Wholemount In Situ hybridisering för Astyanax embryon
Summary
Detta protokoll möjliggör visualisering av genuttryck i embryonala Astyanax släktet. Detta synsätt har utvecklats med målet att maximera gen uttryck signal, samtidigt minimera ospecifika bakgrundsfärgning.
Abstract
Under de senaste åren har ett utkast till genomet för den blinda mexikanska släktet (Astyanax mexicanus) släppts, avslöjar sekvens identiteter för tusentals gener. Tidigare forskning i detta framväxande modellsystem aktiveras på omfattande genome-wide utredningar som har identifierat ett flertal kvantitativa loci (QTL) associerade med olika cave-associerade fenotyper. Möjlighet att ansluta gener av intresse till den ärftliga grunden för fenotypisk förändring är dock fortfarande en stor utmaning. En teknik som kan underlätta djupare förståelse av utvecklingen i troglomorphic evolution roll är hela-mount in situ hybridisering. Denna teknik kan genomföras för att direkt jämföra genuttryck mellan – och surface-grottboende former, nominera kandidat gener bakom etablerade QTL, identifiera gener av intresse från nästa generations sekvensering studier eller utvecklar andra Discovery-baserade metoder. I denna rapport presenterar vi ett enkelt protokoll, stöds av en flexibel checklista, som allmänt kan anpassas för användning utöver presenterade studien systemet. Förhoppningen är att detta protokoll kan tjäna som en bred resurs för Astyanax gemenskapen och bortom.
Introduction
In situ hybridisering är en vanlig metod för färgning fasta vävnader för att visualisera gen uttryck mönster1. Denna teknik har utförts i år i andra traditionella2 och icke-traditionella3 modellsystem, för en mängd olika biologiska studier. Dock är flera steg och reagenser nödvändiga för att kunna utföra denna procedur. För utredare som aldrig har utfört denna teknik, kan det vara skrämmande på grund av de många olika stegen att inleda processen. Dessutom lämpar långa arten av denna procedur sig för tekniska fel, som kan vara svårt för att felsöka.
Det övergripande målet för den här artikeln är att presentera en enkel och okomplicerad metod som kommer att göra denna hybridisering teknik tillgänglig för en bred publik. För att minska införandet av fel, presenterar vi en okomplicerad metod som ger hög kvalitet gen uttryck färgning och minimerar icke-specifik bakgrund signal. Proceduren liknar andra strategier som utvecklats i traditionell modellsystem, såsom Danio rerio4. Här, vi strävar efter att underlätta noggrann genomförandet av varje steg använder en nedladdningsbara checklista (kompletterande fil 1), att främja försiktig genomförande av protokollet. Motiven för att göra detta är att underlätta organisationen genom de många olika stegen i den här proceduren. Denna artikel är lämpligt för forskare som är intresserade av att utföra hela-mount in situ hybridisering i utvecklingen av embryon, men ännu inte har utfört proceduren. Fördelen med den valda metoden för Astyanax forskare är att det har testats och visat i både släktet och ytan fisk morphs, därigenom underlätta jämförande uttryck analyser. Denna metod kan användas av forskare i studier på Astyanax och andra system.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av RNA sårbarhet för nedbrytning gäller en av de viktigaste stegen i protokollet sterila syntesen av RNA sonden. Dock om en sond genereras noga och ger bra resultat, kan den återanvändas i efterföljande färgning reaktioner. En andra avgörande steget är noga med produktionen av alla reagenser som används i hela protokollet. Eftersom detta protokoll innebär flera dagar och många små steg, är det viktigt att alla reagenser är korrekt produceras och lagras i ett sterilt sätt. Vidare är det principi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka medlemmarna i brutto lab för hjälpsamma kommentarer på detta manuskript. Vi vill uppmärksamma fyra gymnasieelever som utnyttjade detta protokoll under sommaren praktik i 2017 och 2018, inklusive Christine Cao, Michael Warden, Aki Li och David Nwankwo. HL stöddes av en UC biologi STEM gemenskap under sommaren 2017. Detta arbete stöds av bidrag från National Science Foundation (DEB-1457630 till JBG), nationella institut av tandvård och kraniofaciala forskning (NIH; DE025033 till JBG).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
