Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax
Summary
Este protocolo permite a visualização da expressão gênica em embrionárias Astyanax cavefish. Esta abordagem foi desenvolvida com o objetivo de maximizar o sinal de expressão do gene, minimizando a coloração de fundo específico.
Abstract
Nos últimos anos, foi lançado um genoma de projecto para o cego mexicano cavefish (Astyanax mexicanus), revelando as identidades de sequência para milhares de genes. Pesquisas anteriores neste sistema modelo emergente capitalizou investigações abrangentes de todo o genoma que identificaram numerosos loci de traço quantitativos (QTL) associado com vários fenótipos associados a caverna. No entanto, a capacidade de conectar os genes de interesse para a base hereditária para mudança fenotípica permanece um desafio significativo. Uma técnica que pode facilitar a compreensão mais profunda do papel do desenvolvimento na evolução troglomorphic é toda a montagem hibridação in situ. Esta técnica pode ser implementada para diretamente comparar a expressão gênica entre as formas e superfície-habitações na caverna, nomear candidato genes subjacentes QTL estabelecida, identificar os genes de interesse em estudos de sequenciamento de nova geração ou desenvolver outros abordagens de descoberta. Neste relatório, nós apresentamos um protocolo simples, apoiado por uma lista de verificação flexível, que pode ser amplamente adaptada para o uso bem além do sistema de estudo apresentado. Espera-se que este protocolo pode servir como um grande recurso para a comunidade de Astyanax e além.
Introduction
Hibridação in situ é um método comum para coloração de tecidos fixos para visualizar de padrões de expressão de gene1. Esta técnica tem sido realizada há anos em outros tradicionais2 e não-tradicionais3 sistemas de modelo, para uma variedade de estudos biológicos. No entanto, várias etapas e os reagentes são necessários para executar com êxito este procedimento. Para os investigadores que nunca tenham realizado esta técnica, iniciar o processo pode ser intimidante, devido as muitas etapas envolvidas. Além disso, a natureza longa deste procedimento presta-se a erros técnicos, que podem ser um desafio para solucionar problemas.
O objetivo geral deste artigo é apresentar um método simples e direto que irá processar esta técnica de hibridização acessível a um vasto público. Para reduzir a introdução de erros, nós apresentamos uma abordagem direta que produz coloração de expressão do gene de alta qualidade e minimiza o sinal de fundo específico. Este procedimento é semelhante a outras abordagens desenvolvidas em sistemas modelo tradicional, como Danio rerio4. Aqui, pretendemos facilitar a aplicação cuidadosa de cada etapa usando uma lista de verificação para download (arquivo suplementar 1), para promover a aplicação cuidadosa do protocolo. A justificativa para fazer isto é para facilitar a organização através dos muitos passos envolvidos neste procedimento. Este artigo é apropriado para pesquisadores interessados em realizar toda a montagem hibridização in situ no desenvolvimento de embriões, mas ainda não ter realizado o procedimento. A vantagem da abordagem escolhida por pesquisadores de Astyanax é que tem sido testada e comprovada em cavefish e morfos de peixe de superfície, facilitando a análise comparativa da expressão. O método apresentado pode ser usado por pesquisadores em estudos sobre Astyanax e outros sistemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido à vulnerabilidade do RNA, a degradação, um dos passos mais importantes no protocolo refere-se a síntese estéril da sonda RNA. No entanto, se uma sonda com cuidado é gerada e fornece bons resultados, ele pode ser reutilizado em reações de coloração subsequentes. Um segundo passo crucial é a produção cuidadosa de todos os reagentes utilizados em todo o protocolo. Uma vez que este protocolo envolve vários dias e muitos pequenos passos, é essencial que todos os reagentes são com precisão produzidos e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer membros do laboratório Gross para comentários úteis sobre este manuscrito. Gostaríamos de reconhecer quatro estudantes do ensino médio que utilizaram este protocolo durante os estágios de verão em 2017 e 2018, incluindo David Nwankwo, Michael Warden, Aki Li e Christine Cao. HL foi apoiado por uma bolsa UC biologia tronco durante o verão de 2017. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional da ciência (DEB-1457630 de JBG) e institutos nacionais de dentária e Craniofacial Research (NIH; DE025033 de JBG).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
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