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Bioengineering

निर्माण और Mesenchymal स्टेम में Osteogenic भेदभाव को बढ़ाने के लिए एक विद्युत उत्तेजना चैंबर के उपयोग/Stromal इन विट्रो में कोशिकाओं

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/59127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Frankfurt Initiative for Regenerative Medicine, Johann Wolfgang Goethe-University, 2J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

Summary

यहां हम एक सेल संस्कृति विद्युत उत्तेजना के विभिंन प्रकार के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए डिज़ाइन चैंबर के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, और mesenchymal स्टेम सेल के इलाज में इसके उपयोग के लिए osteogenic भेदभाव को बढ़ाने के ।

Abstract

Mesenchymal स्टेम/stromal कोशिकाओं (MSCs) बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण में हड्डी चिकित्सा को बढ़ावा देने के । विद्युत उत्तेजना (EStim) के लिए इन विट्रो में एमएससी osteogenic भेदभाव को बढ़ाने और नैदानिक सेटिंग्स में हड्डी चिकित्सा को बढ़ावा देने के लिए प्रदर्शन किया गया है । यहां हम एक EStim सेल संस्कृति कक्ष के निर्माण का वर्णन और चूहे की अस्थि मज्जा-प्राप्त एमएससी osteogenic भेदभाव को बढ़ाने के इलाज में इसके उपयोग करते हैं । हमने पाया है कि osteogenic भेदभाव में एक महत्वपूर्ण वृद्धि में 7 दिनों के परिणाम के लिए EStim के साथ MSCs का इलाज है, और महत्वपूर्ण बात, इस समर्थक osteogenic प्रभाव लंबे समय के बाद बनी रहती है (7 दिन) EStim बंद है । EStim के साथ MSCs का इलाज करने के इस दृष्टिकोण osteogenic भेदभाव को बढ़ाने के लिए अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग उपचार परिणामों का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और, इस प्रकार, उन्हें अपनी पूरी चिकित्सीय क्षमता को प्राप्त करने में मदद. इस अनुप्रयोग के अतिरिक्त, इस EStim कक्ष संस्कृति कक्ष और प्रोटोकॉल का उपयोग अंय EStim-संवेदी कक्ष व्यवहारों, जैसे माइग्रेशन, प्रसार, apoptosis, और पाड़ अनुलग्नक की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है ।

Introduction

आघात और/या रोग-प्रेरित अस्थि दोषों में वृद्धि कोशिका चिकित्सा और अपक्षयी चिकित्सा प्रौद्योगिकियों के विभिंन संयोजनों का उपयोग कर इलाज किया जा रहा है । MSCs इस तरह के उपचार में पसंद की कोशिका हैं, उनके अपेक्षाकृत उच्च osteogenic गतिविधि के कारण, अलगाव और विस्तार दक्षता, और सुरक्षा1. उनके osteogenic गतिविधि को अधिकतम करने के लिए और, इस प्रकार, उनके चिकित्सीय प्रभाव का अनुकूलन, कई तरीकों को इन उपचार में उनके उपयोग करने से पहले MSCs हेरफेर शुरू किया गया है (के रूप में Mauney एट अल.2द्वारा की समीक्षा) । ऐसा ही एक तरीका है EStim, जिसमें3 विट्रो में एमएससी osteogenic भेदभाव को बढ़ाने और vivo4में हड्डी हीलिंग को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है । EStim के साथ MSCs के इलाज पर ध्यान केंद्रित अध्ययन की बढ़ती संख्या के बावजूद, EStim प्रो osteogenic प्रभाव अधिकतम करने के लिए एक इष्टतम आहार अभी तक परिभाषित किया जाना है ।

अंय इन विट्रो विधियों का उपयोग कर EStim नमक की संस्कृति के माध्यम है, जो धातु इलेक्ट्रोड5से अलग कोशिकाओं में जलमग्न पुलों का प्रयोग । इस का लाभ यह है कि नमक पुलों के माध्यम से EStim देने रासायनिक प्रतिफल (जैसे, धातु इलेक्ट्रोड की जंग) है कि साइटोटोक्सिक जा सकता है की शुरूआत समाप्त । इस लाभ के बावजूद, नमक पुल के साथ काम करने के लिए बोझिल हैं, और EStim वे उद्धार है कि vivo मॉडलों में दिया से अलग है, यह मुश्किल परिणाम प्राप्त करने के लिए जब दो प्रणालियों का उपयोग करने को सहसंबंधी बनाना । setups कि धातु के माध्यम से EStim देने या सेल संस्कृति वेल्स के अंदर तय की कार्बन इलेक्ट्रोड (के रूप में Hronik द्वारा की समीक्षा-टॊपाज और कापलान6) बेहतर अनुकरण उपकरणों में प्रयुक्त vivo; हालांकि, इन उपकरणों का उपयोग करता है और प्रति प्रयोग अध्ययन किया जा सकता है कि कोशिकाओं की संख्या सीमित है के बीच साफ/ हम EStim यहां प्रस्तुत विशेष रूप से इन अंय setups की सीमाओं को संबोधित चैंबर बनाया । जबकि हमारे अनुभव के सबसे इस EStim चैंबर का उपयोग कर 2d और 3 डी अस्थि मज्जा-और वसा-ऊतक-MSCs3,4, इस चैंबर के एक प्रमुख लाभ व्युत्पंन युक्त संस्कृतियों के साथ किया गया है कि यह बहुमुखी है और अपेक्षाकृत छोटे के साथ परिवर्तन, विभिंन स्थितियों की एक किस्म के तहत अंय प्रकार के सेल के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

यहां हम एक EStim सेल संस्कृति चैंबर के निर्माण का वर्णन; फिर, हम EStim के विभिंन परहेजों के साथ MSCs के इलाज और osteogenic भेदभाव पर जिसके परिणामस्वरूप प्रभाव को मापने के द्वारा इसके उपयोग का प्रदर्शन । एमएससी osteogenic भेदभाव कैल्शियम जमाव, alkaline फॉस्फेट गतिविधि, और osteogenic मार्कर जीन अभिव्यक्ति के माध्यम से मूल्यांकन किया है । महत्वपूर्ण बात, पिछले प्रयोग में है कि इस सेटअप का इस्तेमाल किया, हमने देखा है कि इन समर्थक osteogenic प्रभाव लंबे समय के बाद जारी रहती है EStim उपचार बंद कर दिया गया था ।

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Protocol

1. विद्युत उत्तेजना सेल संस्कृति चैंबर का निर्माण

  1. EStim चैंबर का निर्माण करने के लिए, मानक 6-well सेल कल्चर प्लेटों के दो ढक्कन इकट्ठा; ९९.९९% प्लैटिनम वायर, ६० सेमी लंबाई में 0.5 के व्यास के साथ-1 मिमी; चांदी लेपित तांबे के तार, ०.६ मिमी के व्यास के साथ लंबाई में ७० सेमी; काटना चिमटा; टांका लगाने का आयरन किट; superconductive गोंद की एक ट्यूब; एक तार टर्मिनल ब्लॉक कनेक्टर, छह छोटे २.२ वी एल ई डी (वैकल्पिक); संक्षारक सिलिकॉन चिपकने वाला कोटिंग की एक ट्यूब (वैकल्पिक); काले बिजली के इंसुलेशन टेप का एक रोल; मानक, लचीला, अछूता कॉपर बिजली के तार (०.१४ mm2), लंबाई में 2 मीटर (सामग्री की तालिका) ।
  2. एक 6-खैर प्लेट ढक्कन में, मार्क और फिर दो छेद ड्रिल (~ 1 मिमी के व्यास के साथ), 25 मिमी के अलावा, छह कुओं में से प्रत्येक के बाहरी छोर के पास (कुल में 12 छेद), के रूप में चित्र 1a, बीमें दिखाया गया है
  3. काटने चिमटा के साथ प्लेटिनम वायर की बारह 5 सेमी लंबाई कट । प्रत्येक तारों को मैंयुअल रूप से एक एल आकार में मोड़, एक अंत 3 सेमी लंबी और अंय 2 सेमी जा रहा है । कट चांदी लेपित तार में २ ३५ सेमी लंबाई ।
  4. अब (3 सेमी) एक प्लैटिनम वायर के तुला अंत डालें (अंदर से बाहर करने के लिए) प्रत्येक छेद drilled, 1 छोड़ने-2 ढक्कन के बाहर से फैला हुआ मिमी, यह संदंश का उपयोग मोड़ । superconductive गोंद के साथ ढक्कन छेद में प्लैटिनम तारों को सुरक्षित और यह लगभग 6 एच के लिए सूखी छोड़ने के लिए ।
  5. मिलाप सभी छह प्लेटिनम तारों के सुझावों (है कि बाद में कैथोड के रूप में सेवा करेंगे, चित्र 1aदेखें) के लिए एक चांदी के लेपित तारों के ढक्कन से फैला हुआ । एक ही प्रक्रिया दोहराएँ, शेष छह प्लैटिनम तारों टांका (कि बाद में एनॉड के रूप में सेवा करेंगे) अन्य चांदी लेपित तार करने के लिए.
    1. छह anode-कैथोड प्लेटिनम इलेक्ट्रोड जोड़े में से प्रत्येक के बीच सर्किट में एल ई डी जोड़ें, प्रयोगों के दौरान कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए (वैकल्पिक). प्रत्येक एलईडी प्रकाश (चित्रा 1C) के लिए संस्कृति प्लेटों में कोशिकाओं को उजागर करने को रोकने के लिए नेतृत्व के तहत काले इंसुलेशन टेप का एक टुकड़ा रखें ।
  6. गोंद वायर टर्मिनल ब्लॉक कनेक्टर 6-अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन के शीर्ष बाएँ कोने के लिए और इनपुट टर्मिनलों के लिए दोनों चांदी लेपित तारों कनेक्ट, के रूप में चित्रा 1Cमें दिखाया गया है ।
  7. पहले ढक्कन पर टर्मिनल ब्लॉक कनेक्टर को समायोजित करने के लिए एक दूसरे 6 अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन (आंकड़ा 1b, ढक्कन Nr .2) के शीर्ष बाएँ कोने से एक 20 मिमी x 20 मिमी अनुभाग में कटौती. पहले ढक्कन कवर, इलेक्ट्रोड से सुसज्जित, दूसरे ढक्कन के साथ और उन्हें एक साथ चिपकने वाला टेप के साथ टेप.
    1. दो ढक्कन के संबंध में सुधार करने के लिए, सिलिकॉन चिपकने वाला कोटिंग (वैकल्पिक) का उपयोग करें । ऐसा करने के लिए, एक 3 के साथ चांदी इलेक्ट्रोड के साथ ढक्कन कवर-5 सिलिकॉन चिपकने वाला मिमी परत और अन्य ढक्कन के साथ कवर, 12 एच चिपकने के लिए शुष्क करने के लिए अनुमति देता है.
  8. तार संबंधक के उत्पादन टर्मिनलों के लिए दो मानक अछूता तांबे के तारों के एक छोर से कनेक्ट और केले पुरुष connectors के लिए दूसरे छोर (4 मिमी) ।
    नोट: इन तारों की लंबाई मशीन में शेल्फ से दूरी पर निर्भर करता है, जहां कोशिकाओं को रखा जाएगा, बिजली की आपूर्ति के लिए, मशीन के बाहर (1 d) ।
  9. समायोजित खुराक (वोल्टेज) और EStim के आहार डीसी बिजली की आपूर्ति को विनियमित द्वारा कोशिकाओं को दिया.
    1. फ्रंट पैनल पर /बंद बटन दबाकर बिजली की आपूर्ति चालू करें । बटन 1दबाकर चैनल 1 को सक्रिय करें.
    2. प्रेस बटन Nr .4 (वी-सेट) वोल्टेज सेट करने के लिए. प्रेस बटन 2, . and 5 पर लोड उत्पादन सेट करने के लिए २.५ V. enterदबाएं ।
    3. यह सुनिश्चित करें कि २.५ V (२,५०० mV) का लोड आउटपुट १०० mV/mm, के अनुसार निम्न, सरलीकृत समीकरण के एक EStim करने के लिए संगत है ।
      वि EStim = Equation ; या
      वी = वीEStim × य d
      यहां, वी = बिजली की आपूर्ति millivolts में वोल्टेज उत्पादन; डी = मिलीमीटर में इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी; वि EStim = उत्तेजना वोल्टेज में millivolts मिलीमीटर प्रति.
      नोट: यह सरलीकरण केवल लगातार डीसी वोल्टेज के मामले में लागू होता है । मध्यम और कोशिकाओं के बीच प्रतिरोध नगण्य है इलेक्ट्रोड के रूप में कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में नहीं हैं; इसके बजाय, EStim माध्यम के माध्यम से कोशिकाओं को दिया जाता है ।

2. osteogenic मीडियम में Mesenchymal स्टेम सेल कल्चर

  1. प्रयोग के दिन तक तरल नाइट्रोजन में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चूहा MSCs ( सामग्री की तालिकादेखें) की खरीद और स्टोर करें । वैकल्पिक रूप से, अन्य जानवरों से MSCs को अलग करने के अनुसार अन्य पशुओं को प्रायोगिक पशुओं के उपयोग के लिए स्थानीय संस्थागत नियमों के अनुसार7,8 अन्यत्र प्रकाशित किया गया.
  2. प्रयोग के दिन पर, तरल नाइट्रोजन भंडारण से MSCs के एक शीशी (1 x 106 कोशिकाओं) को हटा दें, और जल्दी से (1 मिनट के भीतर) गल एक पानी स्नान में कोशिकाओं ३७ ° c करने के लिए गरम ।
    1. एक लामिना प्रवाह हूड में बाँझ शर्तों के तहत, एक ५० मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में शीशी सामग्री पिपेट और सामांय मध्यम (एनएम) ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम की 9 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, Dulbecco है संशोधित ईगल मध्यम (DMEM; 1x) 10% गर्मी के साथ शामिल-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन/streptomycin समाधान । ३०० x जीपर केंद्रापसारक द्वारा 5 मिनट के लिए कोशिकाओं गोली
    2. एक लामिना प्रवाह हूड में, supernatant को हटाने और ध्यान से ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म एनएम के 12 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । resuspend कोशिकाओं को एक टी-७५ सेल संस्कृति कुप्पी के लिए स्थानांतरण ।
  3. संस्कृति ३७ ° c, 5% CO2, 5% हे2 पर कोशिकाओं जब तक वे एक 80%-90% संगम (लगभग 3 के बाद-5 दिन) तक पहुंचने ।
  4. कोशिकाओं बीतने ।
    नोट: एक लामिना प्रवाह हूड में बाँझ शर्तों के तहत सभी आपरेशनों को छोड़कर और मशीनीकरण करते हैं ।
    1. एक 80%-90% संगम तक पहुंचने के बाद, सेल टुकड़ी समाधान के साथ कोशिकाओं को पुनः प्राप्त । सेल संस्कृति के माध्यम महाप्राण, 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ 2x धो, 1x सेल टुकड़ी समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और 5 मिनट के लिए मशीन के लिए कोशिकाओं को वापस ।
    2. एक बार कोशिकाओं अलग कर रहे हैं, संस्कृति माध्यम की एक बराबर राशि जोड़ने के लिए टुकड़ी समाधान निष्क्रिय । एक ५० मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उंहें 5 मिनट के लिए ३०० x g पर स्पिन ।
    3. मध्यम और पुनर्स्थगित कोशिकाओं ताजा सामान्य माध्यम के 1 मिलीलीटर में त्यागें । trypan नीले दाग के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का आकलन करें ।
    4. बीज 1 x 106 कोशिकाओं को एक नया टी में-७५ कुप्पी के 12 मिलीलीटर के साथ-गरम एनएम । संस्कृति ३७ ° c, 5% कं2, 5% हे2 में कोशिकाओं जब तक वे एक 80%-90% संगम तक पहुंचने ।
      नोट: कक्ष passaging (steps 2.4.1 – 2.4.4) को कई बार दोहराया जा सकता है जब तक की आवश्यक संख्या में कक्षों को प्राप्त नहीं किया जाता । 8 बीतने से पुराने कक्षों का उपयोग न करें ।
  5. बीज 9 x 104 एनएम के 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं (10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, DMEM) एक अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के प्रत्येक कुआं में । ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2, 5% ओ2पर 1 दिन के लिए कोशिकाओं को मशीन ।
  6. अगले दिन, महाप्राण संस्कृति मध्यम और osteogenic विभेदक मध्यम (ओम; सामांय मध्यम 10-7 एम डेक्समेतएसॉनी, 10 मिमी β-glycerophosphate, और ०.०५ mM ascorbic एसिड-2-फॉस्फेट) के साथ पूरक के 3 मिलीलीटर लागू होते हैं ।
  7. मशीन में कोशिकाओं और ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2, 5% हे2 रात भर में मशीन के साथ 6 अच्छी तरह से थाली रखें ।

3. EStim के साथ MSCs का इलाज

  1. दिन कोशिकाओं EStim के साथ इलाज कर रहे हैं, 30 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल समाधान में इलेक्ट्रोड निष्फल; फिर, उंहें एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए एक सुरक्षा कैबिनेट में यूवी प्रकाश के तहत सूखी ।
  2. एक लामिना फ्लो हुड में, इलेक्ट्रोड के साथ सुसज्जित ढक्कन के साथ संस्कृतिपूर्ण MSCs युक्त 6 अच्छी तरह से प्लेट को कवर, इलेक्ट्रोड पूरी तरह से मध्यम में डूबे हुए हैं कि सुनिश्चित कर रही है (यदि आवश्यक हो, माध्यम जोड़ने). कवर 6-अच्छी तरह से प्लेट (EStim चैंबर) मशीन के लिए कोशिकाओं के साथ हस्तांतरण और बिजली की आपूर्ति करने के लिए इसके तारों से कनेक्ट.
  3. २.५ V लोड उत्पादन के लिए बिजली की आपूर्ति सेट और 1 एच3,9के लिए EStim के साथ कोशिकाओं का इलाज ।
  4. उत्तेजना के बाद, बिजली की आपूर्ति डिस्कनेक्ट और मशीन से EStim चैंबर हटा दें । बाँझ शर्तों के तहत, एक मानक 6 अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन के साथ इलेक्ट्रोड के साथ सुसज्जित ढक्कन विनिमय.
  5. मशीन के लिए कोशिकाओं को वापस और उंहें रात भर छोड़ दें । साफ इलेक्ट्रोड, पहले पंजाबियों के साथ और फिर ७०% इथेनॉल समाधान के साथ. ठीक सैड के साथ इलेक्ट्रोड सतह से संचित जंग उत्पादों को साफ करें ।
  6. 6 लगातार दिनों के लिए कदम 3.1 – 3.5 दोहराएं । 4 दिन पर, EStim लागू करने से पहले और बाँझ शर्तों के तहत, aspirating द्वारा संस्कृति माध्यम परिवर्तन मध्यम के १.५ मिलीलीटर और यह की जगह से १.५ मिलीलीटर गरम ताजा ओम की ।
  7. लगातार 7 दिनों के लिए EStim लगाने के बाद, एक अतिरिक्त 7 दिनों के लिए संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखने, मध्यम हर 3-4 दिन का आदान प्रदान ।

4. Osteogenic विभेद मापन

  1. एक खुर्दबीन के नीचे कक्ष आकृति विज्ञान परिवर्तन का विश्लेषण ।
  2. एमएससी osteogenic विभेद पर EStim के प्रभाव का आकलन करने के लिए, कैल्शियम जमाव को मापने, क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि, और osteogenic मार्कर जीन अभिव्यक्ति, के रूप में कहीं वर्णित3,9.

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Representative Results

MSCs के osteogenic भेदभाव पर EStim के १०० एमवी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, 3, 7 के लिए EStim के साथ इलाज कोशिकाओं, और 14 दिन या अनुपचारित (नियंत्रण) संवर्धन परिवर्तन और कैल्शियम जमाव का आकलन करके रूपात्मक के 14 दिन में विश्लेषण किया गया (चित्रा 2 ). यह चमकदार क्षेत्र माइक्रोस्कोपी (आकृति परिवर्तन) का उपयोग कर या 4% paraformaldehyde समाधान में कोशिकाओं फिक्सिंग द्वारा इमेजिंग कोशिकाओं द्वारा किया गया था, उन्हें ०.०२% alizarin लाल समाधान के साथ दाग और फिर उन्हें उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग (कैल्शियम जमाव विश्लेषण).

osteogenic मार्कर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का एक विस्तृत विश्लेषण के दिनों में किया गया था 3, 7, और संवर्धन के 14 (चित्रा 3) । यह जीन RunX2, कोलेजन मैं, Osteopontinके सापेक्ष अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा किया गया था, और Osterix आरटी के माध्यम से qPCR और तुलनात्मक डेल्टा सीटी (दहलीज चक्र मूल्यों) विधि10, जहां गृह व्यवस्था जीन Rplp1 और 11 Ywhaz सामांय के लिए इस्तेमाल किया गया ।

3 दिनों के लिए EStim के १०० mV/mm करने के लिए MSCs को उजागर (1 घंटे प्रति दिन) कोई प्रभाव नहीं था; हालांकि, 7 जोखिम के दिनों osteogenic भेदभाव में वृद्धि के परिणामस्वरूप, के रूप में आकृति विज्ञान परिवर्तन (चित्रा 2a-सी), कैल्शियम जमाव (चित्रा 2E-जी), और osteogenic मार्कर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन द्वारा निर्धारित ( चित्रा 3) एक समय की तुलना में EStim के बिना नियंत्रण मिलान । लंबे समय तक EStim एक्सपोजर (14 दिन) आगे osteogenic भेदभाव है कि उपचार के 7 दिनों (चित्रा 2d, एच और चित्रा 3) के बाद देखा परे बढ़ाने नहीं किया ।

के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, 7 और 14 दिनों के लिए EStim के साथ इलाज कोशिकाओं और अधिक गाढ़ा (चित्रा 2cडी) 3 दिन या अनुपचारित कोशिकाओं (चित्रा 2a, बी) के लिए EStim के साथ इलाज की तुलना में दिखाई दिया और एक वृद्धि हुई कैल्शियम दिखाया साठा (चित्रा 2g, H) केवल 3 दिन या अनुपचारित नियंत्रण (चित्रा 2E, एफ) के लिए इलाज उन लोगों की तुलना में. 3, 7, और संवर्धन के 14 दिनों में osteogenic मार्कर अभिव्यक्ति का विश्लेषण 7 और 14 दिनों (चित्रा 3) के लिए EStim के साथ इलाज कोशिकाओं में बढ़ाया osteogenic भेदभाव की पुष्टि की । osteogenic की अभिव्यक्ति-भेदभाव से संबंधित मार्कर जीन12RunX2, कोलेजन मैं, Osteopontin, और Osterix कोशिकाओं में सबसे अधिक 7 दिनों के लिए EStim के साथ इलाज किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: EStim सेल संस्कृति चैंबर । (एक) EStim चैंबर के इलेक्ट्रिक सर्किट आरेख एनॉड (काला), कैथोड (लाल) दिखा रहा है, और डीसी बिजली की आपूर्ति से जुड़ा एल ई डी । (ख) 6-खैर प्लेट ढक्कन में शामिल चिह्नित 6 अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन और एल के आकार का प्लेटिनम इलेक्ट्रोड (नीचे देखें) की छवि । (ग) तार संबंधक, एल ई डी, और बिजली के इंसुलेशन टेप है कि एलईडी लाइट (तीर) से कोशिकाओं ढाल के साथ EStim चैंबर (शीर्ष देखें) इकट्ठे हुए । (घ) डीसी बिजली की आपूर्ति से जुड़े मशीन में EStim चैंबर के साथ EStim सेल उपचार सेटअप, बाहर पर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एमएससी आकृति विज्ञान और कैल्शियम जमाव पर EStim का प्रभाव. osteogenic संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं, उजागर और उजागर नहीं (नियंत्रण) 3, 7 और 14 दिनों के लिए EStim के १०० एमवी/mm के लिए (1 ज/ (A–D) आकृति विज्ञान और (ई–एच) संवर्धन के दिन 14 पर कैल्शियम जमाव (alizarin लाल दाग) । कक्ष आकृति विज्ञान और कैल्शियम जमा में महत्वपूर्ण परिवर्तन के लिए EStim के साथ इलाज किया कोशिकाओं में दिखाई दे रहे थे (सी और जी) 7 और (डी और एच) 14 दिन (10x आवर्धन; स्केल बार = २०० µm) । यह आंकड़ा Eischen-लॉजों एट अल से संशोधित किया गया था। 9. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एमएससी osteogenic मार्कर जीन अभिव्यक्ति पर EStim का प्रभाव । osteogenic मार्कर जीन अभिव्यक्ति (आरटी के साथ मापा-qPCR 3, 7, और संवर्धन के 14 दिनों में) 3, 7, और 14 दिनों, या गैर इलाज के लिए EStim के साथ इलाज किया कोशिकाओं में । (क) संवर्धन के 7 दिन में, RunX2 अभिव्यक्ति कोशिकाओं में काफी अधिक था 7 दिनों के लिए EStim के साथ इलाज किया । (ख) ColIa1 अभिव्यक्ति की कोशिकाओं में काफी अधिक था 7 दिनों के लिए इलाज किया, संवर्धन के 14 दिन में मापा । (ग) Osteopontin की अभिव्यक्ति EStim-इलाज कक्षों में ३, ७, और संवर्धन के १४ दिनों में काफी बढ़ गई थी. (घ) Osterix अभिव्यक्ति सभी समय बिंदुओं पर नियंत्रण कक्षों में अनुपस्थित थी और EStim के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में केवल ७ और १४ दिनों की संस्कृति को देखा गया था. पट्टियों पर विभिंन अक्षरों में एक ही समय बिंदु पर समूहों के बीच महत्वपूर्ण (p < ०.०५) अंतर इंगित करता है । तारांकन चिह्न एक ही समूह के भीतर समय बिंदुओं के बीच महत्वपूर्ण (p < ०.०५) अंतर इंगित करता है । यह आंकड़ा Eischen-लॉजों एट अल.9से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां हम एक कक्ष के निर्माण और EStim के साथ mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के इलाज के लिए एक विधि का वर्णन है कि बढ़ाया osteogenic भेदभाव में परिणाम है ।

EStim प्रस्तुत सेटअप विशेष उपकरण/ज्ञान की आवश्यकता नहीं है और एक मानक स्टेम सेल जीवविज्ञान में किया जा सकता है/ हालांकि, जब निर्माण और EStim चैंबर का उपयोग कर, विशेष देखभाल कुछ महत्वपूर्ण चरणों में लिया जाना चाहिए । जब प्लैटिनम इलेक्ट्रोड हैंडलिंग, अतिरिक्त देखभाल इस धातु के रूप में लिया जाना चाहिए बहुत ही निंदनीय और नाजुक है । जबकि अंय धातुओं, जैसे इस्पात या टंगस्टन, इस्तेमाल किया जा सकता है, इन के रूप में वे जंग के लिए प्रवण है सिफारिश नहीं कर रहे हैं, जो13साइटोटोक्सिक जा सकता है । इसके अलावा, सफाई/इलेक्ट्रोड के साथ ढक्कन के रूप में ठीक किया जाना चाहिए के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित के बाद से इस पद्धति का परीक्षण किया गया है और संक्रमण के साथ समस्याओं को दूर करने में प्रभावी हो पाया । अंत में, जबकि इस चैंबर प्रवास14,15, प्रसार, apoptosis16, सेल झिल्ली वोल्टेज17, और पाड़ आसंजन19, की तरह अन्य EStim-संवेदनशील सेल गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता EStim प्रोटोकॉल हम यहां वर्णन (१०० एमवी/1 ज/दिन, 7 दिन) केवल चूहा MSCs में osteogenic भेदभाव पर ध्यान केंद्रित । विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए यदि उच्च वोल्ट (≥ १५० एमवी/mm) और/या EStim की लंबी अवधि (> 4 – 5 ज) साइटोटोक्सिक उत्पादों के बाद से लागू कर रहे हैं इलेक्ट्रोलिसिस से उत्पन्न माध्यम में संचित कर सकते हैं । इस मामले में, मध्यम ध्यान से निगरानी की और तदनुसार विमर्श किया जाना चाहिए । अंय मापदंडों और/या अंय सेल प्रकार और शर्तों का अध्ययन करने के लिए, हम अनुशंसा करते है कि अलग खुराक (वोल्टेज) और आहार अनुमापन अध्ययन आयोजित किया जा के रूप में इन परिवर्तनों को प्रभावित कर सकते है कि कैसे कोशिकाओं EStim का जवाब ।

EStim चैंबर के संभावित खराबी दोहराया उपयोग के बाद बिजली के सर्किट में टूट जाता है और जोड़ा एलईडी लैंप के माध्यम से नजर रखी जा सकता है के कारण हो सकता है । टूटना के मामले में (प्रबुद्ध एलईडी प्रकाश द्वारा संकेत [एस]), ढक्कन हटाया जा सकता है और आसानी से पहचानने और तोड़ने की मरंमत करने के लिए जुदा । इसके अलावा, EStim चैंबर के सरल डिजाइन यह आसान अलग प्रयोगात्मक setups और विश्लेषण के तरीकों की जरूरतों के अनुसार इसे संशोधित करने के लिए बनाता है । उदाहरण सेल संस्कृति प्लेटों के विभिंन आकारों का उपयोग कर शामिल है, बस की लंबाई और इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी अलग है या (3 डी) सिरेमिक पाड़ सामग्री4 या प्रवाहकीय सब्सट्रेट18के साथ संस्कृति की स्थिति को जोड़ने के द्वारा, बस इन इलेक्ट्रोड के बीच कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त सामग्री रखने.

इन विट्रो प्रयोगों में सभी के रूप में, सेल व्यवहार और कार्यों मनाया/EStim चैंबर में प्रेरित हमेशा vivo मॉडल में करने के लिए हस्तांतरणीय नहीं हैं । तदनुसार, जब चैंबर में EStim प्रेरित सेल व्यवहार/कार्य की व्याख्या, शोधकर्ताओं ने हमेशा इस विचार में ले जाना चाहिए ।

सेटअप और विधि यहां प्रस्तुत इन विट्रो तरीकों में अंय पर कई फायदे है EStim करने के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए इस्तेमाल किया (नमक पुलों के साथ सिस्टम5 और प्रणालियों सेल संस्कृति वेल्स19में शामिल इलेक्ट्रोड के साथ) । प्रणाली का एक महत्वपूर्ण लाभ यहां वर्णित है कि, के बाद से कोशिकाओं को मानक 6 में संस्कृति रहे है अच्छी तरह से प्लेटें, वे vivo में अंय में या इन विट्रो प्रोटोकॉल में EStim उपचार के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, तथ्य यह है कि इलेक्ट्रोड 6-अच्छी तरह से प्लेट के ढक्कन पर तय कर रहे हैं यह आसान साफ और प्रयोगों के बीच डिवाइस को निष्फल करने के लिए और इसे पुन: उपयोग करने के लिए बनाता है. अंत में, एक साथ छह कुओं में कोशिकाओं को उत्तेजित करने की क्षमता विश्लेषण और reproducibility के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करता है ।

के लिए सेलुलर झिल्ली स्तर जो EStim चल रहे अध्ययन में सेल गतिविधियों को प्रभावित करता है यहां वर्णित चैंबर का उपयोग कर में तंत्र की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए, हम विदेश में वितरित EStim और कोशिका झिल्ली के बीच संबंधों की खोज कर रहे है संभावित (वीमेम)17. इसके अलावा, पिछले निष्कर्ष9पर आधारित, भविष्य के अध्ययन में, हम कक्ष में EStim के साथ कोशिकाओं का इलाज करेंगे, अकेले और अलग 3 डी पाड़ के साथ, और प्रवाहकीय सब्सट्रेट के साथ, विशिष्ट कोशिका कार्यों को प्रोत्साहित करने के लिए; तो, हम उंहें पशु मॉडल में प्रत्यारोपण के लिए अगर वे vivo में मनाया बढ़ाया कार्यों को बनाए रखने का निर्धारण करेगा । इन अध्ययनों से तंत्र के बारे में जानकारी के बढ़ते शरीर के लिए योगदान होगा जिसके द्वारा EStim सेल समारोह को विनियमित करने और, ऐसा करने में, अपक्षयी चिकित्सा और ऊतक में सेल थेरेपी के दृष्टिकोण को अनुकूलित करने के लिए योगदान कर सकते हैं-इंजीनियरिंग-आधारित उपचार.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम एक ए ओ फाउंडेशन स्टार्ट-अप ग्रांट (एस-14-03H) और Friedrichsheim फाउंडेशन (Stiftung Friedrichsheim) द्वारा फ्रैंकफर्ट/मेन, जर्मनी में आधारित हिस्से में समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Estim fabrication
Banana connector/Jack adaptor Poppstars 1008554 2 pieces
Cutting pliers Knipex 78 03 125
DC power supply (0-30V/0-3A) B&K Precision Model 9130B Any simular model could be used
Insulated flexible wires (0.14 mm2) Conrad Electronic International 604794, 604093 2 pieces
Non-corrosive silicone rubber Dow Corning 3140 RTV *could be purchased by many stores
Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) Junker Edelmetalle 00D-3010 0.6 m needed for 1 Estim chamber
70% Ethanol solution any Sterilisation of Estim chamber
Silver coated copper wire (0.6 mm ø) Conrad Electronic International 409334 - 62 ≈70 cm needed for 1 Estim device
Soldering iron Set Conrad Electronic International 1611410 - 62 Any simular model could be used
TPP 6-well plate lid Sigma-Aldrich Z707759-126EA 2 lids for Estim chamber
2.2V wired circular LEDs Conrad Electronic International 599525 - 62 6 pieces
UHU Super glue UHU GmbH & Co. KG n/a *could be purchased by many stores
MSC culture
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G9422 osteogenic cell culture
DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo-Fischer Scientific 21885025 cell culture
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo-Fischer Scientific 14190144 cell culture
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 osteogenic cell culture
Fetal Bovine Serum Thermo-Fischer Scientific 10500064 cell culture
50 ml Falcon tube Sarstedt 62,547,004 cell culture
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 osteogenic cell culture
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fischer Scientific 15140122 cell culture
Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin Cyagen RASMX-01001 cell culture
Cell detachment solution Thermo-Fischer Scientific A1110501 cell culture, cell detachment
TC Flask, T75 Sarstedt 833911302 cell culture
TPP 6-well plates Sigma-Aldrich Z707759-126EA cell culture
Trypan Blue Dye, 0.4% solution Bio-Rad 1450021 cell count

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References

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इंजीनियरिंग अंक १४३ विद्युत उत्तेजना चैंबर सेल संस्कृति एमएससी osteogenic विभेद प्रत्यक्ष वर्तमान 6-खैर प्लेट
निर्माण और Mesenchymal स्टेम में Osteogenic भेदभाव को बढ़ाने के लिए एक विद्युत उत्तेजना चैंबर के उपयोग/Stromal इन विट्रो में कोशिकाओं
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Leppik, L., Bhavsar, M. B., Oliveira, K. M. C., Eischen-Loges, M., Mobini, S., Barker, J. H. Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e59127, doi:10.3791/59127 (2019).

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