Wholemount в гибридизации Situ Астианакт эмбрионов
Summary
Этот протокол позволяет визуализации экспрессии генов в эмбриональных Астианакт cavefish. Этот подход был разработан с целью максимального сигнала выражения гена, минимизируя фон неспецифичный пятнать.
Abstract
В последние годы были освобождены проект генома для слепых мексиканской cavefish (Астианакт гракл), выявление последовательности идентификаторов для тысяч генов. Предыдущие исследования в этой формирующейся системе модель капитализируются на комплексные исследования генома общесистемной, которые выявили многочисленные локусов количественных признаков (QTL) связанные с различных связанных пещера фенотипов. Однако возможность подключения гены интереса к наследственным основы для фенотипические изменения остается серьезной проблемой. Один из методов, которые могут способствовать более глубокое понимание роли развития в эволюции troglomorphic — целое гора в гибридизации situ. Этот метод может быть реализован для непосредственно сравнить экспрессии генов между формами и поверхности местонахождения троглофильных, кандидата генов, лежащие в основе созданной QTL, идентифицировать гены интереса от следующего поколения последовательности исследований или разрабатывать другие подходы, основанные на открытие. В настоящем докладе мы представляем простой протокол, поддерживаемый гибкие контрольный список, который может быть широко адаптирована для использования далеко за рамки представленного исследования системы. Остается надеяться, что этот протокол может служить широкий ресурс для Астианакт сообщества и за его пределами.
Introduction
Гибридизации in situ является распространенным методом для окрашивания фиксированных тканей для визуализации ген выражение модели1. Эта техника была выполнена для лет в других традиционных2 и нетрадиционных3 модели систем, для различных биологических исследований. Однако несколько шагов и реактивы необходимы для успешного выполнения этой процедуры. Для следователей, которые никогда не выполнили эту технику инициирование процесса может быть пугающим из-за многих этапов. Кроме того длительный характер этой процедуры поддается технические ошибки, которые могут быть сложным для устранения неполадок.
Общая цель этой статьи заключается в простой и прямой метод, который будет отображать этот гибридизации метод доступным для широкой аудитории. Чтобы уменьшить введение ошибок, мы представляем простой подход, который дает высокое качество ген выражение окрашивание и минимизирует неспецифической фонового сигнала. Эта процедура похожа на другие подходы, разработанные в традиционной модели систем, таких как данио рерио4. Здесь мы стремимся содействовать тщательного выполнения каждого шага, используя загружаемый контрольный (дополнительный файл 1), для содействия тщательного осуществления протокола. Обоснование этого заключается в содействии Организации через многие этапы этой процедуры. Эта статья подходит для исследователей, заинтересованных в выполнении всего гора гибридизации in situ в развивающихся эмбрионов, но пока еще не выполнили процедуру. Преимущество выбранного подхода для Астианакт исследователей является, что он было проверено и доказано в cavefish и поверхности рыбы морф, способствуя тем самым сравнительного выражения анализа. Представленный метод может использоваться исследователями в исследованиях по Астианакт и других систем.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ввиду уязвимости РНК к деградации одним из наиболее важных шагов в протокол касается стерильных синтез РНК зонда. Однако если зонд тщательно создается и дает хорошие результаты, то могут использоваться в последующих реакций окрашивания. Вторым важным шагом является тщательное произв?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить членов брутто лаборатории за полезные замечания по этой рукописи. Мы хотим отметить четыре учащихся средней школы, которые использовали этот протокол во время летней стажировки в 2017 и 2018, включая Christine Цао, Майкл Уорден, Аки Li и Дэвид Нванкво. HL поддержал UC биологии стволовых стипендий в течение лета 2017. Эта работа была поддержана субсидии от национального научного фонда (DEB-1457630 до JBG) и национальные институты стоматологических и челюстно-лицевой исследований (низ; DE025033 для JBG).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
