Her præsenterer vi en protokol til at inducere og score sygdom i en xenogene graft-versus-Host disease (xenogvhd) model. xenoGVHD giver en in vivo-model til at studere immunsuppression af humane T-celler. Derudover beskriver vi, hvordan man opdager humane T-celler i væv med digital PCR som et redskab til at kvantificere immunsuppression.
Akut graft-versus-Host-sygdom (GVHD) er en signifikant begrænsning for patienter, der får hæmatopoietisk stamcelletransplantation som behandling for hæmatologiske mangler og maligniteter. Akut GVHD opstår, når donor-T-celler genkender værts vævet som et fremmed antigen og monterer et immunrespons over for værten. Nuværende behandlinger involverer giftige immunosuppressive lægemidler, der gør patienter modtagelige for infektion og gentagelse. Således, der er igangværende forskning for at give en akut GVHD terapi, der effektivt kan målrette donor T celler og reducere bivirkninger. Meget af dette prækliniske arbejde bruger xenogen GVHD (xenoGVHD) murine model, der giver mulighed for testning af immunosuppressive behandlinger på humane celler i stedet for murine celler i et in vivo-system. Denne protokol skitserer, hvordan xenoGVHD fremkalder, og hvordan man blinde og standardiserer klinisk scoring for at sikre ensartede resultater. Derudover beskriver denne protokol, hvordan man bruger digital PCR til at detektere humane T-celler i musens væv, som efterfølgende kan anvendes til at kvantificere effekten af testede terapier. XenoGVHD-modellen giver ikke kun en model til at teste GVHD-terapier, men enhver terapi, der kan undertrykke humane T-celler, som derefter kan anvendes til mange inflammatoriske sygdomme.
Allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) er blevet rutinemæssig behandling for patienter, som lider af hæmatologiske maligniteter såsom leukæmi med dårlig prognose. En signifikant komplikation af HSCT er akut graft-versus-Host-sygdom (GVHD). En 2012 undersøgelse rapporterede, at akut GVHD udviklet i 39% af HSCT patienter, der modtager transplantationer fra søskende donorer og 59% af patienter, der modtager transplantationer fra ikke-forretningsmæssigt forbundne donorer1. Akut GVHD opstår, når donor-afledte T-celler angriber modtagerens organer. Den eneste vellykkede behandling for GVHD er behandling med meget Immunsuppressive lægemidler2, som er meget giftige og øger risikoen for infektion og tumor gentagelse. På trods af forbedringer, der er foretaget i akut gvhd overlevelse i de seneste år3,4,5, er der stadig et kritisk behov for forbedrede gvhd-terapier med minimal toksicitet, der fremmer langsigtet remission.
Det overordnede mål med følgende metoder er at inducere og score xenogene gvhd (xenogvhd). XenoGVHD-modellen blev udviklet som et værktøj til at inducere akut GVHD med humane celler i stedet for murinceller, der giver mulighed for mere direkte oversættelse af præklinisk GVHD-forskning til kliniske forsøg6. Denne model involverer intravenøst injiceret humant perifert blod mononukleære celler (PBMC) i NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) mus, der er sublethally bestrålet. Injicerede humane t-celler aktiveres af humane antigen præsentations celler (apc’er), der præsenterer murin-antigen, og de aktiverede t-celler migrerer til fjernt væv, hvilket resulterer i systemisk inflammation og i sidste ende død6,7, 8 , 9 , 10. sygdoms patologi og progression i xenoGVHD-modellen nøje efterligner humant akut gvhd. Specifikt er de patogene humane T-celler reaktive over for murine Major komplekse Complex (MHC) proteiner, som svarer til T-cellens alloreactivity i human gvhd6,9. Den primære fordel ved xenoGVHD-modellen over musens MHC-mismatch-model, den anden udbredte GVHD-model, gør det muligt at teste terapier på humane celler i stedet for murinceller. Dette giver mulighed for afprøvning af produkter, der direkte kan oversættes til klinikken uden ændringer, fordi de er lavet til at målrette humane celler. For nylig er denne model blevet brugt til at teste et humant anti-IL-2 antistof11, humane thymiske regulatoriske T-celler (Tregs)12 og humane mesenchymale stamceller13 som potentielle behandlinger for akut gvhd. I en bredere sammenhæng, denne model kan bruges som en in vivo suppression analyse for enhver stof eller celletype, der kan undertrykke menneskelig T celle aktivitet. F. eks. brugte stockis et al.14 xenogvhd-modellen til at undersøge effekten af blokering af anti αvβ8 på treg suppressiv aktivitet in vivo. Derfor kan xenoGVHD-modellen give indsigt i mekanismen i enhver terapi, som målretter mod T-celler i en in vivo-indstilling.
En yderligere metode beskrevet i denne protokol er, hvordan man opdager humane T-celler i mus væv ved hjælp af digital polymerase kædereaktion (dPCR). Målet med denne metode er at tilbyde et værktøj til at kvantificere migration og spredning af T-celler i målvæv, som måler effekten af immunosuppressive behandlinger, der testes i denne model. dPCR er en forholdsvis ny metode til kvantificering af nukleinsyrer15. Kort sagt er PCR-reaktionsblandingen opdelt i partitioner, der indeholder små tal af målsekvensen eller intet mål overhovedet. Målsekvensen forstærkes og detekteres ved hjælp af DNA-interkalerende farvestoffer eller fluorescerende målspecifikke sonder. dpcr kvantificerer antallet af kopier af Target sekvens baseret på brøkdel af positive partitioner og Poissons statistik15,16. Påvisning af T-celler med dPCR kræver meget mindre væv sammenlignet med andre alternative metoder, herunder flow cytometri og histologi, og kan udføres på frosset eller fast væv. dPCR kræver ikke en standardkurve for at bestemme kopi numre, og der kræves heller ikke tekniske replikater. Dette reducerer mængden af reagens og skabelon-DNA, der er nødvendigt for dPCR sammenlignet med traditionel kvantitativ PCR (qPCR)16. Opdeling af PCR-reaktionen i sub-reaktioner i dPCR koncentrerer mål17. DPCR er således primært et værktøj til påvisning af sjældne mål i en stor mængde ikke-måldna. For eksempel bruges dPCR til at påvise bakteriel kontaminering i mælk18, identificere sjældne mutationer i østrogen receptor genet19og detektere cirkulerende tumor DNA i blodet hos patienter20. I denne protokol fungerer dPCR som et effektivt værktøj til påvisning og kvantificering af humane T-celler i væv hos mus med xenoGVHD.
Sygdomsprogression er generelt konsistent i xenoGVHD-modellen, selv med injektion af PBMC fra forskellige donorer, så flere eksperimenter kan kombineres. De vigtigste skridt, der kræves for at opretholde denne konsistens er korrekt i.v. injektion teknik, blændende og konsekvent scoring. En undersøgelse foretaget af Nervi et al.25 viste, at sammenlignet med intravenøs hale vene injektion resulterede retroorbital injektioner af PBMC i mere konsistent engraftment og mere alvorlig gvhd. Leon-Rico…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende laboratoriet i Lane Christenson for at levere den digitale PCR-maskine, der anvendes i disse eksperimenter, og for den leverede tekniske support. Vi vil også gerne takke Dr. Thomas Yankee for hans vejledning og mentorskab. Disse undersøgelser blev støttet af Tripp Family Foundation.
1.5 mL eppendorf tubes | Fisher | 05-408-129 | |
10 mL serological pipet | VWR International | 89130-898 | |
10mL BD Vacutainers – Green capped with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 366480 | |
250 µL Ranin pipette tips | Rainin | 17001118 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
50 mL conical tube | VWR International | 89039-656 | |
96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Optional |
Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 6818 | |
Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | Provided by animal facility |
Anesthesia Machine | Parkland Scientific | PM1002 | Provided by animal facility |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367281 | |
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864007 | |
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O | Life Technologies | 1811318 | |
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
Insulin Syringe | Fisher Scientific | 329424 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Provided by animal facility |
Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
Mouse Irradiator Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Holds up to 11 mice |
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | F110756 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
qPCR plates | VWR International | 89218-292 | |
QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications |
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
RNase and DNase-free plate seal | Thermo Scientific | 12565491 | |
RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
Sterile Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 21040CV | |
Sterile reservoir | VWR International | 89094-662 | |
Surgial Scissors | Kent Scientific | INS600393-4 | |
Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650914-4 |