage). - Stop inkubation og placere de bestand flasker på en bænk i 24-48 timer at lade alger celler til at udligne ved hjælp af tyngdekraften.
Bemærk: De udlignede celler skal bruges næste til podes boble kolonne photobioreactors. Evt en mere hurtig celle indsamling kan celler centrifugere på ikke mere end 1.000 x g at indsamle celler.
3. dyrkning af mikroalger i boble kolonne Photobioreactors
- Dagen før bioreaktor podning, forberede relevante medier og overføre 200 mL (eller ønskede volumen) til boble kolonne photobioreactor rør (hybridisering rør). Autoklave rør med medier og udluftet låg på plads.
Bemærk: Hvis du bruger spildevand som en vækstmedium, autoklave tomme bioreaktorer og tilføje steril-filtreret spildevand (evt axenic kultur). - Koncentrere udlignede mikroalger lager ved at fjerne supernatanten ved hjælp af en vakuumpumpe. Forlade mindre end 100 mL medium i hver flaske, men undgå at fjerne udlignede alger.
Bemærk: Gennemføre denne procedure inde en BSC og følg steril teknik. En simpel vakuum apparater kan konstrueres ved hjælp af enten en sugekolbe eller flaske. Passe en steril serologisk pipette til ende af slangen. - Suspendere og overføre alger gylle til sterile 50 mL centrifugeglas. Der centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min til yderligere koncentrere alger.
- I BSC, fjerne nok supernatanten for at opnå en samlet maengde paa ~ 80 mL af alger koncentrater til 12 photobioreacters. Undgå støvsugning ud af toerstoffet. Overføre alger koncentrat til en steril beholder (eller brugt alger stock flasken).
- Tilføj 6 mL af alger gylle i hvert photobioreactor med en steril 10 mL serologisk pipette.
- Sterile filter (0.2 mm sprøjte eller vakuum filter) og tilføje passende mængder af nogen andre forbindelser (f.eks. vitamin bestande) der ikke kan være autoklaveres.
- Swirl bioreaktorer at blande alger i mediet.
- Tegne en 2 mL prøve fra hver bioreaktor ved hjælp af en serologisk pipette og overførsel til en 2 mL tube. Indsamle en 2 mL prøve (i et BSC) hver 24 timer for at overvåge fremskridt, kultur. Check prøven for pH ved hjælp af test strips og justere reaktoren efter behov med enten 3 M NaOH eller 3 M HCl.
- Stramme bioreaktor låg og placere alle bioreaktorer i fisk tank vandbad. Justere beluftning, CO2og belysning til det passende niveau for arter. Rotere positionen bioreaktor hver dag efter prøvetagning (trin 3.8).
- Gælde wells af en 96 godt mikrotiterplade 200 µL af hver kultur prøve i tre eksemplarer. Måle optisk densitet (OD) på 550 nm og 680 nm.
- På den sidste dag i perioden kultur, måle OD under forskellige fortynding faktorer (f.eks. en 1 x, 2 x, 4 x, 8 x, 16 x og 32 x) til at etablere en sammenhæng mellem OD og den faktiske tørvægt efter høst (trin 4).
- Der centrifugeres 2 mL prøveglas på 12.000 x g i 5 min.
- Supernatanten filtreres på 0,2 µm ikke-steril sprøjte filter og opbevar supernatanten (og pellet hvis nødvendigt) uden højere end-20 ° C til lang sigt opbevaring og senere analyser af ændringer i medierne sammensætning.
4. høst og frysetørring af Microalgal biomasse
- Måle en fast volumen af alger kultur fra hver bioreaktor med et måleglas (fx 160 mL fra en bioreaktor at oprindeligt indeholdt 200 mL medium) og overføre til centrifuge flasker. Skyl måleglas med dH2O i mellem hver måling.
- Der centrifugeres ved 4,696 x g i 5 min. supernatanten ved omhyggeligt støvsugning det ud.
- Overføre pellets til mærket 50 mL rør. Skyl centrifuge flasker med dH2O og overføre indholdet til 50 mL rør. Sikre den samlede tube volumen ikke overstiger 45 mL.
- Vask alger pellets med dH2O at fjerne salte.
- Der centrifugeres 50 mL rør på 4,696 x g i 5 min, og supernatanten.
- Tilføje 40 mL dH2O til hver 50 mL tube; vortex at blande. Centrifugeres igen ved 4,696 x g i 5 min og kassér supernatanten.
- Gentag trin 4.4.2 igen.
- Mærke og veje tomme 15 mL centrifugeglas på en 4-decimal balance (mærke både låget og rør og vejes sammen). Veje en tube pr. alger kultur. Veje hver 15 mL tube to gange for at minimere fejl.
- Efter den sidste vask, supernatanten fjernes, og tilsættes 7,5 mL af dH2O til hver 50 mL tube. Vortex og overførsel alger gylle i den pre-vejede 15 mL rør. Skyl 50 mL rør med yderligere dH2O og overføre væske til 15 mL rør. Undgå at overskride 12 mL af samlede i 15 mL rør.
- Centrifugeres 15 mL rør på 4,696 x g i 5 min og den dekanteres. Fryse rør med pellets ved-80 ° C i mindst 30 min forberedelse til frysetørring.
- Fryse tørre natten over eller indtil tørret.
- Vejer og optage frysetørret 15 mL rør med alger.
5. lipid udvinding ved hjælp af en modificeret Folch metode24
- Der afvejes 20 mg af frysetørrede alge biomasse i et 2 mL skruelåg polypropylen tube (check producent etiketten for at sikre produktet er egnet til perle ekstraktioner).
- 1,5 mL Folch opløsningsmiddel (2:1 chloroform/methanol) tilsættes til hver 2 mL tube, (som indeholder 20 mg af frysetørrede alger). Hæld ~0.5 mL zirconia/silica perler (0,5 mm) i hver tube indtil væskeniveau i tube når 2 mL.
Forsigtig: Håndtere chloroform og methanol i et stinkskab og undgå at indånde dampe eller hudkontakt. - Homogeniseres alger prøver i perle kværn til 20 s med en hastighed på 6,5 m/s. overførsel rør til is for 30 s til chill prøver. Gentag fem gange til fuldt uddrag lipider.
- Homogenatet filtreres på en 5 mL sprøjte indeholdende en rustfrit stål wire mesh disk (#60 mesh) til stamme ud perler, indsamle filtratet i en 15 mL tube.
- Vask perler med 1,5 mL Folch opløsningsmiddel, presser væske gennem med sprøjte som nødvendigt. Gentag denne vask to gange og samle alle filtratet i 15 mL tube, giver en endelige mængden af ca. 6 mL.
- Der tilsættes 1,2 mL 0,9% (w/v) NaCl løsning til Folch ekstrakt i 15 mL tube og vortex at blande godt.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, flere Folch opløsningsmiddel kan bruges til at vaske perlerne (brug 0,2 x 0,9% NaCl opløsning til at fremkalde faseadskillelse samlede vask volumen). - Der centrifugeres i 15 mL rør på 6.000 x g i 5 min. post bunden chloroform (grøn) fase volumen til det nærmeste 0,1 mL ved hjælp af linjer på siden af 15 mL tube. Overføre den nederste fase til et hætteglas (med låg) ved hjælp af et glas Pasteur pipette.
- Gemme lipid på-20 ° C eller (-80 ° C, hvis der er planer om at bruge dette ekstrakt til fatty syre analysis).
6. Neutral Lipid Assay med en mikrotiterplade metode (tilpasset fra Higgins et al. 201422)
- Forberede stamopløsninger. Forberede 10 mL 1 mg/mL vegetabilsk olie standard i chloroform og opbevares ved-20 ° C.
Bemærk: Enhver vegetabilsk olie kan bruges i denne analyse, fordi det ikke er følsomme over for typerne af fedtsyrer. Forberede 10 mL af 200 µg/mL Nilen rød løsning i dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevares i mørke ved stuetemperatur. - Før varme tørre mikrotiterplade blok til 55 ° C i et stinkskab. Mens dette varme, fortyndes lipid ekstrakter og vegetabilsk olie standard 3-fold med methanol.
Bemærk: Denne fortynding kan ændres baseret på lipid indhold af alger, men denne plan fungerer godt for de fleste Chlorella. - For hver fortyndede prøve, skal du tilføje 80 µL til en 96 godt polypropylen mikrotiterplade i fire eksemplarer.
Forsigtig: Brug af Varmekrympende plasticware anbefales ikke til brug med organiske opløsningsmidler. - Blindprøven af opløsningsmiddel, anvende 80 µL 2:1 methanol/chloroform i fire eksemplarer. For standarder, tilføje 10, 30, 60, 90 og 120 µL af de fortyndede vegetabilsk olie standard i fire eksemplarer.
- Sted mikrotiterplade i en tør blok varmelegeme på 55 ° C i 20-30 min. indtil alle opløsningsmidlet er fordampet. Mens Opløsningsmidlet fordamper, forberede arbejdet Nilen rød løsning (behov 200 µL 1 µg/ml opløsning pr. plade godt). Som et eksempel kræver tolv prøver og et komplet sæt af standarder 16 mL af 1.0 µg/mL opløsning; Forbered dig ved at opløse 80 µL af 200 µg/mL bestand (i DMSO) i 16 mL dH2O.
- Fjerne mikrotiterplade fra den varme blok og lad afkøle til stuetemperatur. Tilsæt 30 µL af isopropylalkohol til hver brønd og mix af pipettering op og ned. Sikre alle pipette kanaler den blandingsopløsning og resuspending lipider, giver en homogen grøn væske.
- Tilføje 200 µL af Nilen rød løsning (1 µg/mL) til hver godt, pipetteres op/ned 10 gange for at blande. Inkuber plade i 5 min ved stuetemperatur. Mens vi venter, forberede en 50% blegemiddelopløsning ved at blande blegemiddel (6% hypokloritiske) med dH2O. 20 µL pr. brønd er nødvendige. Forberedelse af 3 mL 50% blegemiddel er tilstrækkelig nemlig 12 prøver og et komplet sæt af standarder.
- Tilføj 20 µL af blegemiddelopløsning til hver mikrotiterplade godt og pipetteres op og ned 5 gange til bland godt. Inkubér 30 min ved stuetemperatur.
- Efter 30 min, læse fluorescens i prøverne hver 5-10 min. ved 530 nm excitation/575 nm emission med auto-cutoff indstillet til 570 nm indtil signalet fra alger prøver stabiliserer. 60 min samlede inkubation er normalt tilstrækkeligt.
- Oprette en kalibreringskurve for vegetabilsk olie standarder (i intervallet 0-40 ng oliekilde).
Bemærk: En lineær passer fungerer godt for lav (< 30 ng/brønd) olie koncentrationer og et polynomium passer kan anvendes, hvis standarden overstiger 30 ng/godt. Brug denne korrelation til at kvantificere den neutrale lipid i stikprøven brønde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne procedure giver et tidsforløb af alge ekstinktionen data på OD 550 nm (figur 4A). Optisk tæthed og tørvægt koncentration data kan være korreleret (figur 4B). Dette opnås ved første beregning af den endelige tørvægt alger koncentration efter de freeze-drying trin. Næste, Ekstinktionen af kultur seriel fortynding (udføres på den sidste dag i prøvetagning) og de faktiske tørvægt koncentrationer kan være korreleret. For lav celle koncentrationer, kan en lineær korrelation bruges til højere celle koncentrationer, der kan anvendes en anden orden polynomiel korrelation. Det anbefales at oprette en særskilt sammenhæng for hver kultur betingelse. Sammenhængen kan endelig anvendes til tid kursus ekstinktionen data til at opnå en tørvægt vækstkurve (fig. 4 c). I dette eksempel eksperiment, Auxenochlorella protothecoides (UTEX 234125) var kulturperler fire betingelser: axenic kontrol kulturer dyrkes på frisk N8-NH4 medium21, i fælles kultur med bakterier Azospirillum brasilense, i medium suppleret med 50 mg/L af indol-3-eddikesyre og på brugt medium fra A. brasilense. A. brasilense er kendt for at producere indol-3-eddikesyre, en plantevækst, fremme hormon, der også fremmer vækst i nogle mikroalger. På 50 mg/L hæmmede IAA behandling helt A. protothecoides vækst. Derfor ekstinktionen data forelå, men mængden af alger var utilstrækkelig til at opnå en nøjagtig tørvægt koncentration. I dette tilfælde korrelation til kontrol kultur kan anvendes eller ekstinktionen data kan indberettes direkte. Fordi OD data blev indsamlet på begge 550 nm og 680 nm absorbans, enten datasæt kan bruges til korrelation mellem OD og tørvægt. OD 550 bruges typisk fordi det næsten helt udelukker absorbansen af klorofyl26, dermed undertrykke bias fra ændringer i klorofyl indhold. Derimod OD 680 omfatter absorbansen af klorofyl og høje nøgletal for OD 680/550 angive høje klorofyl indholdet i alger. Figur 4D viser et sæt af tolv alger kulturer vokser i boble kolonne photobioreactors. Selv med kun tre biologiske replikater per behandling, blev stramme standardafvigelser opnået, giver mulighed for høj følsomhed over for forskelle mellem behandlinger.
Figur 4. Algevækst resulterer i boble kolonne photobioreactors. (A) ekstinktionen (550 nm) vækstkurve af Auxenochlorella protothecoides (UTEX 2341) viser kulturer ind sent logaritmisk vækst på 120 timer. Kontrol kulturer blev dyrket på frisk N8-NH4 medium, behandling 1 er co kulturer af A. protothecoides og Azospirillum brasilense vokset på frisk N8-NH4 medium, behandling 2 er axenic A. protothecoides dyrkes på N8-NH4 medium suppleret med 50 mg/L indol-3-eddikesyre (IAA) og behandling 3 er axenic A. protothecoides dyrkes på brugt medium fra A. brasilense. Brugt mediet blev udarbejdet ved dyrkning af A. brasilense for 96 timer på N8-NH4 medium suppleret med 2 g/L æblesyre. Celler blev fjernet, og mediet blev igen suppleret med ammonium at genskabe dets oprindelige plan, pH var justeret, og mediet var sterilt filtreret (0,2 μm). Bemærk, at 50 mg/L IAA behandling helt hæmmede algevækst. (B) korrelation kurver mellem OD 550 nm og endelige tørvægt koncentration ved hjælp af en anden orden polynomiel pasform. Ingen korrelation er vist behandling 2 fordi ingen alger kunne høstes ved udgangen af perioden kultur. (C) anvendelse af polynomium sammenhængen med den optiske tæthed data giver en vækstkurve med tørvægt koncentration på y-aksen. Kontrol kultur korrelationen blev anvendt til OD-data for behandling 2. Fejllinjer er standardafvigelser baseret på 3 biologiske replikater. (D) foto af boble kolonne photobioreactors kort efter kultur podning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Neutral lipid data er vist for to eksempel eksperimenter i figur 5. Denne analyse har vist sig at korrelere godt med neutral lipid indhold, især triacyglycerol (TAG) indhold. Dette kan ses ved at sammenligne den neutrale lipid assay (figur 5A) til en tilsvarende tynd lag kromatografi plade (figur 5B). Den samme tendens ses i det andet eksperiment (figur 5 c og 5 D). I alle disse forsøg var rapsolie anvendes som en standard og resulterede i en lineær korrelation (R2 0,98 for det første eksperiment og 0,99 for anden) mellem fluorescens og raps olie masse i brønden. Bemærk, at hvis alle prøver har lavt fedtindhold, så de højeste punkt eller to på standard kan udelades. Denne sammenhæng kan bruges til at beregne mængden af neutral lipid (µg) i hver af alger prøve brønde. Olie masse kan blive så konverteret til en koncentration i lipid ekstrakt anvendes til mikrotiterplade godt. Denne værdi ganges med fortyndingsfaktoren anvendes (f.eks. 3 x) til at opnå neutral lipid indholdet af den oprindelige Folch ekstrakter. Denne koncentration er derefter ganget med volumen af ekstraktet (bør være tæt på 4 mL) og derefter divideret med den samlede masse af alger biomasse anvendes til lipid udvinding (bør være tæt på 20 mg). Resultatet er neutral lipid indholdet af mikroalger.
Figur 5. Neutral lipid data indhentet fra kulturer af Chlorella sorokiniana (UTEX 2714). (A) Neutral lipid indhold (% tørvægt) for alger i eksperimentere 1 i hvilke alger var vokset til 120 timer. Kontrol kultur var axenic og kulturperler på frisk N8 medium23, behandling 1 var en fælles kultur af C. sorokiniana og A. brasilense på frisk N8 medium, behandling 2 var frisk N8 medium suppleret med 50 mg/L IAA og behandling 3 blev brugt medium fra A. brasilense. Brugt mediet blev udarbejdet af dyrkningsbaserede A. brasilense for 96 timer i N8 medium suppleret med 2 g/L æblesyre, fjerne cellerne, supplere tabt nitrat, justering af pH, og sterile filtrering medium (0,2 μm). I modsætning til A. protothecoides, 50 mg/L af IAA ikke hæmme C. sorokiniana vækst. (B) TLC plade billede for eksperiment 1 viser relative TAG overflod. (C) Neutral lipid indhold (% tørvægt) for alger i eksperiment 2 som havde de samme behandlinger som eksperiment 1 men cellerne er høstet efter 72 timer efter vækst. (D) TLC plade billede for eksperiment 2 viser relative TAG overflod. Fejllinjer er standardafvigelser baseret på 3 biologiske replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Også, det er god praksis at beregne variationskoefficienten (standardafvigelse divideret med gennemsnittet) af rå fluorescens aflæsninger på tværs af alle tekniske replikater i neutral lipid assay. Forudsat, at tekniske replikater blev udført i mikrotiterplade i fire eksemplarer som anført i proceduren, bør variationskoefficienten typisk ikke overstige 10%. Høj koefficienter af variation er normalt et resultat af dårlig blanding (især under tilsætning af isopropylalkohol) og potentielt ukorrekte brug af en multikanalpipette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vigtigste overvejelse ved dyrkning af alger er en forståelse af de specifikke behov i organismen eller gruppe af organismer. Algerne dyrkning system beskrevet her kan bruges til kultur en bred vifte af alger, men de specifikke abiotiske faktorer (temperatur, medier, pH, lysintensitet, CO2 niveau, beluftning sats) skal tilpasses til behovene, som skadegøreren. Bemærk de parametre, der beskrives her blev anvendt til dyrkning af Chlorella og Auxenochlorella. Disse organismer er af industriel interesse, fordi de er tolerant over for høj næringsstof, lys og temperatur niveauer27. Dog lys niveauer kan reduceres gennem fjernelse af lysstofrør og dag/nat cyklus kan justeres for at repræsentere sæsonudsving. Ligeledes, vandvarmere kan slås op eller ned til kontrol bad vandtemperaturen på systemet. Mens systemet beskrevet her ikke anvender sådanne en feature, er det muligt at chill fisk tank vandbade under stuetemperatur gennem et lavpris-kølesystem. Anbring en spand vand i en lille køleskab og bruge en variabel hastighed vandpumpe at pumpe vand fra koldt vand spanden til akvarium og tilbage. Jo hurtigere den pumpe sats, jo koldere fisk tank reservoiret bliver.
Selv om alger dyrkning system generelt giver ensartede resultater, er der et par vigtige forbehold, der bør overvejes. Først er vand opsugning der opstår i tilfælde at beluftning system oplever et pludseligt tab af pres (f.eks. en blæst montering eller en luft kompressor svigt). Pres, der er i befugtere vil skubbe luftfugter vand tilbage gennem slangen, herunder gennem rotameter. Installation af en upstream fælde eller tilbagestrømning ningssikringen kan hjælpe. Bemærk at opsugning ikke vil påvirke bioreaktorer, selv fordi de opererer ved atmosfærisk tryk. Rutinemæssig inspektion af rør og fittings kan afhjælpe systemfejl. En anden vigtig overvejelse er rutinemæssigt kontrollere og erstatte luftfiltre og kontraventiler på bioreaktorer. Sørg for at følge producentens anbefaling for antallet af autoklave cyklusser tilladte. Dette er især vigtigt, hvis vedligeholdelse af axenic kulturer er afgørende for forsøget. Endelig anbefales det at købe eller konstruere et autoklaverbart rack for sikker transport af bioreaktorer mellem vandbade, autoklave og biosikkerhed kabinet. En rustfrit stål wire rack kan tjene dette formål.
Den bioreaktor system beskrevet her har flere begrænsninger. En afgørende begrænsning er behovet for at håndtere reaktorerne i en biosikkerhed kabinettet ved hjælp af steril teknik. Reaktorerne mangler en anti-opsugning prøveudtagning havn, at brugeren skal flytte reaktoren til en biosikkerhed kabinet til stikprøve uden forurener kulturen. Reaktorerne også kræve manuel pH-læsning og justering, som indfører muligheden for menneskelige fejl.
Den bioreaktor system beskrevet her udfylder en niche mellem simple kolbe dyrkning og fuldt kontrolleret bioreaktorer. Bioreaktor system blev udviklet som svar på et behov for mere ensartede resultater end var opnåeligt ved hjælp af flasker. Dataene viser, at dette system genererer ensartet vækst resultater når drives korrekt. Bemærk at kulsyre flasker blev ansat i proceduren for dyrkning af alger materiel, men dette skete kun for at producere inokulum for eksperimentet. Dette er acceptabelt, fordi bestanden flasker var samlet til podning og dermed variation blandt reaktorer er ikke et problem.
Som mange alger forskere er interesseret i overvågning både vækst og neutral lipid indhold, har vi medtaget vores tilgang til måling af begge disse parametre her. Brug af optisk tæthed til at måle væksten er almindelig praksis og er uden sidestykke i sin enkelhed. Dog korrelationer mellem tørvægt og optisk tæthed ændre over tid og afhænger af kultur betingelser. Det anbefales at producere en korrelation ligning for hver eksperimentel behandling inden for hver eksperimentel batch. Dette er muligt i den foreslåede procedure, fordi fryse tørrede alger vil være opnået efter hver kultur eksperiment. En kritisk antagelse af den optiske tæthed tilgang er, at sammenhængen mellem optisk tæthed og tørvægt holder konstant i løbet af batch vækst. Så længe afvigelser fra denne antagelse er små, vil medføre rimelig præcis. Den relative nøjagtighed kan vurderes ved at sammenligne den beregnede alger tørvægt koncentration ved time nul. Under forudsætning af kulturer var godt blandet, og pipettering var nøjagtig, alle kulturer bør have de samme indledende podning tæthed. Ekstinktionen tilgang kan også blive udfordret når baggrundsabsorbansen af mediet er høj (dvs., når du arbejder med visse wastewaters). Subtraktion af medium absorbans (før podning) fra hver OD læsning kan hjælpe med dette problem.
Udvinding af lipider fra de tørre alger følger den veletablerede Folch tilgang21,24; der er imidlertid vigtige overvejelser. Forskellige alger har forskellige cellevægge med varierende grader af sejhed. Zirconia/silica Perlerne anvendes her er skarpe og er designet til at gennembore stærke, polysaccharid cellevægge. En blødere perle type (f.eks. glas) eller færre perle forstyrrelser cyklusser kan anvendes på alger med svagere cellevægge. En tommelfingerregel er dog, at den resulterende celle pellet efter udvinding bør være fri af pigment, der angiver, at alle klorofyl blev udvundet. En af de mest almindelige kilder til svigt under lipid ekstraktionstrinet opstår på grund af forkert fryse tørring. Hvis prøven smelter i fastfrysning tørretumbler, før det er helt tørt, bliver resultatet en meget hårde, mørke, voksagtig pellet. Dette er et resultat af celler, der mængden under de vakuum fastfrysning tørretumbler. Pellet kan vejes for at opnå en tør vægt, men det kan ikke bruges til lipid udvinding som voksagtig partiklerne ikke bryder i Folch opløsningsmiddel. For at sikre, at frysetørring altid udbytter blød, partikelholdigt prøver, er det vigtigt at fastfryse alle prøver til-80 ° C og straks overføre dem til fastfrysning tørretumbler. Bruge parafilm (med en hel stak i det) snarere end løsnede tube låg vil endvidere sikre, at fugt kan være kontinuerligt fjernet fra prøven før det smelter.
Neutral lipid analysen er beskrevet i denne procedure er blevet udgivet tidligere og indeholder en diskussion af alternative lipid assays22. Denne procedure har været foretaget nogle vigtige forbedringer siden offentliggørelsen. Mest bemærkelsesværdigt, blev Nile røde opløsningens koncentration øget fra 0,5 µg/mL til 1 µg/mL. Effekten af denne ændring var højere signal intensitet, forbedret repeterbarhed og en eliminering af signal tilbagegang med tiden under inkubationstiden. Resultaterne viser, at analysen sammenligner godt til resultater fra kvalitative tyndtlagskromatografi. Denne analyse blev udviklet og valideret ved hjælp af forskellige arter af Chlorella og Auxenochlorella , så dens anvendelighed til arter af markant forskellig sammensætning ikke er blevet fastlagt. Alle grønne pigment bør fjernes helt fra analysen under blegemiddel inkubation, fører til prøver, der er klart eller meget bleg gul. Bemærk også at lipid ekstrakter, der er forringet (som angivet ved en ændring fra grøn til brun farve) typisk undlader at levere nøjagtige resultater i denne analyse. Det er således bydende nødvendigt at opbevare lipid prøver uden højere end-20 ° C i mørke.
De metoder, der præsenteres her for dyrkning af alger, måle vækst, og kvantificere neutral lipider er nyttige for en bred vifte af ingeniørmæssige anvendelser af alger, men er særligt velegnede til forskning om produktion af biobrændstof. Disse metoder bruges også til at studere algevækst hæmning på wastewaters28 samt påvirkninger af organismen interaktion på vækst og sammensætning af mikroalger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Support af denne forskning blev leveret af USDA National Institute for fødevarer og landbrug Hatch projekt ALA0HIGGINS og Auburn University kontorer i Provst, Vice President for forskning og af Samuel Ginn College of Engineering. Støtte blev også leveret fra NSF give CBET-1438211.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35x300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars - long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars - medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100x15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24x2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
References
- Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
- Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
- Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
- Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
- Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
- Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
- Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
- Branyikova, I., et al. Microalgae - Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
- Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
- Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
- Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
- Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
- Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
- Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
- Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
- Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
- Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
- Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
- Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
- Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
- Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
- Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
- Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th Edition, Cengage Learning. 578-730 (2012).
- de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
- Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. Annual International Meeting of the ASABE. , American Society of Agricultural and Biological Engineers. Detroit, MI. (2018).
