Summary

Wholemount In Situ hybridisering för Astyanax embryon

Published: March 02, 2019
doi:

Summary

Detta protokoll möjliggör visualisering av genuttryck i embryonala Astyanax släktet. Detta synsätt har utvecklats med målet att maximera gen uttryck signal, samtidigt minimera ospecifika bakgrundsfärgning.

Abstract

Under de senaste åren har ett utkast till genomet för den blinda mexikanska släktet (Astyanax mexicanus) släppts, avslöjar sekvens identiteter för tusentals gener. Tidigare forskning i detta framväxande modellsystem aktiveras på omfattande genome-wide utredningar som har identifierat ett flertal kvantitativa loci (QTL) associerade med olika cave-associerade fenotyper. Möjlighet att ansluta gener av intresse till den ärftliga grunden för fenotypisk förändring är dock fortfarande en stor utmaning. En teknik som kan underlätta djupare förståelse av utvecklingen i troglomorphic evolution roll är hela-mount in situ hybridisering. Denna teknik kan genomföras för att direkt jämföra genuttryck mellan – och surface-grottboende former, nominera kandidat gener bakom etablerade QTL, identifiera gener av intresse från nästa generations sekvensering studier eller utvecklar andra Discovery-baserade metoder. I denna rapport presenterar vi ett enkelt protokoll, stöds av en flexibel checklista, som allmänt kan anpassas för användning utöver presenterade studien systemet. Förhoppningen är att detta protokoll kan tjäna som en bred resurs för Astyanax gemenskapen och bortom.

Introduction

In situ hybridisering är en vanlig metod för färgning fasta vävnader för att visualisera gen uttryck mönster1. Denna teknik har utförts i år i andra traditionella2 och icke-traditionella3 modellsystem, för en mängd olika biologiska studier. Dock är flera steg och reagenser nödvändiga för att kunna utföra denna procedur. För utredare som aldrig har utfört denna teknik, kan det vara skrämmande på grund av de många olika stegen att inleda processen. Dessutom lämpar långa arten av denna procedur sig för tekniska fel, som kan vara svårt för att felsöka.

Det övergripande målet för den här artikeln är att presentera en enkel och okomplicerad metod som kommer att göra denna hybridisering teknik tillgänglig för en bred publik. För att minska införandet av fel, presenterar vi en okomplicerad metod som ger hög kvalitet gen uttryck färgning och minimerar icke-specifik bakgrund signal. Proceduren liknar andra strategier som utvecklats i traditionell modellsystem, såsom Danio rerio4. Här, vi strävar efter att underlätta noggrann genomförandet av varje steg använder en nedladdningsbara checklista (kompletterande fil 1), att främja försiktig genomförande av protokollet. Motiven för att göra detta är att underlätta organisationen genom de många olika stegen i den här proceduren. Denna artikel är lämpligt för forskare som är intresserade av att utföra hela-mount in situ hybridisering i utvecklingen av embryon, men ännu inte har utfört proceduren. Fördelen med den valda metoden för Astyanax forskare är att det har testats och visat i både släktet och ytan fisk morphs, därigenom underlätta jämförande uttryck analyser. Denna metod kan användas av forskare i studier på Astyanax och andra system.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid University of Cincinnati (protokoll nr 10-01-21-01). 1. fixering Isolera önskat antal Astyanax mexicanus embryon från en avel tank och åtgärda ~ 50 embryon i taget. Om embryon är stora och gamla, kan det vara nödvändigt att fixa 25 samtidigt för att säkerställa jämn fixering. Beroende på ålder av embryot, använder du metoden IACUC go…

Representative Results

I denna rapport ger vi en enkel och okomplicerad metod för att utföra märkning av embryonala Astyanax exemplar för högkvalitativa gen uttryck analys. Denna teknik kan utföras antingen fyra eller fem dagar, och varje huvudsakliga steg i förfarandet är representerad i ett färgkodade flödesschema (figur 1). När klar, bör färgade embryon hysa en mörk lila kromatisk etikett i vävnader som uttrycker den särskild gen av intresse. Vi har fram…

Discussion

På grund av RNA sårbarhet för nedbrytning gäller en av de viktigaste stegen i protokollet sterila syntesen av RNA sonden. Dock om en sond genereras noga och ger bra resultat, kan den återanvändas i efterföljande färgning reaktioner. En andra avgörande steget är noga med produktionen av alla reagenser som används i hela protokollet. Eftersom detta protokoll innebär flera dagar och många små steg, är det viktigt att alla reagenser är korrekt produceras och lagras i ett sterilt sätt. Vidare är det principi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka medlemmarna i brutto lab för hjälpsamma kommentarer på detta manuskript. Vi vill uppmärksamma fyra gymnasieelever som utnyttjade detta protokoll under sommaren praktik i 2017 och 2018, inklusive Christine Cao, Michael Warden, Aki Li och David Nwankwo. HL stöddes av en UC biologi STEM gemenskap under sommaren 2017. Detta arbete stöds av bidrag från National Science Foundation (DEB-1457630 till JBG), nationella institut av tandvård och kraniofaciala forskning (NIH; DE025033 till JBG).

Materials

10 mL Serological Pipette VWR 89130-888
1000 mL Filtration Unit VWR 89220-698
15 mL Conical VWR-Greiner 82050-278
25 mL Serological Pipette VWR 89130-890
250 mL Filtration Unit VWR 89220-694
5 mL Serological Pipette VWR 89130-886
50 mL Conical VWR-Falcon 21008-940
500 mL Filtration Unit VWR 89220-696
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma-Roche 11093274910
BCIP Sigma-Aldrich B8503-1G 1 g
Blocking Solution Sigma-Roche 11 096 176 001 50 g
Citric Acid Fisher Scientific A104-500 500 g
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Sigma-Roche 11175025910
Eppendorf Tubes VWR 20170-577
Ethanol Fisher-Decon 04-355-223 1 Gal
Formamide Thermo Fisher Scientific 17899 100 mL
Glass dram vials VWR 66011-041 1 Dr
Glass Pipettes Fisher Scientific 13-678-8A
HCl Thermal-ScientificPharmco-AAPER 284000ACS 500 mL
Heparin Sigma H3393-25KU
Magnesium Chloride-crystalline Fisher Scientific M33-500 500 g
Maleic Acid Sigma M0375-100g 100g
Methanol Fisher Scientific A452-4 4L
Molecular-grade Water (RNase-free) VWR 7732-18-5 500 mL
NaCl Fisher Scientific S271-3 3 kg
NaOH pellets Fisher Scientific S318-500 500 g
NBT Substrate powder ThermoFisher Scientific 34035 1 g
Normal Goat Serum Fisher-Invitrogen 31873
Nutating Mixer VWR 82007-202
Paraformaldehyde Sigma 158127-500g 500 g
PBS 10x Fisher Scientific BP399-20 20L
Proteinase K (200mg/10ml) Qiagen 19133 10 mL
Plastic Pipettes VWR-Samco 14670-147
RNAse Sigma R2020-250mL 250 mL
Shaking Water Bath 12 L VWR 10128-126 12 L
Standard Analog Shaker VWR 89032-092
Tris Sigma Millipore-OmniPur 9210-500GM 500 g
tRNA Yeast Fisher-Invitrogen 15401011 25 mg
Tween 20 Sigma P9416-50mL 50 mL
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc 50-728-002
Lithium Chloride (LiCl) Sigma-Aldrich 203637-10G 10 g

References

  1. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
  2. Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
  3. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  5. Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
  6. Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
  7. Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
  8. Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
  9. Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
  10. Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
  11. Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
  12. Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
  13. Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).

Play Video

Cite This Article
Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos. J. Vis. Exp. (145), e59114, doi:10.3791/59114 (2019).

View Video