Ce protocole permet la visualisation de l’expression génique dans embryonnaires agassizii Astyanax . Cette approche a été développée avec l’objectif de maximiser le signal d’expression de gène, tout en minimisant la coloration de fond non spécifique.
Ces dernières années, un génome de projet pour les aveugles agassizii mexicain (Astyanax mexicanus) a été libéré, révéler l’identité de séquence pour des milliers de gènes. Des recherches antérieures dans ce nouveau système de modèle capitalisé sur les enquêtes de génome complets qui ont identifié plusieurs QTL (QTL) associé à divers phénotypes associés à la grotte. Toutefois, la possibilité de connecter des gènes d’intérêt à la base héréditaire de changement phénotypique demeure un défi important. Une technique qui peut faciliter une compréhension plus profonde du rôle du développement dans l’évolution de la troglomorphic est entier-montez l’hybridation in situ. Cette technique peut être implémentée pour directement comparer l’expression des gènes entre les formes vivant dans les grottes et surface, désigner candidat gènes qui sous-tendent les QTL établie, identifier des gènes d’intérêt provenant d’études de la nouvelle génération de séquençage ou développer autre approches axées sur la découverte. Dans ce rapport, nous présentons un protocole simple, accompagné d’une liste de contrôle flexible, qui peut être largement adapté pour une utilisation bien au-delà du système de l’étude présentée. Il est à espérer que ce protocole peut servir comme une grande ressource pour la communauté Astyanax et au-delà.
Hybridation in situ est une méthode commune pour la coloration des tissus fixés pour visualiser gene expression patterns1. Cette technique a été réalisée pour années dans d’autres traditionnels2 et systèmes de modèles non traditionnels3 , pour une variété d’études biologiques. Cependant, plusieurs étapes et les réactifs sont nécessaires pour réaliser avec succès cette procédure. Pour les enquêteurs qui n’ont jamais fait cette technique, il peut être intimidant en raison des nombreuses étapes d’amorcer le processus. En outre, la nature longue de cette procédure se prête à des fautes techniques, qui peuvent être difficile à résoudre.
L’objectif général du présent article est de présenter une méthode simple et directe qui rendra cette technique d’hybridation accessible à un large public. Afin de réduire l’introduction d’erreurs, nous présentons une approche simple qui donne expression de gène de haute qualité coloration et minimise le signal de fond non spécifique. Cette procédure est similaire aux autres approches développées dans les systèmes de modèle traditionnel, comme le Danio rerio4. Ici, nous visons à faciliter l’application minutieuse de chaque étape à l’aide d’une liste téléchargeable (fichier supplémentaire 1), à promouvoir l’application minutieuse du protocole. La raison d’être pour ce faire est de faciliter l’organisation à travers les nombreuses étapes dans cette procédure. Cet article est approprié pour les chercheurs intéressés dans l’accomplissement entier-montez l’hybridation in situ dans le développement des embryons, mais n’ont pas encore effectué la procédure. L’avantage de l’approche choisie pour Astyanax chercheurs est qu’il a été testé et prouvé en agassizii et morphes de poissons de surface, ce qui facilite les analyses comparatives d’expression. La méthode présentée peut être utilisée par des chercheurs en études sur les autres systèmes et Astyanax .
En raison de la vulnérabilité de l’ARN à la dégradation, une des étapes plus critiques dans le protocole porte sur la synthèse stérile de la sonde d’ARN. Toutefois, si une sonde est générée avec soin et donne de bons résultats, il peut être réutilisé dans des réactions subséquentes de coloration. Une seconde étape cruciale est la production minutieuse de tous les réactifs utilisés tout au long du protocole. Ce protocole implique plusieurs jours et nombreuses petites étapes, il est essentiel que to…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire brut des commentaires utiles sur ce manuscrit. Nous tenons à souligner quatre lycéens qui utilise ce protocole au cours de stages d’été en 2017 et 2018, dont Christine Cao, Michael Warden, Aki Li et David Nwankwo. HL était soutenue par une bourse de recherche de souches de biologie UC pendant l’été de 2017. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (DEB-1457630 de JBG) et le National Institutes of Dental and Craniofacial Research (NIH ; DE025033 à JBG).
10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |