Summary

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

Published: March 02, 2019
doi:

Summary

Este protocolo permite a visualização da expressão gênica em embrionárias Astyanax cavefish. Esta abordagem foi desenvolvida com o objetivo de maximizar o sinal de expressão do gene, minimizando a coloração de fundo específico.

Abstract

Nos últimos anos, foi lançado um genoma de projecto para o cego mexicano cavefish (Astyanax mexicanus), revelando as identidades de sequência para milhares de genes. Pesquisas anteriores neste sistema modelo emergente capitalizou investigações abrangentes de todo o genoma que identificaram numerosos loci de traço quantitativos (QTL) associado com vários fenótipos associados a caverna. No entanto, a capacidade de conectar os genes de interesse para a base hereditária para mudança fenotípica permanece um desafio significativo. Uma técnica que pode facilitar a compreensão mais profunda do papel do desenvolvimento na evolução troglomorphic é toda a montagem hibridação in situ. Esta técnica pode ser implementada para diretamente comparar a expressão gênica entre as formas e superfície-habitações na caverna, nomear candidato genes subjacentes QTL estabelecida, identificar os genes de interesse em estudos de sequenciamento de nova geração ou desenvolver outros abordagens de descoberta. Neste relatório, nós apresentamos um protocolo simples, apoiado por uma lista de verificação flexível, que pode ser amplamente adaptada para o uso bem além do sistema de estudo apresentado. Espera-se que este protocolo pode servir como um grande recurso para a comunidade de Astyanax e além.

Introduction

Hibridação in situ é um método comum para coloração de tecidos fixos para visualizar de padrões de expressão de gene1. Esta técnica tem sido realizada há anos em outros tradicionais2 e não-tradicionais3 sistemas de modelo, para uma variedade de estudos biológicos. No entanto, várias etapas e os reagentes são necessários para executar com êxito este procedimento. Para os investigadores que nunca tenham realizado esta técnica, iniciar o processo pode ser intimidante, devido as muitas etapas envolvidas. Além disso, a natureza longa deste procedimento presta-se a erros técnicos, que podem ser um desafio para solucionar problemas.

O objetivo geral deste artigo é apresentar um método simples e direto que irá processar esta técnica de hibridização acessível a um vasto público. Para reduzir a introdução de erros, nós apresentamos uma abordagem direta que produz coloração de expressão do gene de alta qualidade e minimiza o sinal de fundo específico. Este procedimento é semelhante a outras abordagens desenvolvidas em sistemas modelo tradicional, como Danio rerio4. Aqui, pretendemos facilitar a aplicação cuidadosa de cada etapa usando uma lista de verificação para download (arquivo suplementar 1), para promover a aplicação cuidadosa do protocolo. A justificativa para fazer isto é para facilitar a organização através dos muitos passos envolvidos neste procedimento. Este artigo é apropriado para pesquisadores interessados em realizar toda a montagem hibridização in situ no desenvolvimento de embriões, mas ainda não ter realizado o procedimento. A vantagem da abordagem escolhida por pesquisadores de Astyanax é que tem sido testada e comprovada em cavefish e morfos de peixe de superfície, facilitando a análise comparativa da expressão. O método apresentado pode ser usado por pesquisadores em estudos sobre Astyanax e outros sistemas.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da University of Cincinnati (protocolo #10-01-01-21). 1. fixação Isolar o número desejado de Astyanax mexicanus embriões de um tanque de reprodução e corrigir ~ 50 embriões de cada vez. Se os embriões são grandes e antigos, pode ser necessário fixar 25 ao mesmo tempo para garantir a fixação do mesmo. Dependendo da idade do embrião, …

Representative Results

Neste relatório, nós fornecemos uma abordagem simples e direta para executar a rotulagem de espécimes de Astyanax embrionárias para análise de expressão do gene de alta qualidade. Esta técnica pode ser realizada em quatro ou cinco dias, e cada etapa principal do procedimento é representada em um fluxograma com codificação de cores (Figura 1). Depois de concluído, manchada de embriões devem abrigar um rótulo cromático roxo escuro em teci…

Discussion

Devido à vulnerabilidade do RNA, a degradação, um dos passos mais importantes no protocolo refere-se a síntese estéril da sonda RNA. No entanto, se uma sonda com cuidado é gerada e fornece bons resultados, ele pode ser reutilizado em reações de coloração subsequentes. Um segundo passo crucial é a produção cuidadosa de todos os reagentes utilizados em todo o protocolo. Uma vez que este protocolo envolve vários dias e muitos pequenos passos, é essencial que todos os reagentes são com precisão produzidos e …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores desejam agradecer membros do laboratório Gross para comentários úteis sobre este manuscrito. Gostaríamos de reconhecer quatro estudantes do ensino médio que utilizaram este protocolo durante os estágios de verão em 2017 e 2018, incluindo David Nwankwo, Michael Warden, Aki Li e Christine Cao. HL foi apoiado por uma bolsa UC biologia tronco durante o verão de 2017. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional da ciência (DEB-1457630 de JBG) e institutos nacionais de dentária e Craniofacial Research (NIH; DE025033 de JBG).

Materials

10 mL Serological Pipette VWR 89130-888
1000 mL Filtration Unit VWR 89220-698
15 mL Conical VWR-Greiner 82050-278
25 mL Serological Pipette VWR 89130-890
250 mL Filtration Unit VWR 89220-694
5 mL Serological Pipette VWR 89130-886
50 mL Conical VWR-Falcon 21008-940
500 mL Filtration Unit VWR 89220-696
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma-Roche 11093274910
BCIP Sigma-Aldrich B8503-1G 1 g
Blocking Solution Sigma-Roche 11 096 176 001 50 g
Citric Acid Fisher Scientific A104-500 500 g
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Sigma-Roche 11175025910
Eppendorf Tubes VWR 20170-577
Ethanol Fisher-Decon 04-355-223 1 Gal
Formamide Thermo Fisher Scientific 17899 100 mL
Glass dram vials VWR 66011-041 1 Dr
Glass Pipettes Fisher Scientific 13-678-8A
HCl Thermal-ScientificPharmco-AAPER 284000ACS 500 mL
Heparin Sigma H3393-25KU
Magnesium Chloride-crystalline Fisher Scientific M33-500 500 g
Maleic Acid Sigma M0375-100g 100g
Methanol Fisher Scientific A452-4 4L
Molecular-grade Water (RNase-free) VWR 7732-18-5 500 mL
NaCl Fisher Scientific S271-3 3 kg
NaOH pellets Fisher Scientific S318-500 500 g
NBT Substrate powder ThermoFisher Scientific 34035 1 g
Normal Goat Serum Fisher-Invitrogen 31873
Nutating Mixer VWR 82007-202
Paraformaldehyde Sigma 158127-500g 500 g
PBS 10x Fisher Scientific BP399-20 20L
Proteinase K (200mg/10ml) Qiagen 19133 10 mL
Plastic Pipettes VWR-Samco 14670-147
RNAse Sigma R2020-250mL 250 mL
Shaking Water Bath 12 L VWR 10128-126 12 L
Standard Analog Shaker VWR 89032-092
Tris Sigma Millipore-OmniPur 9210-500GM 500 g
tRNA Yeast Fisher-Invitrogen 15401011 25 mg
Tween 20 Sigma P9416-50mL 50 mL
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc 50-728-002
Lithium Chloride (LiCl) Sigma-Aldrich 203637-10G 10 g

References

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Cite This Article
Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos. J. Vis. Exp. (145), e59114, doi:10.3791/59114 (2019).

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