Misurazione della proteinasi metallica della matrice cellulare globale e l'attività metabolica in idrogel 3D

La coltura 3D rende più difficile misurare la funzione cellulare, utilizzando saggi biologici standard. Questo protocollo consente di misurare l’attività cellulare e somatica senza ulteriori elaborazioni del campione, utilizzando un sensore fluorescente e un lettore di micropiatte standard. Questo protocollo consente una serie di nuove applicazioni, tra cui lo screening dei farmaci ad alta produttività.

Inoltre, il sensore fluorescente può essere scambiato con un sensore diverso per misurare altre proteasi o funzioni cellulari. È importante pianificare attentamente l’esperimento in anticipo, completare tutti i calcoli per la preparazione dell’idrogel e impostare tutte le attrezzature e i reagenti per ridurre al minimo le celle del tempo in sospensione. Per iniziare, preparare il supporto di dosaggio con siero bovino fetale spogliato all’1%, due mM L-glutammina, 10 unità per mL di penicillina e 10 microgrammi per mL di streptomicina.

Non utilizzare mezzi rosso fenolo, che hanno più interferenze di fluorescenza. Per effettuare controlli positivi, aggiungere l’enzima collagenasi batterico di tipo uno al mezzo di dosaggio alle concentrazioni di 10 e 1000 microgrammi per mL. Quindi, preparare la soluzione precursore dell’idrogel aggiungendo i reagenti a un tubo da 1,5 ml.

Assicurarsi di vortice dopo l’aggiunta di ogni componente. Quindi dividere la soluzione in più tubi da 1,5 ml per condizioni diverse. Per incapsulare le cellule in idrogel, preparare prima una sospensione a singola cella lavando un piatto di 10 cm di cellule di melanoma A375 con 10 mL di PBS.

Quindi, aggiungere lo 0,05% di tripina al piatto, per tripinare le cellule. Incubare il piatto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, per tre minuti. Dopo l’incubazione, contare le cellule con un emocitometro.

Quindi, centrifugare la soluzione cellulare a 314 volte G per tre minuti. Aspirare i supporti di coltura e resospendire le celle nel buffer PBS a circa tre volte la densità finale incapsulata. Contare di nuovo le cellule per garantire una concentrazione accurata delle cellule.

Quindi, aggiungere le cellule sospese in PBS a ciascun tubo della soluzione precursore dell’idrogel in base alla densità di semina richiesta e mescolare pipettando su e giù. Per le condizioni controllate, aggiungere solo PBS e vortice. Successivamente, pipetta 10 microlitri della soluzione precursore dell’idrogel al centro di ogni pozzo di una piastra sterile, nera, a fondo rotondo da 96 pozza.

Ispezionare visivamente il posizionamento degli idrogel all’interno dei pozzi. Gli idrogel non centrata possono essere riposizionati utilizzando una punta di pipetta prima della polimerizzazione. Per polimerizzare la soluzione precursore dell’idrogel, esporre la piastra alla luce UV a 4 milliwatt per centimetro quadrato, per tre minuti.

Successivamente, aggiungere 150 microlitri del supporto di dosaggio a tutti i pozzi contenenti cellule incapsulate e 150 microlitri della soluzione enzimatica di collagenasi ai pozzi dei controlli positivi. Aggiungere 150 microlitri di tampone PBS ai pozzi esterni della piastra per ridurre l’evaporazione durante l’incubazione. Utilizzare un lettore di micropiastrine per misurare l’intensità fluorescente della piastra a zero ore, immediatamente dopo l’incapsulamento.

Selezionare il protocollo opaco a piastra di pozzo 96 con eccitazione di 494 nanometri e lunghezze d’onda di emissione di 521 nanometri. Successivamente, incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%, per 18 ore. Quindi aggiungere reagenti di attività metabolica a un rapporto volume/volume da uno a 10 per pozzo per tutte le condizioni e i controlli.

Incubare la piastra in 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, per sei ore. Infine, misurare l’intensità fluorescente della piastra a 24 ore, post incapsulamento. Selezionare il protocollo opaco a piastra di pozzo 96, con eccitazione di 494 nanometri e lunghezze d’onda di emissione di 521 nanometri, per l’attività MMP.

Per misurare l’attività metabolica, selezionare l’eccitazione di 560 nanometri e le lunghezze d’onda di emissione di 590 nanometri. In questo studio, dopo l’esposizione del sensore fluorogenico alla proteasi appropriata, il quencher e il fluoroforo vengono separati e la fluorescenza aumenta. Le misurazioni della fluorescenza degli idrogel incubati con enzima batterico collagenasi di tipo uno, mostrano che il segnale rilevato più basso è stato prodotto da controlli negativi, senza collagenasi.

Mentre il segnale rilevato più alto è stato prodotto da 1000 microgrammi per mL di collagenasi o superiore, quando il segnale inizia ad stabilizzarsi. L’intervallo di lavoro calcolato è stato da circa 0,16 a 474 microgrammi per mL di collagenasi. Le letture di fluorescenza per la linea cellulare del melanoma A375, incapsulate in una gamma di densità subito dopo l’incapsulamento, erano basse tra le densità di semina e simili ai gel di controllo senza cellule come previsto.

24 ore dopo l’incapsulamento, l’attività MMP era direttamente proporzionale alla densità di semina e le densità di semina a o superiore a 1 milione di cellule per mL rientrano nei limiti dell’intervallo di lavoro. Anche le misurazioni dell’attività metabolica della linea cellulare A375 erano direttamente proporzionali alla densità di semina cellulare. Normalizzando l’attività MMP all’attività metabolica, non vi è stata alcuna differenza significativa nell’attività MMP per cellula nelle densità di semina superiori a 2 milioni di cellule per mL.

Le corrette tecniche di pipettazione sono importanti. Ciò include punte di pre-bagnatura per ottenere volumi accurati di soluzioni viscose. Inoltre, centrare la soluzione precursore dell’idrogel all’interno del pozzo, è fondamentale per ottenere misurazioni accurate da parte del lettore di piastre.

Per identificare mmp specifici che contribuiscono all’attività MMP misurata qui, è possibile utilizzare test di espressione come western blot o PCR. L’uso di cellule vive richiede una corretta procedura di biosicurezza, una tecnica asettica e un armadietto di sicurezza biologico. La luce UV è pericolosa, usa uno scudo per proteggere l’utente e non guardare direttamente nella luce.