Summary

Wholemount в гибридизации Situ Астианакт эмбрионов

Published: March 02, 2019
doi:

Summary

Этот протокол позволяет визуализации экспрессии генов в эмбриональных Астианакт cavefish. Этот подход был разработан с целью максимального сигнала выражения гена, минимизируя фон неспецифичный пятнать.

Abstract

В последние годы были освобождены проект генома для слепых мексиканской cavefish (Астианакт гракл), выявление последовательности идентификаторов для тысяч генов. Предыдущие исследования в этой формирующейся системе модель капитализируются на комплексные исследования генома общесистемной, которые выявили многочисленные локусов количественных признаков (QTL) связанные с различных связанных пещера фенотипов. Однако возможность подключения гены интереса к наследственным основы для фенотипические изменения остается серьезной проблемой. Один из методов, которые могут способствовать более глубокое понимание роли развития в эволюции troglomorphic — целое гора в гибридизации situ. Этот метод может быть реализован для непосредственно сравнить экспрессии генов между формами и поверхности местонахождения троглофильных, кандидата генов, лежащие в основе созданной QTL, идентифицировать гены интереса от следующего поколения последовательности исследований или разрабатывать другие подходы, основанные на открытие. В настоящем докладе мы представляем простой протокол, поддерживаемый гибкие контрольный список, который может быть широко адаптирована для использования далеко за рамки представленного исследования системы. Остается надеяться, что этот протокол может служить широкий ресурс для Астианакт сообщества и за его пределами.

Introduction

Гибридизации in situ является распространенным методом для окрашивания фиксированных тканей для визуализации ген выражение модели1. Эта техника была выполнена для лет в других традиционных2 и нетрадиционных3 модели систем, для различных биологических исследований. Однако несколько шагов и реактивы необходимы для успешного выполнения этой процедуры. Для следователей, которые никогда не выполнили эту технику инициирование процесса может быть пугающим из-за многих этапов. Кроме того длительный характер этой процедуры поддается технические ошибки, которые могут быть сложным для устранения неполадок.

Общая цель этой статьи заключается в простой и прямой метод, который будет отображать этот гибридизации метод доступным для широкой аудитории. Чтобы уменьшить введение ошибок, мы представляем простой подход, который дает высокое качество ген выражение окрашивание и минимизирует неспецифической фонового сигнала. Эта процедура похожа на другие подходы, разработанные в традиционной модели систем, таких как данио рерио4. Здесь мы стремимся содействовать тщательного выполнения каждого шага, используя загружаемый контрольный (дополнительный файл 1), для содействия тщательного осуществления протокола. Обоснование этого заключается в содействии Организации через многие этапы этой процедуры. Эта статья подходит для исследователей, заинтересованных в выполнении всего гора гибридизации in situ в развивающихся эмбрионов, но пока еще не выполнили процедуру. Преимущество выбранного подхода для Астианакт исследователей является, что он было проверено и доказано в cavefish и поверхности рыбы морф, способствуя тем самым сравнительного выражения анализа. Представленный метод может использоваться исследователями в исследованиях по Астианакт и других систем.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Университета Цинциннати (протокол #10-01-21-01). 1. Фиксация Изолировать желаемое количество эмбрионов Астианакт гракл от разведения танк и исправить ~ 50 эмбрио…

Representative Results

В настоящем докладе мы предоставляем простой и прямой подход для выполнения маркировки эмбриональных Астианакт образцов для анализа выражения гена высокого качества. Эта техника может осуществляться в четыре или пять дней, и каждый основной шаг в процедуре пред…

Discussion

Ввиду уязвимости РНК к деградации одним из наиболее важных шагов в протокол касается стерильных синтез РНК зонда. Однако если зонд тщательно создается и дает хорошие результаты, то могут использоваться в последующих реакций окрашивания. Вторым важным шагом является тщательное произв?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить членов брутто лаборатории за полезные замечания по этой рукописи. Мы хотим отметить четыре учащихся средней школы, которые использовали этот протокол во время летней стажировки в 2017 и 2018, включая Christine Цао, Майкл Уорден, Аки Li и Дэвид Нванкво. HL поддержал UC биологии стволовых стипендий в течение лета 2017. Эта работа была поддержана субсидии от национального научного фонда (DEB-1457630 до JBG) и национальные институты стоматологических и челюстно-лицевой исследований (низ; DE025033 для JBG).

Materials

10 mL Serological Pipette VWR 89130-888
1000 mL Filtration Unit VWR 89220-698
15 mL Conical VWR-Greiner 82050-278
25 mL Serological Pipette VWR 89130-890
250 mL Filtration Unit VWR 89220-694
5 mL Serological Pipette VWR 89130-886
50 mL Conical VWR-Falcon 21008-940
500 mL Filtration Unit VWR 89220-696
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma-Roche 11093274910
BCIP Sigma-Aldrich B8503-1G 1 g
Blocking Solution Sigma-Roche 11 096 176 001 50 g
Citric Acid Fisher Scientific A104-500 500 g
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Sigma-Roche 11175025910
Eppendorf Tubes VWR 20170-577
Ethanol Fisher-Decon 04-355-223 1 Gal
Formamide Thermo Fisher Scientific 17899 100 mL
Glass dram vials VWR 66011-041 1 Dr
Glass Pipettes Fisher Scientific 13-678-8A
HCl Thermal-ScientificPharmco-AAPER 284000ACS 500 mL
Heparin Sigma H3393-25KU
Magnesium Chloride-crystalline Fisher Scientific M33-500 500 g
Maleic Acid Sigma M0375-100g 100g
Methanol Fisher Scientific A452-4 4L
Molecular-grade Water (RNase-free) VWR 7732-18-5 500 mL
NaCl Fisher Scientific S271-3 3 kg
NaOH pellets Fisher Scientific S318-500 500 g
NBT Substrate powder ThermoFisher Scientific 34035 1 g
Normal Goat Serum Fisher-Invitrogen 31873
Nutating Mixer VWR 82007-202
Paraformaldehyde Sigma 158127-500g 500 g
PBS 10x Fisher Scientific BP399-20 20L
Proteinase K (200mg/10ml) Qiagen 19133 10 mL
Plastic Pipettes VWR-Samco 14670-147
RNAse Sigma R2020-250mL 250 mL
Shaking Water Bath 12 L VWR 10128-126 12 L
Standard Analog Shaker VWR 89032-092
Tris Sigma Millipore-OmniPur 9210-500GM 500 g
tRNA Yeast Fisher-Invitrogen 15401011 25 mg
Tween 20 Sigma P9416-50mL 50 mL
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc 50-728-002
Lithium Chloride (LiCl) Sigma-Aldrich 203637-10G 10 g

References

  1. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
  2. Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
  3. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  5. Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
  6. Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
  7. Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
  8. Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
  9. Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
  10. Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
  11. Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
  12. Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
  13. Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).

Play Video

Cite This Article
Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos. J. Vis. Exp. (145), e59114, doi:10.3791/59114 (2019).

View Video