Summary

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

Published: March 02, 2019
doi:

Summary

Bu iletişim kuralı embriyonik Astyanax cavefish gen ifadesinde görselleştirme sağlar. Bu yaklaşım belirsiz arka plan boyama en aza indirerek gen ifade sinyal, en üst düzeye çıkarma amacı ile geliştirilmiştir.

Abstract

Son yıllarda, kör Meksika cavefish (Astyanax mexicanus) için bir taslak genom, binlerce gen için sıra kimlik açığa çıktı. Ortaya çıkan bu model sistem içine önceden araştırma çeşitli mağara ilişkili fenotipleri ile ilişkili çok sayıda nicel özellik loci (QTL) belirledik kapsamlı genom geniş araştırmalar üzerinde büyük harf. Ancak, faiz genler kalıtsal olarak fenotipik değiştirmek için bağlanma olanağı önemli bir meydan okuma kalır. Troglomorphic evrim gelişiminde rolü daha derin bir anlayış kolaylaştıran bir bütün-mount In situ hibridizasyon tekniktir. Bu teknik doğrudan gen ekspresyonu mağaralarda ve yüzey yaşayan biçimler arasında karşılaştırmak, kurulan QTL altında yatan genlerin aday, genlerin yeni nesil sıralama çalışmalar dan ilgi tanımlamak veya diğer geliştirmek için uygulanabilir keşif dayalı yaklaşımlar. Bu raporda, yaygın olarak sunulan çalışma sistemi çok ötesinde kullanmak için adapte edilebilir bir esnek denetim listesi tarafından desteklenen basit bir protokol tanıtacağız. Bu iletişim kuralı Astyanax toplum için ve ötesinde geniş bir kaynak olarak hizmet verebilir umulmaktadır.

Introduction

İn situ hibridizasyon gen ifade desenleri1görselleştirmek için sabit dokular boyama için yaygın bir yöntemdir. Bu teknik için diğer geleneksel2 ve geleneksel olmayan3 model sistemleri, yıllardır biyolojik çalışmalar çeşitli yapıldı. Ancak, birkaç adım ve Kimyasalları başarıyla bu yordamı gerçekleştirmek gereklidir. Hiç bu teknik yapmadıysanız müfettişler için işlemini Başlatan birçok adımları nedeniyle korkutabilir. Ayrıca, bu yordamı uzun doğası ile ilgili sorun giderme için zorlu teknik hatalar için oldukça rahat.

Bu makalede genel amacı bu hibridizasyon teknik geniş bir kitleye için erişilebilir hale getirecek bir basit ve kolay yöntem sunmaktır. Giriş hataları azaltmak için yüksek kaliteli gen ifade boyama verimleri ve non-spesifik arka sinyal en aza indirir basit bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yordamı diğer yaklaşımlar Danio rerio4gibi geleneksel modeli sistemlerde gelişmiş benzer. Burada, dikkatli dikkatli uygulama Protokolü’nün tanıtmak için indirilebilir bir kontrol listesi (ek dosya 1) kullanarak her adım uygulanması kolaylaştırmak hedefliyoruz. Bunu yapmak için gerekçe bu yordamda birçok adımlar ile organizasyon kolaylaştırmaktır. Bu makalede araştırmacılar embriyo geliştirilmesinde bütün-mount In situ hibridizasyon gerçekleştirmede baktılar için uygundur, ancak henüz işlem yapmamış. Astyanax araştırmacılar için seçilen yaklaşımı bu test edilmiş ve kanıtlanmış cavefish ve yüzey balık morphs, böylece karşılaştırmalı ifade analizleri kolaylaştırmak avantajdır. Astyanax ve diğer sistemlerde çalışmalarda araştırmacılar tarafından sunulan yöntem kullanılabilir.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Cincinnati Üniversitesi (iletişim kuralı #10-01-21-01) tarafından onaylanmış olması. 1. fiksasyon İstediğiniz bir üreme tanktan Astyanax mexicanus embriyo sayısını belirleyip ~ 50 embriyo teker teker çözmek. Embriyo büyük ve eski ise, 25 hatta fiksasyon sağlamak için teker teker düzeltmek gerekli olabilir. Embriyo yaş bağlı olarak, anestezi IACUC onaylı yö…

Representative Results

Bu raporda, biz yüksek kaliteli gen ifade analizi için embriyonik Astyanax örneklerin etiketleme gerçekleştirmek için basit ve kolay bir yaklaşım sağlar. Bu teknik dört ya da beş gün içinde yürütülen olabilir ve yordamı asıl her adımda bir renk kodlu akış (şekil 1) temsil edilir. Bir kez tam, lekeli embriyo ilgi belirli gen ifade dokularda koyu mor renk etiket liman. Biz başarıyla bu protokole Pachón cavefish (<strong class="…

Discussion

Bozulması için RNA açığı nedeniyle iletişim kuralındaki en önemli adımlardan biri RNA prob steril sentezi ile ilgili. Bir sonda dikkatli bir şekilde oluşturulur ve iyi sonuçlar sağlar, ancak, bu sonraki boyama reaksiyonlar yeniden kullanılabilir. İkinci önemli bir adım boyunca protokolünün kullanılan tüm reaktifler dikkatli yapımıdır. Bu iletişim kuralı birkaç gün ve birçok küçük adımlar gerektirdiğinden, bu önemlidir tüm reaktifler doğru vardır üretilen ve steril bir şekilde depo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar bu makale yararlı yorumlar için brüt laboratuvar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. 2017 ve 2018 Christine Cao, Michael müdür, Aki Li ve David Nwankwo dahil olmak üzere, yaz staj sırasında bu iletişim kuralı kullanıldığında dört lise öğrencileri kabul etmek istiyorum. HL 2017 yaz aylarında UC Biyoloji Kök bursu tarafından desteklenmiştir. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (JBG için DEB-1457630) ve ulusal kurumları diş ve Fasiyal araştırma (NIH; gelen hibe tarafından desteklenmiştir JBG için DE025033).

Materials

10 mL Serological Pipette VWR 89130-888
1000 mL Filtration Unit VWR 89220-698
15 mL Conical VWR-Greiner 82050-278
25 mL Serological Pipette VWR 89130-890
250 mL Filtration Unit VWR 89220-694
5 mL Serological Pipette VWR 89130-886
50 mL Conical VWR-Falcon 21008-940
500 mL Filtration Unit VWR 89220-696
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma-Roche 11093274910
BCIP Sigma-Aldrich B8503-1G 1 g
Blocking Solution Sigma-Roche 11 096 176 001 50 g
Citric Acid Fisher Scientific A104-500 500 g
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Sigma-Roche 11175025910
Eppendorf Tubes VWR 20170-577
Ethanol Fisher-Decon 04-355-223 1 Gal
Formamide Thermo Fisher Scientific 17899 100 mL
Glass dram vials VWR 66011-041 1 Dr
Glass Pipettes Fisher Scientific 13-678-8A
HCl Thermal-ScientificPharmco-AAPER 284000ACS 500 mL
Heparin Sigma H3393-25KU
Magnesium Chloride-crystalline Fisher Scientific M33-500 500 g
Maleic Acid Sigma M0375-100g 100g
Methanol Fisher Scientific A452-4 4L
Molecular-grade Water (RNase-free) VWR 7732-18-5 500 mL
NaCl Fisher Scientific S271-3 3 kg
NaOH pellets Fisher Scientific S318-500 500 g
NBT Substrate powder ThermoFisher Scientific 34035 1 g
Normal Goat Serum Fisher-Invitrogen 31873
Nutating Mixer VWR 82007-202
Paraformaldehyde Sigma 158127-500g 500 g
PBS 10x Fisher Scientific BP399-20 20L
Proteinase K (200mg/10ml) Qiagen 19133 10 mL
Plastic Pipettes VWR-Samco 14670-147
RNAse Sigma R2020-250mL 250 mL
Shaking Water Bath 12 L VWR 10128-126 12 L
Standard Analog Shaker VWR 89032-092
Tris Sigma Millipore-OmniPur 9210-500GM 500 g
tRNA Yeast Fisher-Invitrogen 15401011 25 mg
Tween 20 Sigma P9416-50mL 50 mL
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc 50-728-002
Lithium Chloride (LiCl) Sigma-Aldrich 203637-10G 10 g

References

  1. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
  2. Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
  3. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  5. Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
  6. Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
  7. Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
  8. Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
  9. Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
  10. Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
  11. Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
  12. Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
  13. Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).

Play Video

Cite This Article
Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos. J. Vis. Exp. (145), e59114, doi:10.3791/59114 (2019).

View Video