Summary
ここで各種電気刺激や間葉系幹細胞の骨分化誘導を強化への治療に使用するセルを公開するために設計された細胞培養室の建設のためのプロトコルを提案する.
Abstract
間葉系幹/間質細胞 (MSCs) は、骨の組織工学的アプローチで治癒を促進するために広く使用されています。電気刺激 (EStim) は、MSC 骨分化誘導体外を高め、臨床現場で治癒を促進するために実証されています。ここで EStim 細胞培養室の構造を説明し、治療での使用ラット骨骨髄由来 MSC 骨分化誘導を強化します。分かった骨分化誘導の大幅な増加の結果 7 日間 EStim で MSCs を扱う重要なは、このプロ骨形成促進の効果続く (7 日) EStim は中止後に長い。骨の治療成果を工学を最適化し、したがって、彼らの完全治療の可能性を達成するためにそれらを助ける骨分化誘導を強化する EStim で MSCs を前処理のこのアプローチをされる可能性があります。このアプリケーションでは、に加えてこの EStim 細胞培養室とプロトコルも使用できます移行、増殖、アポトーシス、足場添付ファイルなど他 EStim 敏感な細胞の挙動を調査するため。
Introduction
外傷や疾患による骨欠損の増加は、細胞治療や再生医療技術のさまざまな組み合わせを使用して扱われています。MSCs は、その比較的高い貪食、分離と拡張の効率と安全性1のため、そのような処置の選択のセルです。骨形成促進活動を最大化し、彼らの治療の有効性を最適化するため、(Mauney ら2がレビュー済み) として、これらの治療法での使用前に MSCs を操作するいくつかの方法を紹介されています。このような方法の 1 つは EStim MSC による骨分化培養3を強化し、生体内で4を治癒を促進するために示されています。EStim の MSCs の治療に着目した研究の数の増加、にもかかわらず EStim のプロ骨形成促進効果を最大化するための最適な療法を定義するが。
他体外法 EStim 利用塩橋金属電極5から細胞を分離培養液に浸漬します。この方法の利点は、塩橋を通じて EStim を提供する可能性があります細胞傷害性化学の副産物 (例えば、金属電極の腐食) の導入でなくなることです。この利点にもかかわらず塩橋は操作が、面倒と提供する EStim 異なる配信で生体内でモデル化、2 つのシステムを使用して得られた結果を関連付けることが困難します。細胞文化井戸内固定金属または炭素電極を介して EStim を提供のセットアップ (Hronik Tupaj とカプランの6によって再検討されました) よりシミュレート vivo; で使用されるデバイスただし、これらのデバイスが使用するクリーン/殺菌しにくい、実験ごとに学ぶことができるセルの数は限られています。これらの他の設定の制限を解決するためにここに提示 EStim チャンバーを考案しました。この EStim チャンバーを用いた経験のほとんど 2 D とされているが、骨髄や脂肪-組織由来 MSCs3,4を含む 3 D 文化、この商工会議所の主な利点は、それは汎用性で比較的マイナーな変更は、様々 な条件の下で他の細胞型を勉強する合わせることができます。
ここで EStim 細胞培養室の構造を説明します。その後、EStim と測定結果に及ぼす骨分化誘導の異なるレジメンで治療 MSCs によってその使用を示します。MSC による骨分化は、カルシウム沈着、アルカリホスファターゼ活性および骨マーカー遺伝子発現を介して評価されます。重要なは、過去のこのセットアップを使用する実験が見られました EStim 治療を中止した後にこれらのプロ骨形成促進効果が存続すること。
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Protocol
1. 電気刺激細胞培養室の建設
- 標準 6 も細胞培養皿; の 2 つの蓋を収集 EStim 室を構築するには99.99% プラチナ ワイヤ、60 cm の長さで直径 0.5-1 mm;シルバー コーティングされた銅線、0.6 mm の直径の長さ 70 cmペンチ。はんだごてキット;超伝導接着剤; の 1 つの管1 本のワイヤー ターミナル ブロック コネクタ、6 2.2 V Led の小型 (省略可能)。1 つの管の非腐食性シリコーン接着剤・塗装 (省略可能)。黒の絶縁テープ 1 巻標準、柔軟性、絶縁銅電線 (0.14 mm2)、2 m (材料表)。
- 6 ウェル プレート蓋、マーク (〜 1 mm の直径) と、ドリル 2 つの穴で 25 mm 離れて、六つのそれぞれの外側の端近く井戸 (合計の 12 穴) の図 1 a, Bに示すように。
- 白金線の 12 の 5 センチメートルの長さをペンチで切ったそれぞれの 1 つの端 3 センチを残して、L 字型に手動でワイヤーを曲げるし、他 2 cm。 2 つの 35 cm 長さにシルバー コーティングされたワイヤーをカットします。
- 1 つの白金線の長い (3 cm) 曲がった終わりを挿入 (から内側から外側へ) 各穴に鉗子を使用してそれを曲げる、蓋の外側から突き出ている 1-2 mm を残してします。超伝導接着剤で蓋の穴に白金線を確保し、約 6 時間乾燥させておきます。
- (それが後で陰極として、図 1 aを参照してください) すべての 6 白金線の先端をはんだ銀被覆線のいずれかに蓋から突き出ています。シルバー コーティングされたワイヤーに (つまり、陽極となる後) 残り 6 プラチナ ワイヤをはんだ付け、同じ手順を繰り返します。
- (オプション) の実験中の機能を確認する六つの陽極と陰極の白金電極ペアのそれぞれの間の回路に Led を追加します。黒の絶縁テープ led (図 1) に培養皿の細胞を公開することを防止する LED それぞれの下の部分を配置します。
- 6 ウェル プレート蓋の左上隅にワイヤー ターミナル ブロック コネクタを接着し、両方のシルバー コーティングされたワイヤーを図 1に示すように、入力端子に接続します。
- (図 1 b、ふた Nr 2) 最初の蓋の端子台コネクタに合わせて 2 番目 6 ウェル プレート蓋の左上隅から 20 mm × 20 mm のセクションをカットします。最初のふたは、ふたを 2 つ目の電極を装備をカバー、粘着テープとテープします。
- 2 つの蓋の接着を改善するために、シリコーン接着剤・塗装 (オプション) を使用します。シリコーン粘着剤の 3-5 mm の層で銀電極を用いた蓋をカバーし、12 時間乾燥して接着剤を許可する他のふたでカバーします。
- ワイヤ コネクタとバナナ オス コネクタ (4 mm) に他の端の出力端子に 2 つの標準的な絶縁銅線の片方の端を接続します。
注: これらのワイヤの長さは、電源、インキュベーター (図 1) の外に、セルが保持されます、インキュベーターの棚からの距離に依存します。 - 投与量 (電圧) と DC 電源を調節することによって、細胞に配信 EStim のレジメンを調整します。
- 前面パネルのオン/オフボタンを押して電源をオンに。ボタン1を押すと、チャンネル 1 をアクティブにします。
- ボタン Nr 4 (V セット) 電圧を設定するのにを押します。2、 .ボタンを押すと5 2.5 v. プレスEnterで負荷出力を設定します。
- 2.5 V の負荷出力確認 (2,500 mV) 以下、簡略化された方程式によると 100 mV/mm、EStim に対応します。
VEStim =
;または
V = VEStim × d
ここでは、 V = 電源電圧 (ミリボルト); 出力d = ミリメートル; で電極間距離VEStim刺激電圧の単位はミリボルト毎ミリメートル =。
注: この単純化は一定の直流電圧の場合にのみ適用されます。電極が、セルとの直接接触は、媒体とセル間の抵抗は無視代わりに、EStim は、媒体を介して細胞に配信されます。
;または2. 間葉系幹細胞培養骨の中
- 購入し、実験の日まで液体窒素で市販ラット MSCs (材料の表を参照) を格納します。また、プロトコルによると他の動物から隔離 MSCs 公開他実験動物の使用のためのローカル制度上の規則に従って7,8です。
- 実験の日に液体窒素貯蔵から MSCs の 1 バイアル (1 x 10 の6セル) を削除し、すぐに (1 分) 以内雪解けの 37 ° C に予熱水浴のセル
- 層流フードの無菌条件の下で 50 mL の隼の管にピペットのバイアル コンテンツと 1% と 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) 37 ° c、ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM; 1 x) から成る prewarmed 通常媒体 (NM) の 9 つの mL を追加ペニシリン/ストレプトマイシン液。300 × gで遠心分離によって 5 分間細胞をペレットします。
- 層流フードの上澄みを除去し、37 ° c. に prewarmed NM の 12 mL で慎重に細胞ペレットを再懸濁しますT-75 細胞培養用フラスコに再懸濁細胞を転送します。
- 37 ° C、5% CO25% O2細胞の培養 (約 3-5 日) 後 80%-90% の合流点に到達するまで。
- セルを通路します。
注: は、層流フードの遠心分離と無菌条件下でインキュベーションを除くすべての操作を実行します。- 80%-90% の合流点に達すると後、細胞剥離液で細胞を取得します。細胞培養培地を吸引洗浄 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 2 倍、細胞剥離液 x 1 の 5 mL を追加し、5 分のためのインキュベーターにセルを返します。
- セルを取り外したら、一度剥離ソリューションを不活化する培地の等しい量を追加します。50 mL の隼のチューブの細胞を収集し、300 x gで 5 分で、それらをスピンします。
- 培地を除去し、通常培の 1 mL の細胞を再懸濁します。トリパン ブルー染色で生菌数を評価します。
- 12 ml prewarmed NM の新しい T-75 フラスコの種子 1 x 106セル。80%-90% の合流点に到達するまで 37 ° C、5% CO25% O2の細胞を培養します。
注: セル継 (手順 2.4.1–2.4.4) 繰り返すことができます数回必要な細胞数が得られるまで。セル 8 の通路よりも古いを使用しないでください。
- シード 9 x 10 nm (10% 熱不活化牛胎児血清, 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、DMEM) 6 ウェル培養プレートの各ウェルに 3 mL の細胞。1 日 37 ° C、5% CO25% O2のセルを孵化させなさい。
- 次の日は、培地を吸引し、骨分化培地 (OM; 10-7 M デキサメタゾン、10 mM の β-グリセロリン酸、アスコルビン酸-2-リン酸 0.05 mM と通常の培) 3 mL を適用します。
- インキュベーター内細胞 6 ウェル プレートを置き、37 ° C、5% CO25% O2を一晩インキュベートします。
3. EStim の MSCs の治療
- 30 分; 70% エタノール溶液に電極を滅菌 EStim で細胞を処理日その後、さらに 30 分間キャビネット安全の UV 光の下でそれらを乾燥します。
- 層流フード カバー電極、電極が培地で完全に水中に沈むことを確かめる装備ふた付き培養 MSCs を含む 6 ウェル プレート (必要であれば追加中)。インキュベーターにセルで覆われて 6 ウェル プレート (EStim 室) を転送し、その線を電源装置に接続します。
- 2.5 V 電源セットの出力を読み込むし、1 h3,9EStim で細胞を治療します。
- 刺激後、電源を外し、インキュベーターから EStim 室。無菌条件下で標準的な 6 ウェル プレートふた付け電極装備ふたを交換します。
- インキュベーターにセルを返し、一晩おきます。電極、まず PBS とし、70% エタノール溶液をクリーニングします。目の細かいサンドペーパーで電極表面から蓄積された腐食生成物をクリーニングします。
- 6 日間連続の 3.1 から 3.5 の手順を繰り返します。日 4、EStim を適用する前に、無菌条件下で 1.5 mL の培地を吸引し、prewarmed 新鮮な om 1.5 mL でそれを置き換えることにより培養培地を変更します。
- 7 日間連続の EStim の後、交換の媒体ごとに 3-4 日さらに 7 日間、培養細胞を維持します。
4. 骨分化誘導測定
- 顕微鏡下で細胞の形態変化を分析します。
- として EStim の MSC 骨分化誘導、メジャー カルシウム沈着、アルカリホスファターゼ活性および骨マーカー遺伝子発現に及ぼす影響を評価するために他の所で説明した3,9。
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Representative Results
100 mV/mm EStim の MSCs EStim 3 細胞の骨分化誘導の効果を評価するには、7 と 14 日または未処理の (コントロール) の形態学的変化とカルシウム沈着 (図 2 を評価することによって培養 14 日目で分析しました。).4% パラホルムアルデヒド溶液中の細胞を固定、0.02% アリザリンレッド ソリューションとそれらを染色し、それらをイメージング、明るいフィールド顕微鏡 (形態変化) を使用してセルをイメージングこれは明視野顕微鏡 (カルシウム沈着による分析)。
骨マーカー遺伝子発現変動の詳細な分析は、3、7、および養殖 (図 3) の 14 日間で行われました。これは遺伝子RunX2の相対式、コラーゲン私、オステオポンチンと Rt-qpcr と比較デルタ Ct (しきい値サイクル) 法10、 Osterixを測定することによって行われていた場所ハウスキーピング遺伝子Rplp1とYwhaz11は、正規化を使用しました。
効果がなかった 3 日間 (1 日あたり 1 h) EStim の 100 mV/mm に MSCs を公開しかし、骨分化誘導、形態変化 (図 2 a– C)、カルシウム沈着 (図 2 e-G)、および骨のマーカー遺伝子の表現の変更 (によって決まるの増加をもたらした暴露の 7 日間図 3)比較して EStim せず時間をマッチさせた対照。EStim の長期暴露 (14 日) はでした (図 2 D、Hおよび図 3) 治療の 7 日後を見てそれを越えて骨分化をさらに強化していません。
図 2のように、セル EStim 7 を処理したと 14 日より凝縮 (図 2、D) EStim 3 日または未処理細胞 (図 2 a、B) を処理したものよりもそして示した増加カルシウム蒸着 (図 2, H) 3 日または未処理コントロール(図 2 e、Fのみの治療と比較して)。3、7、14 日培養骨マーカー発現の解析は、EStim 7 および 14 日後 (図 3) の細胞強化による骨分化を確認しました。7 日間 EStim 細胞、マーカーによる骨分化関連遺伝子12RunX2の発現、コラーゲンは私、オステオポンチン、 Osterixも最高だった。
図 1: EStim 細胞培養室。(A) 電気回路図 (赤)、陽極 (黒)、カソードを示す EStim 商工会議所と DC 電源に接続されている Led。6 ウェル プレート蓋にマーク 6 ウェル プレート蓋、L 形白金電極 (下面) の (B) イメージを組み込みます。(C) 組み立て EStim ワイヤ コネクタ、Led、LED ライト (矢印) から細胞をシールド電気絶縁テープと (平面図) の部屋します。(D) EStim は細胞外の DC 電源に接続されているインキュベーターで EStim 室を持つ治療法はセットアップです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: MSC の形態とカルシウムの沈着に及ぼす EStim 。7、および 14 日 (1 h/日) による骨培地、公開と公開されていません (コントロール) 100 mV/mm EStim の 3 のセルします。(A–D)形態および (E-H) 培養 14 日目にカルシウム沈着 (赤いアリザリン染色)。細胞形態やカルシウム沈着の大幅な変更に表示されていた細胞を処理した EStim (CおよびG) 7 (DとH) 14 日間 (10 倍の倍率; スケールバー = 200 μ m)。この図からブリュッセル ロジュ et al.が変更されました。9.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:MSC 骨マーカー遺伝子発現に対する効果の EStim 。(3、7、および培養 14 日 RT qPCR 測定) 骨マーカー遺伝子発現細胞では、3、7、14 日間、または未処理 EStim で扱われます。(A) 培養 7 日でRunX2式だった EStim 7 日間細胞で有意に高かった。(B) ColIa1式だった細胞培養 14 日目で測定された 7 日間の治療で有意に高かった。(C)オステオポンチンの発現は、3、7、および培養 14 日 EStim 処理細胞で増加しました。Osterix (D) 式は欠席したコントロールのセルは全然タイム ポイントと EStim 細胞における文化の 7 と 14 日でのみ見られました。バーの別の文字を示す重要な (p < 0.05) 差で同じ時間ポイント。印は重要な時点で同じグループ内の (p < 0.05) の違い。この図は、ブリュッセル ロジュら9から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでチャンバー、強化された骨分化誘導の結果 EStim による間葉系幹細胞を治療のための方法の構築について述べる.
提示 EStim セットアップ専門機器を必要としないし、若手研究者による標準的な幹細胞生物学・生化学研究室で実行できます。ただし、建物、EStim チャンバーを使って、特別な注意が必要、いくつかの重要なステップに。白金電極を処理するとき余分な注意が必要としてこの金属が非常に可鍛性、繊細です。鋼やタングステンなどの他の金属を使用できますが、彼らはことができる細胞13腐食に傾向がある、これらはいけません。また、電極とフタの洗浄/滅菌は、以来、このメソッドを何度もテストされており、汚染の問題をなくすために効果的なことが判明のプロトコルで説明として実行する必要があります。最後に、他にこの部屋を使用できますが EStim 敏感な細胞活動の足場の接着19、移行14,15増殖、アポトーシス16細胞膜電圧17のような、EStim プロトコルについて述べるここ (100 mV/mm、1 時間/日、7 日) より高い場合、MSCs 特別な注意を与えべきであるラットによる骨分化のみに焦点を当てて電圧 (≥150 mV/mm) および/または EStim の長い期間 (> 4-5 h) 細胞毒性製品から適用されます。媒体に蓄積される電気分解から生じる。この場合、媒体必要があります慎重に監視およびそれに応じて交換します。他のパラメーターおよび/または他の細胞の種類や条件を勉強する量 (電圧) を分割するをお勧めします。 療法滴定法の研究は EStim に細胞がどのように反応に影響を与えることができますこれらの変更を実施します。
EStim の部屋の可能な誤動作し、繰り返し使用した後電気回路内の区切りに起因することができます、追加の LED ランプ経由で監視することができます。破損の場合 (nonilluminated の LED light[s]) によって示されるふた削除でき特定して休憩を修復簡単に分解します。加えて、EStim 室のシンプルなデザインは、簡単にさまざまな実験的設定のニーズと分析の方法に従って変更します。単にによっての長さ、電極やセラミック足場材料4または導電性基板18、追加の別の (3 D) 培養条件の間の距離を変化させることにより細胞培養皿の異なったサイズの使用例します。電極間のセルを播種これらの材料を配置するだけ。
すべての in vitro 実験、細胞の挙動と関数のように EStim 室で観測/誘導が必ずしも in vivo モデルに直接譲渡すること。したがって、商工会議所で EStim による細胞の動作/機能を解釈するとき研究者常にこれ考慮に入れなければなりません。
セットアップとここで紹介した方法 EStim (塩橋5システム) と電極セル文化井戸19に組み込まれているシステムのセルを公開するために使用他の生体外の方法に比べて多くの利点があります。ここで説明したシステムの重要な利点は、標準的な 6 ウェル プレートで細胞を培養しているので、他の体内や体外のプロトコルで EStim 治療後使用できます。加えて、6 ウェル プレートの蓋の電極が固定されているという事実は、洗浄および滅菌実験間のデバイスを簡単に再利用します。最後に、六つの井戸の細胞を同時に刺激する能力は、分析および再現性のための十分な材料を提供します。
EStim ここで説明されているチャンバーを使用して進行中の研究で細胞の活動に影響する細胞膜レベルでのメカニズムのより良い理解を得るために外部配信 EStim と細胞膜との間に関係を探っています潜在的な (Vmem)17。さらに、前調査結果9、将来の研究に基づいて我々 が前処理セル特定の細胞の機能を刺激するだけで、異なる 3 D 足場と導電性基板、チャンバー内 EStimその後、彼らは生体内で観測された高度な機能を保持かどうかを決定するための動物モデルにインプラントがそれらの私たち.これらの研究は、どの EStim のメカニズムについての情報の成長体に貢献する細胞機能を調節して、そうすることで、再生医療や組織工学基づく細胞療法アプローチを最適化に貢献できます。トリートメント。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、AO 財団創業助成金 (S-14-03 H)、ブランクフルトか本管、ドイツに拠点を置く Friedrichsheim 財団 (財団 Friedrichsheim) によって部分的に支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
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