Summary
Hier presenteren we een protocol voor de bouw van een cel cultuur kamer ontworpen om bloot cellen tot verschillende soorten elektrische stimulatie, en het gebruik ervan bij de behandeling van mesenchymale stamcellen om osteogenic differentiatie.
Abstract
Mesenchymale stamcellen/stromale cellen (MSCs) zijn uitvoerig gebruikt om bot genezing in weefsel engineering benaderingen te bevorderen. Elektrische stimulatie (EStim) heeft aangetoond dat MSC osteogenic differentiatie in vitro verbeteren en bot genezing in klinische instellingen te bevorderen. Hier beschrijven we de bouw van een EStim kamer voor de cultuur van de cel en het gebruik ervan bij de behandeling van bot-merg-afgeleide MSC ter verbetering van osteogenic differentiatie rat. We vonden dat behandeling van MSCs met EStim voor 7 dagen in een aanzienlijke toename van de osteogenic differentiatie resulteert, en bovenal dit pro-osteogenic effect blijft voortbestaan lang na (7 dagen) EStim wordt stopgezet. Deze aanpak van voorbehandeling MSCs met EStim ter verbetering van osteogenic differentiatie kan worden gebruikt om botweefsel engineering behandeling resultaten te optimaliseren en, dus, helpen hen om hun volledige therapeutische potentieel te bereiken. Naast deze applicatie, kunnen deze EStim cel cultuur kamer en protocol ook worden gebruikt te onderzoeken van andere EStim-gevoelige cel gedrag, zoals migratie, proliferatie, apoptosis en steiger bijlage.
Introduction
Een toename van de trauma's en/of ziekte-geïnduceerde bot gebreken worden behandeld met behulp van verschillende combinaties van celtherapie en regeneratieve geneeskunde technologieën. MSCs zijn de cel van keuze in dergelijke behandelingen, vanwege hun relatief hoge osteogenic activiteit, isolatie en uitbreiding efficiëntie en veiligheid1. Wilt maximaliseren van hun osteogenic activiteit en, dus, het optimaliseren van hun therapeutische doeltreffendheid, zijn verschillende methoden om te manipuleren MSCs voorafgaand aan het gebruik ervan in deze behandelingen (zoals herzien door Mauney et al.2) bijgekomen. Een dergelijke methode is EStim, waarvan is aangetoond te verbeteren van MSC osteogenic differentiatie in vitro3 en bot in vivo4genezing te bevorderen. Ondanks het groeiend aantal studies gericht op de behandeling van MSCs met EStim, moet een optimale regime voor het maximaliseren van de EStim pro-osteogenic effect nog worden gedefinieerd.
Andere methoden in vitro met behulp van EStim gebruiken zout bruggen ondergedompeld in het kweekmedium, die cellen van metalen elektroden5scheidt. Het voordeel hiervan is dat de invoering van chemische bijproducten (bijvoorbeeld, corrosie van metalen elektroden) die mogelijk cytotoxisch EStim leveren door middel van zout bruggen elimineert. Ondanks dit voordeel, zout bruggen zijn omslachtig om mee te werken en de EStim zij leveren verschilt van die in geleverde in vivo modellen, waardoor het moeilijk te correleren van resultaten bij het gebruik van de twee systemen. Opstellingen die EStim via metalen of koolstof elektrodes vast binnen de cel cultuur putten leveren simuleren (zoals herzien door Hronik-Tupaj en Kaplan6) beter apparaten die worden gebruikt in vivo; echter, deze apparaten zijn moeilijk te reinigen/steriliseren tussen toepassingen en het aantal cellen die kunnen worden bestudeerd per experiment is beperkt. We ontwierpen de EStim zaal gepresenteerd hier specifiek om aan te pakken van de beperkingen van deze andere opstellingen. Terwijl de meeste van onze ervaring met behulp van deze zaal EStim geweest met 2D en 3D culturen met het beenmerg - en adipeus-weefsel-afgeleide MSCs3,4, een belangrijk voordeel van dit Parlement is dat het is veelzijdig en, met relatief kleine wijzigingen, kunnen worden aangepast aan het bestuderen van andere celtypes onder allerlei verschillende omstandigheden.
Hier beschrijven we de bouw van een EStim vergaderzaal voor de cultuur van de cel; vervolgens tonen wij het gebruik ervan door behandelende MSCs met verschillende regimes van EStim en het meten van het resulterende effect op osteogenic differentiatie. MSC osteogenic differentiatie wordt beoordeeld via afzetting van calcium, alkalisch fosfatase activiteit en osteogenic marker genexpressie. Nog belangrijker is, in verleden experimenten waarmee deze opstelling, we hebben vastgesteld dat deze pro-osteogenic effecten aanhouden lang nadat de EStim behandeling werd gestaakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bouw van elektrische stimulatie cel cultuur kamer
- Verzamelen om te bouwen de kamer EStim, twee deksels van standaard 6-well cel cultuur platen; 99,99% platina-draad, 60 cm lang met een diameter van 0,5 – 1 mm; zilver gecoat koperdraad, 70 cm lang met een diameter van 0.6 mm; snijden-tangen; soldeerbout kit; één buis van supergeleidende lijm; één draad aansluitblok connector, zes kleine 2.2 V LEDs (facultatief); één buis van noncorrosive siliconen lijm coating (facultatief); een rol van zwarte elektrische isolatietape; standaard, flexibele, geïsoleerd koperdraad elektrische (0,14 mm2), 2 m lengte (tabel van materialen).
- In de deksel van een 6-well plaat, mark en boor vervolgens twee gaten (met een diameter van ~ 1 mm) wells 25 mm uit elkaar, in de buurt van de buitenste rand van elk van de zes (12 holes in totaal), zoals aangegeven in figuur 1A, B.
- Gesneden twaalf 5 cm lengtes van platina-draad met snijden-tangen. Buig van elk van de draden handmatig in een L-vorm, waardoor één uiteinde 3 cm lang en de andere 2 cm. Snijd de zilver-gecoate draad in twee lengtes van 35 cm.
- Steek de langere (3 cm) gebogen uiteinde van een platina draadje (van binnen naar buiten) in elke geboorde gat, verlaten van 1 – 2 mm uitsteekt aan de buitenkant van het deksel, buigen met behulp van de verlostang. Beveilig de platina draden in de gaten van de deksel met supergeleidende lijm en laat ze drogen voor ongeveer 6 h.
- Soldeer de tips van alle zes platina draden (dat zal later dienen als kathoden, Zie figuur 1A) uitsteken van de deksels op één van de draden zilver gecoat. Herhaal dezelfde procedure, de resterende zes platina draden (die later zal dienen als anoden) solderen met de andere zilver-gecoate draad.
- Voeg LEDs in het circuit tussen elk van de zes anode-kathode platina-elektrode paren, functionaliteit tijdens de experimenten (optioneel) bevestigen. Plaats een stuk van zwarte isolatietape onder elk geleid om te voorkomen dat bloot van de cellen in de cultuur-platen aan het LED-licht (Figuur 1 c).
- Lijm de draad aansluitblok connector naar de linker bovenhoek van het 6-well plaat deksel en beide beklede zilver draden sluit aan op de ingangen, zoals afgebeeld in Figuur 1 c.
- Knip een gedeelte van de 20 x 20 mm van de linker bovenhoek van een tweede 6-well plaat deksel (figuur 1B, deksel Nr. 2) aan de klemmenstrook-connector op de eerste klep. Betrekking hebben op de eerste klep, uitgerust met de elektroden, met de tweede deksel en tape ze samen met plakband.
- Gebruik om te verbeteren de hechting van de twee deksels, siliconen lijm coating (optioneel). Om dit te doen, betrekking hebben op het deksel met de zilveren elektroden met een laag van 3 – 5 mm van silicone, lijm en bedek het met de andere deksel, waardoor 12 h voor de lijm drogen.
- Sluit het ene uiteinde van de twee standaard geïsoleerde koperen draden aan op de ingangen van de uitvoer van de connector van de draad en de andere uiteinden aan banaan mannelijke connectors (4 mm).
Opmerking: De lengte van deze draden is afhankelijk van de afstand van de plank in de incubator, waar de cellen zal worden gehouden op de stroomvoorziening, buiten de incubator (Figuur 1 d). - Aanpassen van de dosering (spanning) en regime van EStim afgeleverd bij de cellen door het reguleren van de DC voeding.
- Schakel de voeding door de ON/OFF -knop op het voorpaneel te drukken. Kanaal 1 activeren door op knop 1te drukken.
- Druk op knop Nr. 4 (V-set) om het instellen van de spanning. Druk op knoppen 2, . en 5 om de output van de belasting vastgesteld op 2,5 V. Druk op Enter.
- Zorgen dat de output van de belasting van 2,5 V (2500 mV) komt overeen met een EStim van 100 mV/mm, volgens de volgende, vereenvoudigde vergelijking.
V EStim =
; of
V = VEStim × d
Hier, V = het netspanningsvoltage uitvoer in millivolts; d = de afstand tussen de elektroden in millimeter; V EStim = de spanning van de stimulatie in millivolts per millimeter.
Opmerking: Deze vereenvoudiging geldt alleen in geval van constante gelijkspanning. De weerstand tussen het medium en de cellen is verwaarloosbaar, aangezien elektroden niet in direct contact met de cellen; in plaats daarvan wordt EStim geleverd aan de cellen via het medium.
; of2. mesenchymale stamcellen cultuur in osteogenic medium
- Kopen en bewaren van verkrijgbare rat MSCs (Zie Tabel van materialen) in vloeibare stikstof tot de dag van het experiment. Als alternatief, isolaat MSCs van andere dieren volgens protocollen gepubliceerd elders7,,8 volgens lokale institutionele regels voor het gebruik van proefdieren.
- Op de dag van het experiment, een flesje (1 x 106 cellen) van MSCs verwijderen uit de opslag van vloeibare stikstof, en snel (binnen 1 min) ontdooien de cellen in een waterbad voorverwarmd tot 37 ° C.
- Onder steriele omstandigheden in een laminaire flow-kap, de inhoud van de flacon Pipetteer in een tube van 50 mL falcon en voeg 9 mL van normale medium (NM) voorverwarmde tot 37 ° C, bestaande uit Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM, 1 x) met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine oplossing. Pellet de cellen gedurende 5 minuten door centrifugeren op 300 x g.
- In een laminaire flow-kap, verwijder het supernatant en zorgvuldig resuspendeer de pellet cel in 12 mL NM voorverwarmde tot 37 ° C. De geresuspendeerde cellen overbrengen in een T-75 kolf voor de cultuur van de cel.
- Cultuur de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 tot ze een samenvloeiing van 80-90% (na ongeveer 3-5 dagen bereikt).
- Passage van de cellen.
Opmerking: Alle bewerkingen met uitzondering van centrifugeren en incubatie onder steriele omstandigheden uitvoeren in een laminaire flow-kap.- Ophalen na het bereiken van een samenvloeiing van 80-90%, de cellen met cell detachement oplossing. Het kweekmedium cel gecombineerd, wassen 2 x met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), voeg 5 mL 1 x cell detachement oplossing en de cellen terug te keren naar de incubator voor 5 min.
- Zodra de cellen zijn vrijstaand, voeg een gelijke hoeveelheid kweekmedium aan de inactivering van het detachement oplossing. Verzamelen van de cellen in een tube van 50 mL falcon en draaien ze bij 300 x g gedurende 5 min.
- Negeren van het medium en resuspendeer de cellen in 1 mL verse normale voedingsbodem. Het aantal levensvatbare cellen met trypan blauwe vlek te beoordelen.
- Zaad 1 x 106 cellen in een nieuwe T-75 kolf met 12 mL voorverwarmde NM. Cultuur de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 totdat ze een samenvloeiing van 80-90%.
Opmerking: Cel passaging (stappen 2.4.1–2.4.4) kan worden herhaald een paar keer totdat het benodigde aantal cellen wordt verkregen. Gebruik geen cellen ouder dan passage 8.
- Zaad 9 x 104 cellen in 3 mL NM (10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 1% penicilline/streptomycine, DMEM) in elk putje van de plaat van een 6-well cultuur. Incubeer de cellen gedurende 1 dag bij 37 ° C, 5% CO2, 5% O2.
- De volgende dag, gecombineerd kweekmedium en 3 mL osteogenic differentiatie voedingsbodem (OM; normale medium aangevuld met 10-7 M dexamethason, 10 mM β-glycerophosphate en 0.05 mM ascorbinezuur-2-fosfaat) van toepassing.
- Plaats de 6-well plaat met cellen in de incubator en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 's nachts.
3. behandeling van de MSCs met EStim
- Op de dag dat de cellen worden behandeld met EStim, steriliseren de elektroden in 70% ethanol oplossing gedurende 30 minuten; vervolgens droog ze onder UV-licht in een veiligheidskast voor een extra 30 min.
- In een laminaire flow-kap, afdekplaat de 6-well met de gekweekte MSCs met het deksel voorzien van de elektroden, ervoor te zorgen dat de elektroden zijn volledig ondergedompeld in medium (indien nodig, toevoegen medium). De overdekte 6-well plaat (EStim kamer) met de cellen overbrengen in de incubator en sluit de kabels aan op netspanning.
- Set de voeding naar 2.5 V uitvoer laden en behandelen van de cellen met EStim voor 1 h3,9.
- Na stimulatie, koppel de voeding los en verwijder de EStim zaal uit de incubator. Onder steriele omstandigheden, wisselen de deksel voorzien van elektroden met een standaard 6-well plaat deksel.
- De cellen terug te keren naar de incubator en laat ze 's nachts. Reinig de elektroden, eerst met PBS en vervolgens met 70% ethanol oplossing. Reinig de producten van de geaccumuleerde corrosie van het oppervlak van de elektrode met fijn schuurpapier.
- Herhaal stap 3.1-3.5 voor 6 opeenvolgende dagen. Wijzig op dag 4, alvorens EStim en onder steriele omstandigheden, het kweekmedium door zuigen 1,5 mL van medium en te vervangen met 1,5 mL verse OM. voorverwarmde
- Na het toepassen van EStim gedurende 7 opeenvolgende dagen, gedurende de cellen in de cultuur een extra 7 dagen, uitwisselen van het medium om 3-4 dagen.
4. osteogenic differentiatie metingen
- Cel morfologie wijzigingen onder een microscoop te analyseren.
- Om te beoordelen van het effect van EStim op MSC osteogenic differentiatie, maatregel calcium depositie, alkalische fosfatase activiteit en osteogenic marker genexpressie, als beschreven elders3,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te evalueren van het effect van 100 mV/mm EStim op de osteogenic differentiatie van MSCs, cellen EStim behandeld voor 3, werden 7, en 14 dagen of nontreated (control) geanalyseerd op dag 14 van kweken door beoordeling van de morfologische veranderingen en calcium afzetting (Figuur 2 ). Dit werd gedaan door imaging cellen met helder-veld microscopie (morfologie wijzigingen) of door de vaststelling van de cellen in 4% paraformaldehyde oplossing, hen met oplossing van 0,02% Alizarine rode kleuring en vervolgens imaging hen met behulp van lichte-veld microscopie (calcium depositie analyse).
Een gedetailleerde analyse van de osteogenic marker-gen expressie veranderingen werd uitgevoerd in dagen 3, 7 en 14 van kweken (Figuur 3). Dit werd gedaan door het meten van de relatieve expressie van genen RunX2, collageen I, Osteopontinen Osterix door middel van RT-qPCR en de vergelijkende delta Ct (cyclus drempelwaarden) methode10, waar huishouding genen Rplp1 en Ywhaz11 werden gebruikt voor normalisatie.
MSCs bloot aan 100 mV/mm EStim voor 3 dagen (1 uur per dag) hadden geen effect; echter, 7 dagen na blootstelling resulteerde in een toename van de osteogenic differentiatie, zoals bepaald door de morfologie wijzigingen (figuur 2A– C), calcium afzetting (figuur 2E-G) en osteogenic marker-gen expressie veranderingen ( Figuur 3) in vergelijking met een tijd-matched besturingselement zonder EStim. Langdurige EStim blootstelling (14 dagen) heeft verder geen goed doen de osteogenic differentiatie verder gezien na 7 dagen na behandeling (figuur 2DH en Figuur 3).
Zoals afgebeeld in Figuur 2, cellen EStim behandeld voor 7 en 14 dagen verscheen meer gecondenseerde (figuur 2CD) dan die gedurende 3 dagen of nontreated cellen (figuur 2AB) behandeld met EStim en toonde een verhoogde calcium afzetting (Figuur 2 gH) vergeleken met die behandeld voor slechts 3 dagen of nontreated besturingselementen ()figuur 2EF). Analyse van de osteogenic marker uitdrukking bij 3, 7 en 14 dagen voor het kweken van bevestigde de verbeterde osteogenic differentiatie in cellen die zijn behandeld met EStim voor 7 en 14 dagen (Figuur 3). De expressie van osteogenic-differentiatie-gerelateerde marker genen12RunX2, collageen I, Osteopontinen Osterix waren de hoogste in de cellen gedurende 7 dagen behandeld met EStim.
Figuur 1: EStim cel cultuur kamer. (A) elektrische circuit diagram van de EStim kamer tonen de anoden (zwart), kathoden (rood) en LED's aangesloten op de DC voeding. (B) beeld van de gemarkeerde 6-well plaat deksels en L-vormige platina-elektroden (Onderaanzicht) opgenomen in het deksel van de 6-well plaat. (C) gemonteerd EStim chamber (bovenaanzicht) met draad connector, LEDs, en elektrische isolatietape die de cellen van het LED-licht (pijlen beschermt). (D) EStim cel behandeling setup met de EStim kamer in de incubator aangesloten op de DC voeding, aan de buitenkant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Effect van EStim op MSC morfologie en calcium depositie. Cellen in osteogenic kweekmedium, blootgesteld en niet blootgesteld (besturingselementen) tot 100 mV/mm van EStim voor 3, 7 en 14 dagen (1U/dag). (A–D) Morfologie en (E-H) calcium afzetting (Alizarine rode kleuring) op dag 14 van kweken. Belangrijke veranderingen in de morfologie en calcium afzettingen cel werden zichtbaar in cellen gedurende behandeld met EStim (C en G) 7 en (D en H) 14 dagen (10 x vergroting; de schaal bar = 200 µm). Dit cijfer is bewerkt uit Eischen-Loges et al.. 9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Effect van EStim op MSC osteogenic marker genexpressie. De osteogenic marker genexpressie (gemeten met RT-qPCR op dagen 3, 7 en 14 van het kweken) in cellen behandeld met EStim voor 3, 7 en 14 dagen, of nontreated. (A) op dag 7 van kweken, was de RunX2 expressie aanzienlijk hoger in cellen gedurende 7 dagen behandeld met EStim. (B) de ColIa1 expressie was aanzienlijk hoger in cellen die zijn behandeld voor 7 dagen, gemeten op dag 14 van kweken. (C) de uitdrukking van Osteopontin werd het aanzienlijk verhoogd in EStim behandelde cellen dagen 3, 7 en 14 van het kweken. (D) de Osterix expressie was afwezig in de controle cellen helemaal tijd punten en werd gezien alleen op 7 en 14 dagen van de cultuur in cellen die zijn blootgesteld aan EStim. Verschillende letters op de balken geven significant (p < 0,05) verschillen tussen de groepen tegelijkertijd tijd punt. Het sterretje geeft aan significante (p < 0,05) verschillen tussen de tijdstippen binnen dezelfde groep. Dit cijfer werd vanaf Eischen-Loges et al.9gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we de bouw van een kamer en een methode voor de behandeling van mesenchymale stamcellen met EStim die tot verbeterde osteogenic differentiatie leidt.
De setup van de EStim gepresenteerd vereist geen speciale apparatuur/kennis en kan worden uitgevoerd in een laboratorium van de biologie/biochemie de cel van de stam van de standaard door junioronderzoekers. Echter wanneer gebouw en met behulp van de zaal EStim, moet speciale zorg men in een paar kritische stappen. Bij de behandeling van de platina-elektroden, moet extra zorg worden genomen als dit metaal zeer kneedbaar en delicate is. Terwijl andere metalen, zoals staal of wolfraam, kunnen worden gebruikt, worden deze niet zoals ze zijn gevoelig voor corrosie, die cytotoxisch13kan worden aanbevolen. Reiniging/steriliseren van het deksel met de elektroden moeten ook worden uitgevoerd als precies zoals beschreven in het protocol, aangezien deze methode is getest herhaaldelijk en vastgesteld dat effectief in het elimineren van de problemen met de besmetting. Tot slot, terwijl deze kamer kan worden gebruikt om andere studie EStim-gevoelige cel activiteiten zoals migratie14,15, proliferatie, apoptosis16, celmembraan spanningen17en steigerwerk hechting19, de EStim protocol we beschrijven hier (100 mV/mm, 1 h/dag, 7 dagen), alleen gericht op osteogenic differentiatie in rat MSCs. bijzondere aandacht moet worden besteed als hogere spanningen (≥150 mV/mm) en/of langere duur van EStim (> 4 – 5 h) zijn toegepast sinds cytotoxische producten Als gevolg van elektrolyse kan zich ophopen in het medium. In dit geval moet het medium zorgvuldig worden gecontroleerd en uitgewisseld dienovereenkomstig. Andere parameters en/of andere celtypes en voorwaarden studeren, is het raadzaam dat scheiden dosering (spanning) en regime titratie studies worden verricht als deze wijzigingen kunnen invloed hebben op hoe de cellen reageren op EStim.
Mogelijk defect van de EStim kamer kan te wijten zijn aan pauzes in de elektrische circuits na herhaald gebruik en kan worden gecontroleerd via de toegevoegde LED-lampen. In geval van breuk (aangegeven door nonilluminated LED light[s]), het deksel kan worden verwijderd en gemakkelijk gedemonteerd te identificeren en herstellen van de pauze. Daarnaast, maakt het eenvoudige ontwerp van de kamer EStim het gemakkelijk om het te wijzigen volgens de behoeften van verschillende experimentele opstellingen en methoden voor de analyse. Voorbeelden zijn het gebruik van verschillende maten van cel cultuur platen, door het variëren van de lengte van en de afstand tussen de elektroden of toe te voegen verschillende (3D) kweekomstandigheden met keramische Steiger materiaal4 of geleidende substraten18, gewoon door eenvoudig plaatsen deze materialen bezaaid met cellen tussen de elektroden.
Zoals in alle in vitro experimenten, cel gedragingen en functies zijn waargenomen/veroorzaakte in de zaal EStim niet altijd direct overdraagbaar naar in vivo modellen. Dienovereenkomstig, bij de interpretatie van de cel EStim-geïnduceerde gedrag/functies in de zaal, onderzoekers moeten altijd dit in overweging nemen.
De instelling en de methode die hier gepresenteerd hebben veel voordelen boven andere in vitro methoden gebruikt voor het blootstellen van cellen EStim (met zout bruggen5 ) en systemen met elektroden opgenomen in putten19van de cultuur van de cel. Een belangrijk voordeel van het systeem hier beschreven is dat, omdat de cellen worden gekweekt in standaard 6-Wells-platen, ze kunnen worden gebruikt na EStim behandeling in andere in vivo of in vitro protocollen. Het feit dat elektroden worden opgelost op het deksel van de 6-well-plate maakt het bovendien gemakkelijk te reinigen en steriliseren van het apparaat tussen experimenten en te gebruiken. Tot slot biedt de mogelijkheid om tegelijkertijd stimuleren cellen in zes wells voldoende materiaal voor analyse en reproduceerbaarheid.
Om te krijgen een beter inzicht in de mechanismen op het niveau van de cellulaire membraan waardoor EStim beïnvloedt cel activiteiten in lopende studies met behulp van de zaal beschreven hier, zijn we het verkennen van de relatie tussen extern geleverde EStim en celmembraan potentiële (Vmem)17. Bovendien, zullen op basis van eerdere bevindingen9, in de toekomst studies, we voorbehandeling de cellen met EStim in de kamer, alleen en met verschillende 3D steigers en met geleidende ondergronden, ter stimulering van specifieke cel functies; vervolgens zullen we hen implantaat in diermodellen om te bepalen als zij de waargenomen verbeterde functies in vivo behouden. Deze studies zullen bijdragen aan de groeiende hoeveelheid informatie over de mechanismen door welke EStim functie cel reguleren en daarbij zou kunnen bijdragen tot het optimaliseren van de cel therapie benaderingen in de regeneratieve geneeskunde en weefsel engineering-gebaseerde behandelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een AO Stichting Start-Up Grant (S-14-03 H) en de Friedrichsheim-Stichting (Stiftung Friedrichsheim), gevestigd in Frankfurt am Main, Duitsland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
