Her presenterer vi en protokoll for å indusere og score sykdom i en xenogeneic pode-versus-host sykdom (xenoGVHD) modell. xenoGVHD gir en in vivo-modell for å studere immunsuppresjon av menneskelige T-celler. I tillegg beskriver vi hvordan du kan oppdage menneskelige T-celler i vev med digital PCR som et verktøy for å kvantifisere immunsuppresjon.
Akutt pode-versus-host sykdom (GVHD) er en betydelig begrensning for pasienter som får blodkreft stilk cellen transplantasjon som terapi for hematologiske mangler og ondartet. Akutt GVHD oppstår når donor T celler anerkjenner vert vev som et utenlandsk antigen og montere en immunrespons til verten. Nåværende behandlinger involverer giftige immunsuppressiv medikamenter som gjør pasienter utsatt for infeksjon og gjentakelse. Dermed er det pågående forskning for å gi en akutt GVHD terapi som effektivt kan målrette donor T celler og redusere bivirkninger. Mye av dette pre-klinisk arbeid bruker xenogenic GVHD (xenoGVHD) murine modell som gjør det mulig for testing av immunsuppressiv behandling på menneskelige celler i stedet for murine celler i en in vivo system. Denne protokollen skisserer hvordan å indusere xenoGVHD og hvordan å blinde og standardisere klinisk scoring for å sikre konsistente resultater. I tillegg beskriver denne protokollen hvordan du bruker digital PCR til å oppdage menneskelige T-celler i mus vev, som senere kan brukes til å kvantifisere effekten av testede terapier. Den xenoGVHD modellen gir ikke bare en modell for å teste GVHD terapier, men noen terapi som kan undertrykke menneskelige T-celler, som deretter kan brukes på mange inflammatoriske sykdommer.
Allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon (HSCT) har blitt rutinemessig behandling for pasienter som lider av hematologiske ondartet som leukemi med dårlig prognose. En betydelig komplikasjon av HSCT er akutt pode-versus-host sykdom (GVHD). En 2012 studie rapporterte at akutt GVHD utviklet i 39% av HSCT pasienter som fikk transplantasjon fra søsken givere og 59% av pasientene som fikk transplantasjon fra urelaterte donorer1. Akutt GVHD oppstår når donor-avledet T-celler angriper mottakerens organer. Den eneste vellykkede terapi for GVHD er behandling med svært immunsuppressiv narkotika2, som er svært giftig og øke risikoen for infeksjon og tumor tilbakefall. Således, til tross for forbedringer som er gjort i akutt GVHD overlevelse de siste årene3,4,5, er det fortsatt et kritisk behov for økt GVHD behandling med minimal toksisitet som fremmer langsiktig remisjon.
Det overordnede målet med følgende metoder er å indusere og score xenogeneic GVHD (xenoGVHD). Den xenoGVHD modellen ble utviklet som et verktøy for å indusere akutt GVHD med menneskelige celler i stedet for murine celler som tillater mer direkte oversettelse av pre-klinisk GVHD forskning til kliniske studier6. Denne modellen innebærer intravenøs injeksjon av humant perifere blod mononukleære celler (PBMC) i NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) mus som er subletalt bestrålt. Injisert menneskelige T-celler aktiveres av humant antigen presentere celler (APCs) presenterer murine antigen og aktiverte T celler migrere til fjerne vev som resulterer i systemisk betennelse og til slutt død6,7, 8 på alle , 9 andre priser , 10. sykdom patologi og progresjon i xenoGVHD modellen tett etterligne menneskelige akutt GVHD. Spesielt er de patogene menneskelige T-celler reaktive til murine Major histocompatibility Complex (MHC) proteiner, som ligner på T-cellen alloreactivity i Human GVHD6,9. Den primære fordelen med xenoGVHD modellen over musen MHC-konflikt modell, den andre mye brukt GVHD modell, er det gir mulighet for testing av terapier på menneskelige celler i stedet for murine celler. Dette gjør det mulig for testing av produkter som direkte kan oversettes til klinikken uten noen modifikasjoner fordi de er laget for å målrette menneskelige celler. Nylig har denne modellen blitt brukt til å teste et menneske anti-IL-2 antistoff11, Human Tymusatrofi regulatoriske T-celler (Tregs)12 og menneskelige Mesenchymal stamceller13 som potensielle behandlinger for akutt GVHD. I en større sammenheng kan denne modellen brukes som en in vivo undertrykkelse analysen for ethvert legemiddel eller celle type som kan undertrykke menneskelig T celle aktivitet. For eksempel brukte stockis et al.14 xenoGVHD modellen til å studere effekten av blokkering integrin ΑVβ8 på treg undertrykkende aktivitet in vivo. Dermed kan xenoGVHD modellen gi innsikt i mekanismen for enhver terapi målretting T-celler i en in vivo innstilling.
En ekstra metode som er beskrevet i denne protokollen er hvordan man skal oppdage menneskelige T-celler i mus vev ved hjelp av digitale polymerase kjedere reaksjon (dPCR). Målet med denne metoden er å tilby et verktøy for å kvantifisere migrasjon og spredning av T-celler i målet vev, som måler effekten av immunsuppressiv terapier testes i denne modellen. dPCR er en relativt ny metode for kvantifisering av nukleinsyre syrer15. Kort sagt er PCR reaksjonsblandingen delt inn i partisjoner som inneholder små antall mål sekvensen eller ikke noe mål i det hele tatt. Mål sekvensen forsterkes og oppdages ved hjelp av DNA-interkalering fargestoffer eller fluorescerende mål spesifikke sonder. dPCR kvantifiserer antall eksemplarer av mål sekvensen basert på brøkdel av positive partisjoner og Poisson ‘ s statistikk15,16. Oppdage T-celler med dPCR krever mye mindre vev sammenlignet med andre alternative metoder, inkludert Flow flowcytometri og histologi, og kan utføres på frossen eller fast vev. dPCR krever ikke en standard kurve for å finne kopi numre, og det er heller ikke tekniske replikerer som kreves. Dette reduserer mengden av reagens og mal DNA som trengs for dPCR sammenlignet med tradisjonell kvantitativ PCR (qPCR)16. Partisjonering av PCR-reaksjonen i sub-reaksjoner i dPCR konsentrerer effektivt mål17. Således er dPCR primært et verktøy for påvisning av sjeldne mål i en stor mengde ikke-Target DNA. For eksempel, dPCR brukes til å oppdage bakteriell forurensning i melk18, identifisere sjeldne mutasjoner i østrogen reseptoren genet19, og oppdage sirkulerende tumor DNA i blodet av pasienter20. I denne protokollen, dPCR fungerer som et effektivt verktøy for å oppdage og kvantifisere menneskelige T-celler i vev av mus med xenoGVHD.
Sykdomsprogresjon er generelt konsistent i xenoGVHD-modellen, selv med injeksjon av PBMC fra ulike donorer, slik at flere eksperimenter kan kombineres. De viktigste trinnene som kreves for å opprettholde denne konsistensen er riktig IV injeksjon teknikk, blendende og konsistent scoring. En studie av Nervi et al.25 viste at sammenlignet med intravenøs hale vene injeksjon, retro-orbital INJEKSJONER av PBMC resulterte i mer konsistent engraftment og mer alvorlig GVHD. Leon-Rico et al.<sup class="xr…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å anerkjenne laboratoriet til Lane Christenson for å gi den digitale PCR maskinen som brukes i disse eksperimentene og for den tekniske støtten som tilbys. Vi vil også gjerne takke Dr. Thomas Yankee for hans veiledning og mentorer. Disse studiene ble støttet av Tripp Family Foundation.
1.5 mL eppendorf tubes | Fisher | 05-408-129 | |
10 mL serological pipet | VWR International | 89130-898 | |
10mL BD Vacutainers – Green capped with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 366480 | |
250 µL Ranin pipette tips | Rainin | 17001118 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
50 mL conical tube | VWR International | 89039-656 | |
96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Optional |
Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 6818 | |
Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | Provided by animal facility |
Anesthesia Machine | Parkland Scientific | PM1002 | Provided by animal facility |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367281 | |
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864007 | |
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O | Life Technologies | 1811318 | |
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
Insulin Syringe | Fisher Scientific | 329424 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Provided by animal facility |
Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
Mouse Irradiator Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Holds up to 11 mice |
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | F110756 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
qPCR plates | VWR International | 89218-292 | |
QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications |
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
RNase and DNase-free plate seal | Thermo Scientific | 12565491 | |
RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
Sterile Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 21040CV | |
Sterile reservoir | VWR International | 89094-662 | |
Surgial Scissors | Kent Scientific | INS600393-4 | |
Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650914-4 |