Summary
Nous présentons ici un protocole pour la construction d’une chambre de culture cellulaire conçue pour exposer les cellules de différents types de stimulation électrique et son utilisation dans le traitement des cellules souches mésenchymateuses afin d’améliorer la différenciation ostéogénique.
Abstract
Cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) ont été largement utilisés pour promouvoir la guérison osseuse dans les approches en génie tissulaire. Stimulation électrique (EStim) a été démontrée pour augmenter la différenciation ostéogénique MSC in vitro et promouvoir OS guérison en milieu clinique. Nous décrivons ici la construction d’une chambre de culture de cellules EStim et son utilisation dans le traitement de rat MSC OS-moelle osseuse afin d’améliorer la différenciation ostéogénique. Nous avons constaté que traitant MSCs avec EStim pendant 7 jours se traduit par une augmentation significative de la différenciation ostéogénique, et surtout, cet effet pro-ostéogénique persiste longtemps après que (7 jours) EStim est discontinué. Cette approche de pré-traitement MSCs avec EStim afin d’améliorer la différenciation ostéogénique pourrait être utilisée pour optimiser le tissu osseux, ingénierie des résultats du traitement et, ainsi, les aider à réaliser leur potentiel thérapeutique complet. En plus de cette application, cette chambre de culture de cellules EStim et protocole permet également d’enquêter sur d’autres comportements de cellule EStim sensibles, tels que de la migration, prolifération, apoptose et fixation de l’échafaudage.
Introduction
Une augmentation des traumatismes et/ou défauts osseux induite par la maladie sont traitées à l’aide de différentes combinaisons de thérapie cellulaire et les technologies de la médecine régénérative. MSCs sont la cellule de choix dans ces traitements, en raison de leur activité ostéogénique relativement élevée, isolement et expansion efficacité et sécurité1. Pour optimiser leur activité ostéogénique et, par conséquent, optimiser leur efficacité thérapeutique, plusieurs méthodes ont été introduites pour manipuler les MSCs avant leur utilisation dans ces traitements (tel qu’il est examiné par Mauney Al.2). Une de ces méthodes est EStim, qui a été montré pour améliorer la différenciation ostéogénique MSC in vitro3 et promouvoir OS in vivo4de guérison. Malgré le nombre croissant d’études qui portent sur le traitement de MSCs avec EStim, un régime optimal pour maximiser l’effet pro-ostéogénique de EStim doit encore être défini.
Autres méthodes in vitro à l’aide d’EStim utilisent des ponts salins immergés dans le milieu de culture, qui sépare les cellules des électrodes métalliques5. L’avantage de ceci est que livraison estimée par l’intermédiaire de ponts salins élimine l’introduction de sous-produits chimiques (p. ex., la corrosion des électrodes métalliques) qui peuvent être cytotoxiques. Malgré cet avantage, ponts salins sont difficiles à travailler avec, et l’EStim ils livrent diffère de celui livré en modèles in vivo, compliquant la corrélation entre les résultats obtenus en utilisant les deux systèmes. Configurations qui offrent EStim via des électrodes métalliques ou de carbone fixés à l’intérieur des puits de culture cellulaire (tel que revu par Hronik-Tupaj et Kaplan6) mieux simulent appareils utilisés in vivo ; Cependant, ces dispositifs sont difficiles à nettoyer/stériliser entre chaque utilisation et le nombre de cellules qui peuvent être étudiés par l’expérience est limité. Nous avons conçu la chambre EStim présentée ici spécifiquement pour pallier les lacunes de ces autres configurations. Alors que la majeure partie de notre expérience dans l’utilisation de cette chambre EStim travaille chez 2D et 3D cultures contenant de la moelle osseuse et adipeux tissu-dérivés - MSCs3,4, est un avantage majeur de cette chambre, qui il est polyvalent et, avec relativement mineur changements, peut être adapté pour étudier d’autres types de cellules dans une variété de différentes conditions.
Nous décrivons ici la construction d’une chambre de culture de cellules EStim ; Ensuite, nous montrons l’utilisation de MSCs traitants avec différents schémas d’EStim et mesurant l’effet qui en résulte sur la différenciation ostéogénique. Différenciation ostéogénique MSC est évaluée par le dépôt de calcium, l’activité phosphatase alcaline et expression du gène marqueur ostéogénique. Ce qui est important, dans passé des expériences qui ont utilisé cette configuration, nous avons observé que ces effets pro-ostéogénique persistent longtemps après que le traitement EStim a été interrompu.
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Protocol
1. construction de la chambre de culture de cellules stimulation électrique
- Pour construire la chambre EStim, recueillir deux couvercles de plaques de culture cellulaire standard de 6 puits ; fil de platine à 99,99 %, 60 cm de long avec un diamètre de 0,5 à 1 mm ; fil de cuivre argenté, 70 cm de long avec un diamètre de 0,6 mm ; pinces coupantes ; kit fer à souder ; un tube de colle supraconducteur ; un seul fil terminal de connexion, six petites 2,2 V LED (en option) ; un tube de colle silicone non corrosive revêtement (facultatif) ; un rouleau de ruban électrique noir ; norme, flexible, isolation câble électrique en cuivre (0,14 mm2), 2 m de long (Table des matières).
- Dans un couvercle de plaque 6 puits, mark et puis Percez deux trous (d’un diamètre de ~ 1 mm), 25 millimètres, près du bord extérieur de chacun des six puits (12 trous au total), comme illustré à la Figure 1 a, B.
- Coupez douze longueurs de 5 cm de fil de platine avec la pince coupante. Plier chacun des fils manuellement en forme de L, laissant une extrémité 3 cm de long et l’autre 2 cm. Coupez le fil argenté en deux longueurs de 35 cm.
- Insérez l’extrémité coudée de long (3 cm) d’un fil de platine (de l’intérieur vers l’extérieur) dans chaque trou percé, laissant dépasser 1 à 2 mm par l’extérieur de la paupière, le plier avec une pincette. Fixez les fils de platine dans les trous du couvercle avec de la colle supraconducteur et laisser sécher pendant environ 6 h.
- Souder les bouts de tous les six fils de platine (qui sera plus tard servir de cathodes, voir Figure 1 a) qui dépasse les couvercles à l’un des fils argenté. Répétez la même procédure, souder les fils de platine six restants (qui serviront plus tard comme anodes) à l’autre fil argenté.
- Ajouter des LEDs dans le circuit entre chacune des six anode-cathode électrode de platine paires, pour confirmer la fonctionnalité au cours des expériences (en option). Placez un morceau de ruban isolant noir sous chaque LED afin d’éviter d’exposer les cellules dans les plaques de culture à la lumière de LED (Figure 1).
- Coller le fil terminal de connexion pour le coin supérieur gauche du couvercle plaque 6 puits et raccorder les deux fils argenté aux bornes d’entrées, comme illustré à la Figure 1.
- Découper une section de 20 x 20 mm depuis le coin supérieur gauche d’un deuxième couvercle plaque 6 puits (Figure 1 b, couvercle Nr. 2) pour accueillir le terminal de connexion sur le couvercle du premier. Couvrir le premier couvercle, équipé d’électrodes, le second couvercle et avec du ruban adhésif avec du ruban adhésif.
- Pour améliorer la liaison des deux couvercles, utilisez adhésif siliconé enduit (en option). Pour ce faire, couvrir le couvercle avec des électrodes d’argent avec une couche de 3 à 5 mm de colle silicone et recouvrir avec l’autre couvercle, permettant à 12 h pour la colle sécher.
- Branchez une extrémité des deux fils de cuivre isolés standards aux bornes de sortie du connecteur de fil et les autres extrémités de connecteurs mâles de banane (4 mm).
Remarque : La longueur de ces fils dépend de la distance de la tablette dans l’incubateur, où les cellules seront conservés, à l’alimentation, en dehors de l’incubateur (Figure 1). - Ajuster la posologie (tension) et régime d’EStim livrés aux cellules en réglant l’alimentation DC.
- Allumez l’alimentation en appuyant sur le bouton ON/OFF sur le panneau avant. Activer le canal 1 en appuyant sur le bouton 1.
- Appuyez sur bouton Nr. 4 (V-set) pour régler la tension. Appuyez sur boutons 2, . et 5 pour régler la sortie de charge à 2,5 V. Appuyez sur Enter.
- Faire en sorte que la sortie de charge de 2,5 V (2 500 mV) correspond à un budget de 100 mV/mm, selon l’équation suivante, simplifiée.
V EStim =
; ou
V = VEStim × d
Ici, V = la tension d’alimentation de sortie en millivolts ; d = la distance entre les électrodes en millimètres ; V EStim = la tension de stimulation en millivolts par millimètre.
Remarque : Cette simplification s’applique seulement en cas de tension constante. La résistance entre les cellules et le milieu est négligeable comme électrodes ne sont pas en contact direct avec les cellules ; Alors, EStim est remis dans les cellules par l’intermédiaire.
; ou2. mesenchymal stem cell culture dans un milieu ostéogénique
- Acheter et stocker MSCs rat disponibles dans le commerce (voir Table des matières) dans l’azote liquide jusqu’au jour de l’expérience. Par ailleurs, isolat MSCs provenant d’autres animaux selon les protocoles publiés ailleurs7,,8 , conformément aux règlements institutionnels locaux pour l’utilisation des animaux d’expérimentation.
- Le jour de l’expérience, retirer un flacon (1 x 106 cellules) de MSCs dans le stockage de l’azote liquide et rapidement (en moins de 1 min) décongeler les cellules dans un bain-marie chauffé à 37 ° C.
- Dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire, distribuer le contenu du flacon dans un tube falcon de 50 mL et ajouter 9 mL de milieu normal (NM) préchauffé à 37 ° C, consistant en support de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM ; 1 x) avec 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) et 1 % solution de pénicilline/streptomycine. Les cellules pendant 5 min à pellets par centrifugation à 300 x g.
- Dans une hotte à flux laminaire, éliminer le surnageant et soigneusement resuspendre le culot dans 12 mL de NM préchauffé à 37 ° C. Transférer les cellules resuspendues dans un flacon de culture cellulaire T-75.
- La culture des cellules à 37 ° C, 5 % de CO2, 5 % O2 jusqu'à ce qu’ils atteignent une confluence de 80 à 90 % (après environ 3 à 5 jours).
- Le passage des cellules.
Remarque : Effectuez toutes les opérations sauf la centrifugation et l’incubation dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire.- Après avoir atteint une confluence de 80 à 90 %, récupérer les cellules avec la solution de détachement cellulaire. Aspirez le milieu de culture cellulaire, laver 2 x avec 1 x tampon phosphate salin (PBS), ajouter 5 mL de solution de détachement cellulaire 1 x et remettez les cellules dans l’incubateur pendant 5 min.
- Une fois que les cellules sont détachent, ajouter une quantité égale de milieu de culture pour inactiver la solution de détachement. Recueillir les cellules dans un tube falcon de 50 mL et leur filer à 300 x g pendant 5 min.
- Jeter le milieu et remettre en suspension des cellules dans 1 mL de milieu normal frais. Évaluer le nombre de cellules viables avec tache bleu trypan.
- Graines de 1 x 106 cellules dans une fiole de nouveau T-75 avec 12 mL de NM préchauffée. La culture des cellules à 37 ° C, 5 % de CO2, 5 % O2 jusqu'à ce qu’ils atteignent une confluence de 80 à 90 %.
NOTE : Cellule passage (mesures 2.4.1–2.4.4) peut être répétée plusieurs fois, jusqu'à ce que le nombre de cellules requis est obtenu. Ne pas utiliser plus de passage 8 cellules.
- Graine de 9 x 104 cellules dans 3 mL de NM (10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, 1 % pénicilline/streptomycine, DMEM) dans chaque puits d’une plaque de 6 puits culture. Incuber les cellules 1 nuit à 37 ° C, 5 % de CO2, 5 % O2.
- Le lendemain, aspirer le milieu de culture et d’appliquer 3 mL de milieu de différenciation ostéogénique (OM ; normal additionné à 10-7 M dexaméthasone, β-glycérophosphate de 10 mM et 0,05 mM d’acide ascorbique-2-phosphate).
- Placer la plaque de 6 puits avec des cellules dans un incubateur et incuber à 37 ° C, 5 % de CO2, 5 % O2 pendant la nuit.
3. traitement MSCs avec EStim
- Le jour, que les cellules sont traitées avec EStim, stériliser les électrodes dans la solution d’éthanol 70 % pendant 30 min ; Ensuite, faites-les sécher sous ultraviolets dans une armoire de sécurité pour un 30 min supplémentaire.
- Dans une hotte à flux laminaire, couvrir la plaque de 6 puits contenant les MSCs cultivées avec le couvercle avec des électrodes, en veillant à ce que les électrodes soient complètement immergés dans le milieu (si nécessaire, ajouter moyen). Placer la plaque de 6 puits couverte (EStim chambre) avec les cellules dans l’étuve et brancher son fils à l’alimentation.
- Prévoyez l’alimentation à la sortie de charge 2,5 V et traiter les cellules avec EStim pour 1 h3,9.
- Après stimulation, couper l’alimentation et retirez la chambre EStim de l’incubateur. Dans des conditions stériles, échanger le couvercle muni d’électrodes avec un couvercle standard des plaques 6 puits.
- Remettez les cellules dans l’incubateur et les laisser toute la nuit. Nettoyer les électrodes, tout d’abord avec du PBS, puis avec la solution d’éthanol à 70 %. Nettoyer les produits accumulés à la corrosion de la surface de l’électrode avec papier abrasif fin.
- Répétez les étapes 3.1 – 3,5 pour 6 jours consécutifs. Jour 4, avant l’application EStim et dans des conditions stériles, changer le milieu de culture par aspiration 1,5 mL de milieu et son remplacement par 1,5 mL de l’OM préchauffée fraîche.
- Après avoir appliqué EStim pendant 7 jours consécutifs, maintenir les cellules en culture pour 7 jours supplémentaires, échangeant le milieu tous les 3-4 jours.
4. des mesures de différenciation ostéogénique
- Analyser les changements de morphologie des cellules au microscope.
- Afin d’évaluer l’effet de EStim sur MSC différenciation ostéogénique, mesure le dépôt de calcium, phosphatase alcaline et expression du gène marqueur ostéogénique, comme décrits ailleurs3,9.
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Representative Results
Pour évaluer l’effet de 100 mV/mm de EStim sur la différenciation ostéogénique de MSCs, les cellules traitées avec EStim pour 3, 7 et 14 jours ou non-traitées (contrôle) ont été analysées à 14 jours de culture en évaluant les changements morphologiques et le dépôt de calcium (Figure 2 ). Cela a été fait par imagerie de cellules à l’aide de la microscopie lumineuse (changements de morphologie) ou par fixation des cellules en solution à 4 % paraformaldéhyde, leur coloration avec une solution d’alizarine 0,02 % et puis imagerie eux à l’aide de la microscopie lumineuse (dépôt de calcium analyse).
Une analyse détaillée des modifications de l’expression génique ostéogénique marqueur a été réalisée au jour 3, 7 et 14 de culture (Figure 3). Cela a été fait en mesurant l’expression relative des gènes RunX2, collagène I, ostéopontineet Osterix au moyen de la RT-qPCR et le delta comparatif Ct (valeurs de cycle seuil) méthode10, où gènes de ménage Rplp1 et Ywhaz,11 ont été utilisés pour la normalisation.
Exposant MSCs 100 mV/mm d’EStim pendant 3 jours (1 h par jour) n’avait aucun effet ; Toutefois, 7 jours d’exposition a entraîné une augmentation dans la différenciation ostéogénique, tel que déterminé par les changements de morphologie (Figure 2 a– C), le dépôt de calcium (Figure 2E– G) et (changements) marqueur ostéogénique gene expression La figure 3) par rapport à un contrôle apparié dans le temps sans EStim. Une exposition prolongée EStim (14 jours) n’augmente pas davantage la différenciation ostéogénique au-delà de celle observée après 7 jours de traitement (Figure 2DH et Figure 3).
Tel qu’illustré à la Figure 2, cellules traitement avec EStim pour 7 et 14 jours sont apparus plus étroites (Figure 2D) que ceux traités avec EStim pendant 3 jours ou cellules non traités (Figure 2 aB) et a montré un augmentation de calcium dépôt (Figure 2H) par rapport à ceux traités pendant seulement 3 jours ou contrôles non traités ()Figure 2EF). L’analyse de l’expression du marqueur ostéogéniques à 3, 7 et 14 jours de culture a confirmé la différenciation ostéogénique accrue dans les cellules traitées avec EStim pendant 7 à 14 jours (Figure 3). L’expression du marqueur de différenciation ostéogénique-liées gènes12RunX2, collagène I, ostéopontineet Osterix étaient les plus élevés dans les cellules traitées avec EStim pendant 7 jours.
Figure 1 : chambre de culture de cellules EStim. Diagramme de circuit électrique (A) de la chambre de EStim montrant les anodes (noirs), cathodes (rouge) et les LEDs reliés au bloc d’alimentation DC. (B) Image du couvercles marqué plaque 6 puits et des électrodes de platine en forme de L (vue de dessous) incorporé dans le couvercle de la plaque 6 puits. (C) assemblé EStim de la chambre (vue de dessus) avec connecteur de fil, LEDs et bande d’isolation électrique qui protège les cellules de la lumière de LED (flèches). Installation de traitement avec la chambre EStim dans l’incubateur branché sur l’alimentation DC, à l’extérieur des cellules EStim (D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : effet d’EStim contre les dépôts de morphologie et de calcium MSC. Les cellules ostéogénique milieu de culture, exposés et non exposés (contrôles) 100 mV/mm d’EStim pour 3, 7 et 14 jours (1 h/jour). (A–D) Morphologie etE-Hle dépôt de calcium (coloration de la solution d’alizarine) le 14e jour de culture. Des changements significatifs dans les dépôts de morphologie et de calcium cellulaire étaient visibles dans les cellules traitées avec EStim (C et G) 7 et (D et H) 14 jours (grossissement de 10 x, la barre d’échelle = 200 µm). Ce chiffre a été modifié de Eischen-Loges et al. 9. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Effet d’EStim sur l’expression du gène marqueur ostéogénique MSC. L’expression du gène marqueur ostéogénique (mesurée avec la RT-qPCR au jour 3, 7 et 14 de culture) dans les cellules traitées avec EStim pour les 3, 7 et 14 jours, ou non-traitées. (A) au 7e jour de culture, l’expression de RunX2 était significativement plus élevée dans les cellules traitées avec EStim pendant 7 jours. (B) l' ColIa1 expression était significativement plus élevée dans les cellules traitées pendant 7 jours, mesuré au 14e jour de culture. (C), l’expression de l’ostéopontine a significativement augmenté dans les cellules traitées EStim au jour 3, 7 et 14 de la culture. Expression (D), Osterix était absente dans le contrôle des cellules à tous les fois points et a été vu seulement à 7 et 14 jours de culture dans les cellules exposées à EStim. Différentes lettres sur les barres indiquent importantes différences (p < 0,05) entre les groupes en même temps le point. L’astérisque indique les importantes différences (p < 0,05) entre les points dans le temps au sein du même groupe. Ce chiffre a été modifié entre Eischen-Loges et coll.9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici la construction d’une chambre et une méthode pour le traitement des cellules souches mésenchymateuses EStim qui entraîne une différenciation ostéogénique.
L’installation d’EStim présentée ne nécessite pas d’équipement/connaissances particulières et peut être effectuée dans un laboratoire de biologie/biochimie des cellules souches standard de chercheurs débutants. Toutefois, lorsque la construction et à l’aide de la chambre EStim, spécial il faut en quelques étapes critiques. Lorsque vous manipulez les électrodes de platine, supplémentaire il faut que ce métal est très malléable et délicat. Tandis que les autres métaux, tels que l’acier ou de tungstène, peuvent être utilisés, ceux-ci ne sont pas recommandées car elles sont sujettes à la corrosion, ce qui peut être cytotoxique13. En outre, le couvercle avec des électrodes de nettoyage/stérilisation doit être effectuée aussi précisément comme décrit dans le protocole, car cette méthode a été testée à plusieurs reprises et s’est avérée efficace pour éliminer les problèmes de contamination. Enfin, alors que cette Assemblée pourrait être utilisée pour étudier les autres activités de cellules sensibles EStim migration14,15, prolifération, apoptose16, membrane cellulaire tensions17et échafaudage adhérence19, la EStim protocole nous décrivons ici (100 mV/mm, 1 h/jour, 7 jours), axé sur la différenciation ostéogénique dans rat MSCs. extraordinaire attention devrait être accordée s’il est supérieur tensions (≥150 mV/mm) ou plus longues durées d’EStim (> 4-5 h) sont appliqués depuis produits cytotoxiques résultant de l’électrolyse peut s’accumuler dans le milieu. Dans ce cas, le support doit être soigneusement surveillé et échangé en conséquence. Afin d’étudier d’autres paramètres ou d’autres types de cellules et conditions, nous recommandons que séparer le dosage (tension) et régime titrage être menées que ces changements peuvent affecter comment les cellules réagissent aux EStim.
Dysfonctionnement possible de la chambre EStim peut être en raison de ruptures dans le circuit électrique après un usage répété et peut être écouté via les lampes LED ajoutés. En cas de rupture (indiqué par nonilluminated LED light[s]), le couvercle peut être retiré et facilement démontables pour identifier et réparer la rupture. En outre, la conception simple de la chambre EStim le rend facile de le modifier selon les besoins des différentes configurations expérimentales et les méthodes de l’analyse. Des exemples incluent l’utilisation de différentes tailles de plaques de culture cellulaire, en faisant simplement varier la durée et la distance entre les électrodes ou les conditions de culture (3D) différente ajoutant avec céramique échafaudage matériel4 ou substrats conducteurs18, par simplement placer ces matériaux ensemencée avec des cellules entre les électrodes.
Comme dans toutes les expériences in vitro, les comportements de la cellule et les fonctions observées/induits dans la chambre EStim ne sont pas toujours directement transférables à modèles in vivo. En conséquence, lorsqu’on interprète les comportements/fonctions EStim-induite de cellules dans la chambre, chercheurs doivent toujours prendre cela en considération.
L’installation et la méthode présentée ici présentent de nombreux avantages par rapport aux autres méthodes in vitro utilisé pour exposer les cellules à EStim (systèmes avec ponts salins5 ) et avec les électrodes intégrées dans la cellule culture puits19. Un avantage important du système décrit ici est que, étant donné que les cellules sont cultivées dans des plaques 6 puits standard, ils peuvent être utilisés après traitement EStim dans les autres protocoles in vivo ou in vitro. En outre, le fait que les électrodes sont fixées sur le couvercle de la plaque 6 puits le rend facile à nettoyer et à stériliser l’appareil entre les expériences et de le réutiliser. Enfin, la capacité de stimuler simultanément les cellules dans six puits fournit amplement d’éléments d’analyse et de la reproductibilité.
Pour acquérir une meilleure compréhension des mécanismes au niveau de la membrane cellulaire par lequel EStim affecte les activités de la cellule dans les études en cours à l’aide de la chambre décrite ici, nous étudions la relation entre l’extérieur livrée EStim et membrane cellulaire potentiels (Vmem)17. En outre, basé sur les précédentes conclusions9, à l’avenir des études, nous seront prétraiter les cellules avec EStim de la chambre, seule et avec différents échafaudages 3D et avec des substrats conducteurs, pour stimuler les fonctions des cellules spécifiques ; Ensuite, nous leur implantera dans des modèles animaux pour déterminer s’ils conservent les fonctions améliorées observées in vivo. Ces études contribueront au nombre croissant d’informations sur les mécanismes par lequel EStim régulent la fonction cellulaire et, ce faisant, pourrait contribuer à l’optimisation des approches de thérapie cellulaire en médecine régénérative et tissus dotés d’ingénierie traitements.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de démarrage de la Fondation AO (S-14-03 H) et la fondation de Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) basé à Francfort/Main, Allemagne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
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