Summary
Qui, un protocollo è presentato per l'incapsulamento e la coltura delle cellule in poly(ethylene glycol) (PEG) idrogeli funzionalizzati con un fluorogenic metalloproteinasi (MMP)-peptide degradabile. MMP cellulare e dell'attività metabolica sono misurati direttamente dalle culture idrogel utilizzando un lettore di micropiastre standard.
Abstract
Sistemi di coltura cellulare (3D) tridimensionale spesso ricapitolano più strettamente in vivo risposte cellulari e funzioni rispetto ai sistemi tradizionali cultura bidimensionale (2D). Tuttavia, la misurazione della funzione delle cellule in cultura 3D è spesso più impegnativo. Molti saggi biologici richiedono il recupero di materiale cellulare che può essere difficile nelle culture 3D. Un modo per affrontare questa sfida è di sviluppare nuovi materiali che consentono una misurazione della funzione delle cellule all'interno del materiale. Qui, è presentato un metodo per la misurazione dell'attività di metalloproteasi (MMP) matrice cellulare in idrogel 3D in un formato a 96 pozzetti. In questo sistema, un idrogel di poly(ethylene glycol) (PEG) è funzionalizzato con un sensore di spaccabili MMP fluorogenic. Attività MMP cellulare è proporzionale all'intensità di fluorescenza e può essere misurata con un lettore di micropiastre standard. Miniaturizzazione di questo test in un formato a 96 pozzetti ridotto il tempo necessario per una impostazione sperimentale di 50% e reagente l'utilizzo del 80% per condizione rispetto alla precedente versione di 24 pozzetti del dosaggio. Questo test è anche compatibile con altre misure della funzione cellulare. Ad esempio, un'analisi di attività metabolica è dimostrata qui, che possono essere condotte simultaneamente con misure di attività MMP entro la stessa idrogel. Il dosaggio è dimostrato con cellule di melanoma umano incapsulate in una gamma di densità per determinare la densità di incapsulamento appropriata per il campo di funzionamento del test di semina cellulare. Dopo 24 h di incapsulamento di cellule, MMP e letture di attività metabolica erano proporzionale alla densità di semina cellulare. Mentre il dosaggio è dimostrato qui con un substrato degradabile fluorogenico, il dosaggio e la metodologia potrebbe essere adattati per una vasta gamma di sistemi di idrogel e altri sensori fluorescenti. Tale prova fornisce una piattaforma di coltura 3D pratica, efficiente e facilmente accessibile per una vasta gamma di applicazioni.
Introduction
Sistemi di tridimensionale (3D) cultura spesso più strettamente ricapitolare le risposte cellulari in vivo rispetto ai sistemi tradizionali cultura bidimensionale (2D), vedere diversi eccellenti pubblicazioni1,2,3 . Tuttavia, utilizzando sistemi di coltura 3D per misurare la funzione delle cellule è stato impegnativo a causa della difficoltà di recupero cellulare e ulteriore elaborazione del campione. Questa difficoltà limita la misura di molte funzioni cellulari in sistemi di coltura 3D. Per superare questa difficoltà, sono necessarie nuove tecniche che consentono una facile misurazione della funzione delle cellule all'interno di ambienti 3D. Un modo per rispondere a questa esigenza è lo sviluppo di materiali che non solo supportano la coltura cellulare 3D ma anche incorporare sensori per misurare la funzione delle cellule. Ad esempio, diversi sistemi di idrogel sono integrate moiety spaccabili di proteasi fluorogenic per abilitare la visualizzazione di attività della proteasi all'interno di ambienti 3D4,5,6,7. Mentre questi sistemi erano originariamente utilizzati per l'imaging al microscopio, questi sistemi possono essere adattati per l'uso in un'analisi di attività di metalloproteasi (MMP) matrice globale utilizzando un lettore di piastra standard, consentendo facile misurazione di una funzione di cella in un 3D ambiente8.
MMPs, una superfamiglia di proteasi zinco, giocano un ruolo critico nell'omeostasi del tessuto normale e in molte malattie. MMPs degrada e rimodellare la matrice extracellulare (ECM), fendere citochine e recettori di superficie e attivare altre MMPs9,10. MMPs giocano un ruolo critico in processi fisiologici quali la guarigione della ferita e in malattie come l'artrite, l'aterosclerosi, morbo di Alzheimer e cancro (Vedi recensioni in 9,10,11). Nel cancro, alti livelli di espressione di MMP sono fortemente correlati con metastasi e prognosi12. Inoltre, MMPs contribuiscono alla progressione del tumore, promuovendo l'invasione delle cellule di cancro e migrazione, processi cellulari che sono fenomeni intrinsecamente 3D13,14. Di conseguenza, c'è molto interesse per la capacità di misurare l'attività MMP in 3D cultura in molti contesti, tra cui gli studi biologici fondamentali e saggi di screening di stupefacenti.
Idrogeli PEG sono ampiamente usati per la coltura cellulare 3D a causa del loro alto contenuto di acqua, resistenza all'adsorbimento di proteine e la natura sintonizzabile. Idrogeli PEG funzionalizzati con un numero di moiety alla funzione diretta delle cellule, come ad esempio con peptidi mimetici ECM come RGD, RLD e IKVAV per facilitare l'adesione delle cellule, o diretta tethering di fattori di crescita quali trasformando il fattore di crescita-β (TGF-β) 15,16. Più recentemente, PEG idrogeli sono stati funzionalizzati con peptidi di sensore che consentono una misurazione della funzione delle cellule come ben5,8. In particolare, l'uso di un sistema di idrogel di PEG funzionalizzati con un fluorogenic MMP-degradabile misura peptide attivato di attività MMP cellulare in culture 3D con un lettore di piastra standard e non necessaria alcuna ulteriore elaborazione. Questi sistemi sono compatibili anche con altre misure della funzione cellulare, tra cui attività metabolica. Qui, un protocollo è descritto per la misurazione dell'attività MMP delle cellule coltivate in un 3D idrogel PEG funzionalizzati con un peptide MMP-degradabile fluorogenic e risultati presentati che dimostrano gli esperimenti di ottimizzazione iniziale necessari per l'uso di questo test. Cellule di melanoma umano (A375) sono state incapsulate nel caso degli idrogeli fluorogenic sopra una gamma di densità per determinare le densità di semina appropriate che sono all'interno della gamma di funzionamento del test di semina. Dopo 24 h di incapsulamento, MMP e attività metabolica sono stati misurati utilizzando un lettore di micropiastre standard. Successivamente, attività MMP è stata normalizzata per attività metabolica per determinare la densità di semina all'interno della gamma lineare del dosaggio. Infine, il coefficiente intra-piastra delle percentuali di variazione (% CV) sono stati calcolati tra triplici copie in modo da riflettere la riproducibilità dei risultati ottenuti. Questo metodo consente la coltura cellulare 3D semplice e veloce e facile misurazione dell'attività di proteasi con un campione minimo di elaborazione.
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Protocol
1. idrogel preparazione di componenti
- Sintetizzare i peptidi proteasi-degradabile fluorescenti come descritto altrove8, utilizzando dabcyl come il quencher e della fluorescina come la molecola fluorescente. Sciogliere il peptide in DMSO ad una concentrazione di 10 mM e conservare in un congelatore a-80 ° C in piccole aliquote (~ 30 µ l) per evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
Nota: Questi peptidi possono essere acquistati anche commercialmente. Questo protocollo richiede una cisteina C-terminale nella sequenza del peptide per abilitare incorporazione covalente nel reticolo polimerico idrogel. - Preparare ammina di 8 braccio 40 kDa poli (glicol etilenico) (PEG)-norbornene (NB) come descritto17. Verificare la funzionalizzazione di gruppo fine superiore al 90% utilizzando 1H NMR. PEG-NB si dissolvono in sterile tampone fosfato (PBS) al 25% p/v e conservare in congelatore a-80 ° C in aliquote (~ 300 µ l).
Nota: PEG funzionalizzati con norbornene può anche essere acquistato in commercio. - Sintetizzare il foto-iniziatore litio fenile 2, 4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) come descritto altrove18. Sciogliere il giro in acqua sterile ad una concentrazione di 68 mM e conservare in congelatore-80 ° C in aliquote (~ 300 µ l).
Nota: in alternativa, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) può essere utilizzato come foto-iniziatore. LAP e Irgacure possono essere acquistati in commercio. - Sciogliere la MMP-degradabile crosslinker del peptide (KCGPQG↓IWGQCK) ed il peptide di adesione delle cellule (CRGDS) in acqua sterile ad una concentrazione di 200 mM e 100 mM rispettivamente e memorizzarli in un congelatore-80 ° C (~ 300 µ l e ~ 30 µ l) le aliquote, rispettivamente.
2. analisi media preparazione
- Preparare l'inattivati al calore, carbone spogliato siero bovino fetale (FBS) per il dosaggio MMP:
Nota: Proteasi in FBS possono produrre un segnale di alta priorità bassa nel dosaggio di MMP; Pertanto, si raccomanda di inattivare a caldo e di carbone di legna i FB per il supporto di analisi della striscia.- Inattivare 100ml di FBS di riscaldamento per 30 min a 55 ° C.
Nota: 100 mL di FBS è stato utilizzato qui per aliquotare e conservazione a-20 ° C per un uso futuro. Volumi più piccoli possono essere utilizzati come necessario. - Aggiungere 0,25% p/v di carbone attivo e 0.025% w/v di destrano una piccola quantità di FBS (circa 5 mL) e mescolare fino a formare un impasto. Quindi, aggiungere il resto degli FB e sotto agitazione per 30 minuti a 55 ° C.
- Centrifuga a 1.962 x g per 20 min a 4 ° C. Quindi trasferire il surnatante su un'altra nave.
- Ripetere il punto 2.1.2 ma a 37 ° C, seguita da punto 2.1.3. Sterilizzare il supernatante utilizzando un filtro di 0,45 µm e quindi filtro 0,2 µm.
- Inattivare 100ml di FBS di riscaldamento per 30 min a 55 ° C.
- Preparare il supporto di analisi utilizzando supporti completati con 1% carbone spogliato FBS, 2 mM L-Glutammina, 10 U/mL di penicillina, 10 µ g/mL di streptomicina.
Nota: Media senza rosso fenolo è raccomandato perché ha meno interferenze di fluorescenza. Altre aggiunte per il supporto di analisi come l'insulina, fattori di crescita, ecc. possono essere aggiunti fino a quando l'assorbanza e picchi di spettro di fluorescenza non si sovrappongono con il sensore (494 nm/521 nm). - Enzima collagenasi batterica diluita tipo alle 10 e 1.000 µ g/mL nei media test come controllo positivo.
3. idrogel incapsulamento delle cellule e preparazione
- Preparare la soluzione di precursore di idrogel.
- Aggiungere i reagenti a una provetta da 1,5 mL nel seguente ordine, Vortex dopo l'aggiunta di ogni componente: 20 mM 8 braccio 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM crosslinker MMP-degradabile peptide, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2mm LAP e peptide fluorogenico MMP-degradabile 0,25 mM.
Nota: La tabella 1 Mostra il contenuto della soluzione di idrogel precursore, concentrazioni di stock, concentrazioni di lavoro, le formule di calcolo di volume e nei volumi richiesti necessari per rendere 120 µ l di soluzione di precursore di idrogel, che è sufficiente per condurre una esperimento con 10 idrogeli. Per tenere conto per la perdita della soluzione idrogel a causa di pipettaggio, aumentare il volume totale del 20%. I peptidi commerciali sono spesso forniti in una soluzione di acido cloridrico; di conseguenza, NaOH viene aggiunto per ottenere un pH finale di 7. pH della soluzione finale dovrebbe essere confermata dall'utente. - Dividere la soluzione del precursore di idrogel in più provette da 1,5 mL, un tubo a condizione di essere testato.
Nota: Diverse condizioni di controllo in cui idrogeli sono preparati senza l'aggiunta di cellule sono suggerite. Per un controllo negativo, per tenere conto di degradazione aspecifica del sensore fluorogenici, una condizione di idrogel può incubata con il controllo del veicolo o il supporto sperimentale da solo se non esistono condizioni trattamento. Per un controllo positivo e per la calibrazione tra esperimenti, idrogeli possono essere incubati con una proteasi conosciuta per fendere il sensore fluorogenic. Ad esempio, due concentrazioni di collagenasi batterica sono state usate qui.
- Aggiungere i reagenti a una provetta da 1,5 mL nel seguente ordine, Vortex dopo l'aggiunta di ogni componente: 20 mM 8 braccio 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM crosslinker MMP-degradabile peptide, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2mm LAP e peptide fluorogenico MMP-degradabile 0,25 mM.
- Incapsulare le cellule in idrogel.
- Preparare una sospensione di singola cella appropriata per il tipo di cella utilizzato. Per esempio, lavare un piatto di 10 cm delle cellule del melanoma A375 con 10 mL di PBS. Tripsinizzano cellule usando 0.05% tripsina e incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 3 min numero di celle con un emocitometro per determinare il numero totale delle cellule.
- Centrifugare la soluzione di cella a 314 x g per 3 min, aspirare terreni di coltura, quindi risospendere le cellule in PBS circa tre volte alla massima densità semina necessari per l'esperimento. Ad esempio, una sospensione di cellule con una densità di 21 x 106 cellule è stata usata qui per ottenere una densità incapsulata finale di 7 x 106 cellule/mL.
- Contare le celle nuovamente per garantire una concentrazione di cellule accurata.
- Aggiungere celle sospese e PBS in ogni provetta della soluzione di precursore di idrogel secondo la densità di semina richiesta (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 x 106 cellule/mL in questo esempio). Aggiungere PBS a condizioni con nessun cellule sostituiscono le cellule sospese.
Nota: Tutte le condizioni devono avere lo stesso volume di soluzione precursore di idrogel finale per garantire il rapporto tra le componenti di idrogel e PBS è costante. Fare non tubi di vortice che hanno cellule in loro, pipettare vigorosamente su e giù senza creare bolle per miscelare la soluzione di precursore. - Pipettare 10 µ l della soluzione di precursore di idrogel in un sterile nero rotondo fondo piastra a 96 pozzetti, assicurando che la punta è centrata nel mezzo di ogni pozzo durante l'erogazione.
- Polimerizzare soluzione precursore di idrogel di impressionare la lastra alla luce ultravioletta (UV) a 4 mW/cm2 per 3 min.
Nota: La lampada UV (UVL-56 palmare lampada UV, UVP, Upland, CA) produce luce di UV-A ad una lunghezza d'onda UV (365 nm), che non influisce la vitalità cellulare. - Aggiungere 150 µ l di media di analisi a tutti i pozzetti tranne che per le condizioni di controllo positivo senza cellule incapsulate. Per i controlli positivi, aggiungere 150 µ l di soluzione degli enzimi collagenasi.
- Aggiungere 150 µ l di PBS esterno nei pozzetti della piastra per ridurre l'evaporazione durante l'incubazione.
4. MMP e misurazione dell'attività metabolica
- Misurare la fluorescenza immediatamente post-incapsulamento per stabilire una misurazione della fluorescenza di base e garantire l'uniformità nella polimerizzazione di idrogel. Leggere la piastra utilizzando un microplate di fluorescenza lettore che utilizzano un protocollo di opaco piastra a 96 pozzetti con un'area di analisi impostazione a 494 nm/521 nm (eccitazione/emissione). Questo sarà l'h 0 leggere.
- Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per 18 h.
- Aggiungere il reagente di attività metabolica (resazurin) alle 01:10 (v/v) per ogni pozzetto.
- Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per ulteriori 6 ore.
Nota: Questo tempo di incubazione può variare a seconda del tipo di cella. - Misurare la fluorescenza post-all'incapsulamento 24 h. Leggere la piastra utilizzando un microplate di fluorescenza lettore che utilizzano un protocollo di opaco piastra a 96 pozzetti con un'area di analisi impostazione a 494 nm/521 nm (eccitazione/emissione) per attività MMP e 560 nm/590 nm (eccitazione/emissione) per attività metabolica.
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Representative Results
Il dosaggio attuale è stato adattato da un sistema di coltura di idrogel 3D precedentemente sviluppati e caratterizzati funzionalizzato con un fluorogenic MMP spaccabili sensore8. Il sensore MMP fluorogenic qui utilizzato è costituito da una sequenza peptidica, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (Roberta) C (↓ indica il sito di clivaggio) che in precedenza è stato ottimizzato per la scissione di MMP-14 e MMP-1119. Il peptide è etichettato con una molecola fluorescente (fluorescina) e una molecola di quencher (dabcyl) su entrambi i lati del sito di clivaggio (Figura 1). All'esposizione del sensore fluorogenic alla proteasi appropriata, il fluoroforo e un quencher sono separati, e aumenta la fluorescenza. Qui, il dosaggio è stato miniaturizzato da una piastra a 24 pozzetti in un formato di piastra a 96 pozzetti, eliminando diversi passaggi del processo di incapsulamento e riducendo il tempo necessario per eseguire un esperimento del 50%. Ulteriormente, ha ridotto il volume dei reagenti consumati da 80%, come volumi di idrogel sono stati ridotti da 50 µ l a 10 µ l per pozzetto. Inoltre, utilizzando una piastra a 96 pozzetti, 20 condizioni in triplici copie potrebbero essere testate invece le 12 condizioni in duplicati per piastra a 24 pozzetti. Uno schema del processo di incapsulamento delle cellule è illustrato nella Figura 2. Etichetta 1 e 2 corrispondono ai punti 3.1 e 3.2 nel protocollo, rispettivamente. Etichette 3 a 5 corrispondono ai passaggi 3.2.5 a 3.2.7 nel protocollo. Etichette 6 a 9 corrispondono ai passaggi da 4.2 a 4.5 nel protocollo.
Per stabilire i limiti di rilevazione e gamma del dosaggio del segnale, nel caso degli idrogeli funzionalizzati con il peptide di MMP-degradabile fluorogenic sono state incubate con un intervallo di concentrazioni (0 a 2.000 µ g/mL) del tipo di enzima collagenasi batterica io. Dopo 24 h di incubazione a 37 ° C, un lettore di piastra fu utilizzato per misurare la fluorescenza (Figura 3). Da queste misure, la dinamica (più basso e più alto rilevato segnali) e campo di lavoro (3 deviazioni standard di sopra del segnale più basso rilevato) e 3 deviazioni standard di sotto del segnale rilevato più alto sono stati determinati. Dopo 24 h di incubazione, è stato osservato che il segnale più basso rilevato è stato prodotto da controlli negativi (rumore di fondo) a 0 della collagenosi µ g/mL, mentre il più alto rilevato segnale è stato prodotto da collagenosi di 1.000 µ g/mL o superiore, dove il segnale comincia a Altopiano (Figura 3). Dalla gamma dinamica, il campo di lavoro è stato calcolato essere tra ≈0.16 µ g/mL e ≈474 µ g/mL di collagenasi, una gamma ampia di segnale attraverso tre ordini di grandezza.
Per analisi di coltura delle cellule, la densità di cella appropriata che si traduce in letture di fluorescenza il raggio di azione del dosaggio deve essere determinata per ciascun tipo di cella. Qui, i dati rappresentativi sono presentati per la linea cellulare di melanoma A375, incapsulato in una gamma di densità da 0,25 a 7 x 106 cellule/mL. L'intensità di fluorescenza è stata acquisita utilizzando un lettore di micropiastre standard in due diversi momenti: 1) direttamente dopo l'incapsulamento (0h) e 2) dopo 24 h di incapsulamento. A 0 h, fluorescenza letture erano basse attraverso la densità di semina (Figura 4A), come previsto. Dopo 24 h di cultura (Figura 4B), attività MMP è stata direttamente proporzionale alla densità di semina, in cui più cellule provocato più scissione del fluorogenic MMP spaccabili sensore e maggiore intensità di fluorescenza. Come controlli interni, idrogeli non contenenti le celle sono stati incubati con 0, 10 e 1.000 µ g/mL di collagenasi tipo I enzima per indicare i livelli di Bassi, medi ed alti del segnale rispettivamente (come determinato dalla caratterizzazione della collagenosi segnale gamma in Figura 3) e rappresentate da linee tratteggiate nella Figura 4B. Ulteriormente, i limiti del campo di lavoro sono stati calcolati dai segnali 0 e 1.000 µ g/mL e rappresentati in Figura 4Bcon linee tratteggiate. Densità di semina a o maggiore di 1 x 106 cellule/mL rientrano entro i limiti del campo di lavoro. Misure dell'attività metabolica della linea cellulare A375 erano anche direttamente proporzionale alla cella semina densità (Figura 4C). In precedenza, attività MMP è stata normalizzata per attività metabolica come controllo interno a determinare l'attività MMP su una base per cella8. Normalizzante attività MMP attività metabolica attraverso densità di semina ha provocato nessuna differenza significativa nell'attività MMP a semina densità maggiore di 2 x 106 cellule/mL (Figura 4D). Per determinare la variabilità tra triplici copie in ogni piatto (variabilità intra-piastra), il coefficiente di variazione percentuale (% CV) è stato calcolato per MMP e attività metabolica ed è riassunto in tabella 2. % CV sotto il 20% indica che la variabilità intra-piastra all'interno triplici copie è accettabile per il sistema per produrre risultati coerenti20,21.
Figura 1 : Fluorogenic MMP-degradabile design peptide. Il peptide fluorogenico MMP-degradabile è costituito da una spina dorsale del peptide GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (Roberta) C (↓ indica il sito di clivaggio) che determina la specificità del sensore. Il peptide è etichettato con un quencher (dabcyl) e un fluoroforo (fluoresceina), che è inappagato (reagisce in) quando il peptide di spina dorsale viene scisso dalla MMP. Un gruppo tioalcool è coniugato con il peptide di spina dorsale per attivare la reazione covalente con gruppi funzionali norbornene nella molecola PEG, accoppiamento del sensore per l'idrogel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi schematica. I componenti della soluzione precursore idrogel sono mescolati con le cellule sospese in PBS. La soluzione del precursore è poi pipettati in nero, rotondo fondo, piastre da 96 pozzetti e polimerizzati tramite l'esposizione ai raggi UV per 3 min. dosaggio viene aggiunto supporti e piastre vengono incubate per 18 h (37 ° C, 5% CO2). Viene quindi aggiunto il resazurin del reagente di attività metabolica e piastre vengono incubate per un ulteriore h. 6 MMP e attività metabolica sono misurati utilizzando un lettore di micropiastre fluorescente con un protocollo di scansione ben alle lunghezze d'onda di eccitazione/emissione indicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Dinamica e range di lavoro del test. Idrogeli funzionalizzati con fluorogenic MMP-degradabile peptide sono stati incubati con una gamma di concentrazioni del tipo di enzima collagenasi che i per 24 h a 37 ° C e fluorescenza intensità è stato misurato. Linee tratteggiate rappresentano la gamma dinamica e di lavoro. n = 3, media ± deviazione standard (SD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Effetto di semina densità della linea cellulare di melanoma A375 sull'attività MMP. (A) iniziale di misurazione (0 h) di attività MMP per linea cellulare A375 incapsulato in un intervallo di densità di semina. n = 3 media ± SD. (B) la misura di attività MMP 24 h. 0, 10 e 1000 µ g/ml della collagenosi sono rappresentate da linee tratteggiate. Linee tratteggiate rappresentano il campo di lavoro (WR) calcolato da controlli della collagenosi. n = 3, media ± SD. (C) Measurement di attività metabolica per linea cellulare A375 incapsulato per 24 h in un intervallo di densità di semina e incubati con resazurin per 6 h. n = 3, media ± SD. (D) attività di MMP A375 normalizzata alla attività metabolica. n = 3, media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Preparazione soluzione di idrogel precursore.
Tabella 2: Intra-piastra % CV del test con linea cellulare A375.
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Discussion
Coltura cellulare in vitro 3D ricapitola molti aspetti importanti dell'ambiente in vivo. Tuttavia, cultura 3D rende inoltre valutare la funzione delle cellule e segnalazione impegnativo, come molti saggi biologici richiedono recupero cellulare e un gran numero di cellule. Di conseguenza, lo sviluppo di un sistema di semplice cultura 3D che consente la misurazione della funzione cellulare senza ulteriore campione elaborazione aumenterebbe notevolmente l'utilità dei sistemi di coltura 3D. Il sistema 3D qui descritto può essere adattato per una varietà di diverse applicazioni. La sequenza del sensore fluorogenic può essere modificata per rilevare altre proteasi. Per esempio, la fluorogenic spaccabili sensore sequenza (GPQG↓IWGQK) che può essere clivata da MMP-1, -2, -3, -7, -8 e -9, è stata precedentemente utilizzata per rilevare l'attività MMP di melanoma in risposta ai chemioterapici22. L'uso dell'apparato di idrogel PEG consente inoltre una regolazione precisa e indipendente del microambiente cellulare, incluse le proprietà meccaniche e la degradabilità le moiety adesione matrice all'interno l'idrogel. La molecola di adesione RGD utilizzato in questo lavoro è una sequenza di fibronectin-derivato e consente l'adesione integrina-mediata. Altre molecole di adesione quali (RLD) e (IKVAV) che sono derivati da fibrinogeno e laminina, rispettivamente, poteva essere utilizzato per attivare altri tipi di recettori integrinici. Ad esempio, è stato dimostrato che alterando le molecole di adesione ha cambiato l'allungamento delle cellule interstiziali valvular aortiche (VIC), che possono avere un effetto sulla valvola aortica stenosi15. La sequenza di reticolante idrogel può controllare la degradabilità dell'idrogel e del comportamento cellulare incapsulato all'interno l'idrogel. Ad esempio, è stato dimostrato che i fibroblasti erano aumentato proliferazione e cella diffusione quando coltivate in più velocemente degradante idrogeli, che possono accelerare il processo curativo in vivo23. Proprietà meccaniche del microambiente può anche regolare la funzione delle cellule, e idrogel rigidità può essere modificato modificando il numero di armi nella possono PEG, PEG peso molecolare e il rapporto tra PEG e reticolante.
Perché l'attività MMP varia a seconda del tipo di cella, per ogni nuovo tipo di cella è importante condurre un test di ottimizzazione di densità di incapsulamento come dimostrato qui. Dopo 24 h di incapsulamento, MMP e attività metabolica sono state direttamente proporzionale alla densità di semina di cella. Tuttavia, a volte più a lungo che il segnale fluorescente può altopiano, pertanto i tempi del test potrebbero essere necessario essere ottimizzato per l' utente8. Il sensore di proteasi specifiche può colpire anche la gamma di lavoro e la tempistica del dosaggio. Campo di lavoro del dosaggio può essere determinato da un esperimento segnale gamma con nessuna cellula e un enzima proteolitico sopra una vasta concentrazione. L'inclusione delle diverse senza condizioni di idrogel delle cellule incubate con stabilimento consente di enzima controlli del basso (rumore di fondo), medi e alti livelli di segnale all'interno di ogni dosaggio (0, 10 e 1.000 µ g/mL della collagenosi qui). Questo dà un'indicazione di dove i segnali prodotti dalle cellule rientrano nel campo di lavoro del test. Questo test è anche compatibile con altri sensori fluorescenti che non hanno sovrapposte eccitazione e spettri di emissione, ad esempio, il saggio di attività metabolica qui utilizzato come controllo interno per calcolare l'attività MMP su base per cella, come precedentemente segnalato8 . Attività MMP normalizzata a metabolico attività dimostrata la validità di questo approccio per il seeding densità pari o superiore a 2 x 106 cellule/mL, in cui non c' non era nessun cambiamento significativo attraverso la densità di semina. Questa normalizzazione è fondamentale per identificare le densità di semina appropriate che sono all'interno del range della curva di attività MMP e all'interno della parte lineare della curva di normalizzazione.
Mentre il dosaggio può essere adattato per diversi scopi, ci sono diverse limitazioni e aspetti critici che l'utente dovrebbe prendere in considerazione, in particolare per quanto riguarda le interferenze con il segnale fluorescente e preparazione di nel caso degli idrogeli. In primo luogo, deve prestare attenzione con la scelta di terreni di coltura e di ulteriori trattamenti, come questi possono avere un spettro di assorbanza sovrapposti o opacità che possono interferire con il rilevamento della fluorescenza o placare il segnale. Si consiglia di utilizzare terreni di coltura che contiene fenolo rosso. Inoltre, alcuni trattamenti farmacologici sono fluorescenti (ad es., doxorubicina), o hanno spettro di assorbanza che si sovrappone con lo spettro di eccitazione/emissione del fluoroforo (ad es., curcuminoidi). Un secondo aspetto che può influire sulle prestazioni del test è la preparazione di idrogel. A causa della alta viscosità della soluzione precursore idrogel, cura deve essere presa per assicurare l'accurata miscelazione della soluzione di idrogel e attenta pipettaggio prassi volte a prevenire disuguale fluoroforo volume di soluzione di contenuto o idrogel in ciascun pozzetto. Prebagnatura delle punte di pipetta e utilizzando bassa ritenzione suggerimenti possono aiutare a ridurre la variabilità. Un altro aspetto importante di idrogel preparazione è la forma di idrogel e posizione a wells. L'idrogel deve essere centrato all'interno del pozzo e di una forma uniforme per consentire misure di fluorescenza accurata con meno variabilità15. Qui, l'uso di piastre di fondo tondo aiuta a centrare la punta della pipetta in ciascun pozzetto e la produzione di semi-sferici idrogeli costantemente in tutti i pozzetti.
Adattando il sistema 3D della proteasi-degradabile idrogel, proteasi in tempo reale e letture di attività metabolica possono essere rilevate in un microambiente 3D con un campione minimo di elaborazione. Inoltre, l'uso dell'idrogel di PEG sintetica riduce la variabilità di lotto osservata con derivazione naturale ECM idrogeli. Inoltre, utilizzando PEG idrogeli permette di messa a punto dei segnali chimici e meccanici di idrogeli di un migliore controllo del microambiente. Inoltre, la polimerizzazione di idrogel di PEG descritta qui è un processo foto, in modo rapido e più suscettibili alle metodologie di throughput elevato rispetto classico naturale ECM idrogel (vale a dire., collagene o Matrigel), che sono più lenti e sensibili alla temperatura. Questa polimerizzazione rapida, controllata dall'utente consente la scalabilità del sistema per essere ulteriormente automatizzato utilizzando i gestori liquidi robotici, come dimostrato da altri15.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori si desidera ringraziare Ohio cancro ricerca (OCR), OH, Stati Uniti d'America per il finanziamento di quest'opera così come King Saud University (KSU), Riyadh, KSA per sponsorizzare il primo autore. Peso molecolare del sensore fluorescente del peptide è stato misurato utilizzando matrice assistita, laser desorption-ionizzazione, spettrometria di massa (MALDI-TOF) tempo di volo con assistenza del Campus chimica strumento centro spettrometria di massa e proteomica Impianto presso la Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
- Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M.
- Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
- Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
- Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
- Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
- Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
