Summary
نقدم هنا بروتوكولا لبناء دائرة الثقافة الخلية مصممة للكشف عن خلايا لأنواع مختلفة من التحفيز الكهربائي، واستخدامها في علاج الخلايا الجذعية الوسيطة لتعزيز التمايز أوستيوجينيك.
Abstract
وقد استخدمت على نطاق واسع الخلايا الجذعية الوسيطة/stromal (MSCs) التئام العظام في الأنسجة الهندسة النهج. التحفيز الكهربائي (إستيم) قد ثبت لزيادة التمايز أوستيوجينيك ماجستير في المختبر وتعزيز العظام شفاء في إعدادات السريرية. هنا يمكننا وصف بناء دائرة الثقافة الخلية إستيم واستخدامها في علاج الفئران MSC المشتقة من نخاع العظام لتعزيز التمايز أوستيوجينيك. لقد وجدنا أن علاج MSCs مع إستيم لمدة 7 أيام يؤدي إلى زيادة كبيرة في التفريق بين أوستيوجينيك، والأهم من ذلك، يستمر هذا التأثير برو أوستيوجينيك بعد فترة طويلة من توقف إستيم (7 أيام). يمكن استخدام هذا النهج لتقشير MSCs مع إستيم لتعزيز التمايز أوستيوجينيك لتحسين نسيج العظام الهندسة نتائج العلاج، وهكذا، تساعدهم على تحقيق إمكاناتهم الكاملة العلاجية. وبالإضافة إلى هذا التطبيق، يمكن أيضا استخدام هذا إستيم خلية دائرة الثقافة والبروتوكول للتحقيق في السلوكيات خلية إستيم الحساسة الأخرى، مثل الهجرة والانتشار والمبرمج ومرفق السقالة.
Introduction
زيادة في الصدمات النفسية و/أو تشوهات العظام التي يسببها المرض يعالجون باستخدام تركيبات مختلفة من العلاج بالخلايا وتقنيات الطب التجديدي. MSCs هي الخلية المختارة في هذه العلاجات، بسبب نشاط osteogenic عالية نسبيا، والعزلة وكفاءتها التوسع، وسلامة1. لتحقيق أقصى قدر من النشاط أوستيوجينيك، وهكذا، تحسين فعاليتها العلاجية، أدخلت عدة أساليب للتلاعب MSCs قبل استخدامها في هذه العلاجات (كما استعرضها موني et al.2). أحد هذه الأساليب هو إستيم، التي أبدت تعزيز التمايز أوستيوجينيك ماجستير في المختبر3 وتعزيز العظام شفاء المجراة في4. وعلى الرغم من تزايد عدد الدراسات التي تركز على علاج MSCs مع إستيم، نظام أمثل لتحقيق أقصى قدر من التأثير برو osteogenic إستيم في لم تتحدد.
استخدام أساليب أخرى في المختبر باستخدام إستيم الملح الجسور مغمورة في الأجلين المتوسط والثقافة، الذي يفصل بين الخلايا من أقطاب معدنية5. وميزة هذا هو أن إيصال إستيم عبر الجسور الملح يزيل إدخال مشتقات كيميائية (مثلاً، التآكل من أقطاب معدنية) التي قد تكون سامة للخلايا. وعلى الرغم من هذه الميزة، الجسور الملح مرهقة للعمل مع، واستيم وهي إيصال تختلف عن التي تم تسليمها في النماذج الحية، مما يجعل من الصعب على الربط بين النتائج التي تم الحصول عليها عند استخدام هذين النظامين. الأجهزة التي تقدم إستيم عبر أقطاب معدنية أو الكربون ثابتة داخل الآبار ثقافة الخلية (كما استعرضها توباي هرنيك وكابلان6) أفضل محاكاة الأجهزة المستخدمة في فيفو؛ ومع ذلك، هذه الأجهزة صعبة لتنظيف/تعقيم بين الاستخدامات وعدد الخلايا التي يمكن دراستها بكل تجربة محدودة. لقد قمنا بتصميم قاعة إستيم المقدمة هنا على وجه التحديد لمعالجة أوجه القصور في هذه الأجهزة الأخرى. في حين كان معظم من تجربتنا باستخدام هذه الدائرة إستيم مع 2D والثقافات ثلاثية الأبعاد تحتوي على نخاع العظام والدهنية-الأنسجة-المستمدة من MSCs3،4، فائدة كبيرة من هذه الدائرة أن من تنوعاً ومع طفيفة نسبيا التغييرات، يمكن تكييفها لدراسة أنواع الخلايا الأخرى ضمن مجموعة متنوعة من الظروف المختلفة.
هنا يمكننا وصف بناء دائرة الثقافة الخلية إستيم؛ ثم، علينا أن نظهر استخدام MSCs معاملة مع أنظمة مختلفة من إستيم وقياس أثر على التمايز أوستيوجينيك. يتم تقييم التمايز osteogenic لجنة السلامة البحرية عن طريق ترسب الكالسيوم والنشاط الفوسفاتيز القلوية، وعلامة أوستيوجينيك التعبير الجيني. الأهم من ذلك، في الماضي التجارب التي تستخدم هذا الإعداد، لاحظنا أن تستمر هذه الآثار برو أوستيوجينيك بعد فترة طويلة من توقف العلاج إستيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تشييد قاعة الثقافة الخلية التحفيز الكهربائي
- لبناء قاعة إستيم، جمع أغطية اثنين من لوحات قياسية 6-جيدا خلية الثقافة؛ سلك البلاتين 99.99 ٪، 60 سم في طول قطرها من 0.5 – 1 مم؛ المغلفة بالفضة الأسلاك النحاسية، 70 سم في طول قطرها 0.6 مم؛ كماشة؛ مجموعة لحام الحديد؛ أنبوب واحد من الغراء فائقة التوصيل؛ سلك واحد محطة كتلة موصل، الست الصغيرة 2.2 "الخامس المصابيح" (اختياري)؛ أنبوب واحد من لاصق سيليكون ستانلس طلاء (اختياري)؛ لفة واحدة من الشريط الأسود العزل الكهربائي؛ المعيار، مرنة، معزول الأسلاك الكهربائية النحاسية (0.14 مم2)، 2 متر في الطول (جدول المواد).
- غطاء لوحة 6-جيدا، ومارك وثم حفر ثقوب اثنين (التي يبلغ قطرها ~ 1 مم)، الآبار 25 مم وبصرف النظر، قرب الحافة الخارجية لكل من الدول الست (12 ثقوب في المجموع)، كما هو مبين في الشكل 1 أ، ب.
- قطع اثنا عشر أطوال 5 سم من سلك البلاتين بكماشة. ينحني كل من الأسلاك يدوياً في شكل L ترك نهاية واحدة طولها 3 سم والآخر 2 سم. قطع الأسلاك المغلفة بفضي إلى اثنين أطوال 35 سم.
- إدراج نهاية سلك البلاتين واحدة بنت أطول (3 سم) (من الداخل الخارج) في كل حفر حفرة، ترك 1-2 مم بارزة من خارج الغطاء، وينحني باستخدام الملقط. تأمين أسلاك البلاتين في ثقوب الغطاء مع الغراء فائقة التوصيل وتركها لتجف لحوالي 6 ح.
- لحام النصائح من جميع أسلاك البلاتين الستة (التي سوف تكون بمثابة الزركونيم لاحقاً، انظر الشكل 1A) بارزة من الأغطية لواحد من الأسلاك المغلفة بالفضة. كرر الإجراء نفسه، لحام أسلاك البلاتين الستة المتبقية (بمثابة الأنودات فيما بعد) للأسلاك المغلفة بالفضة الأخرى.
- إضافة المصابيح في الدائرة بين كل ستة أزواج قطب البلاتين الكاثود اﻷنود، تأكيد وظيفة أثناء التجارب (اختياري). ضع قطعة من الشريط العازل الأسود تحت كل أدى إلى الحيلولة دون تعريض الخلايا في لوحات الثقافة على ضوء الصمام (الشكل 1).
- الصق رابط محطة كتلة الأسلاك إلى الركن الأيسر العلوي من الغطاء لوحة 6-جيدا وقم بتوصيل كل الأسلاك المغلفة بالفضة طرفيات الإدخال، كما هو مبين في الشكل 1.
- قطع مقطع 20 ملم × 20 ملم من الركن الأيسر العلوي من غطاء لوحة 6-البئر الثانية (الشكل 1B، غطاء Nr. 2) لاستيعاب محطة كتلة الموصل الموجود على غطاء الأولى. تغطي غطاء الأولى، مزودة بأقطاب كهربائية، مع غطاء الثاني والشريط لهم جنبا إلى جنب مع شريط لاصق.
- تحسين الرابطة للأغطية اثنين، استخدام لاصق سيليكون الطلاء (اختياري). للقيام بذلك، تغطي الغطاء مع أقطاب الفضة بطبقة 3 – 5 مم من لاصق السيليكون وتغطية ذلك مع غطاء الأخرى، تسمح ح 12 لمادة لاصقة لتجف.
- الاتصال واحدة من نهاية الأسلاك النحاسية المعزولة القياسية هما المحطات إخراج سلك موصل والغايات الأخرى للموز موصلات الذكور (4 ملم).
ملاحظة: يتوقف طول هذه الأسلاك على المسافة من على الرف في الحاضنة، حيث سيتم الاحتفاظ الخلايا، للإمداد بالطاقة، خارج الحاضنة (الشكل 1). - ضبط الجرعة (الجهد) ونظام إستيم تسليمها إلى الخلايا عن طريق تنظيم العاصمة إمدادات الطاقة.
- قم بتشغيل إمدادات الطاقة عن طريق الضغط على زر ON/OFF على اللوحة الأمامية. تنشيط قناة 1 بالضغط على زر 1.
- اضغط على الزر رقم 4 (الخامس-مجموعة) تعيين الجهد. اضغط أزرار 2، . و 5 لتعيين الإخراج التحميل في 2.5 ف اضغط Enter.
- التأكد من أن مخرجات تحميل 2.5 الخامس (2,500 أم) يناظر إستيم أم 100/مم، وفقا للمعادلة التالية ومبسطة.
V إستيم =
؛ أو
V = Vإستيم × د
هنا، V = الجهد إمدادات طاقة الإنتاج في بالميليفولت؛ d = المسافة بين أقطاب في ملليمتر؛ V إستيم = الجهد التحفيز في بالميليفولت كل ملليمتر.
ملاحظة: يطبق هذا التبسيط فقط في حالة الجهد المستمر DC. المقاومة بين المتوسط والخلايا لا يكاد أقطاب ليست على اتصال مباشر مع الخلايا؛ بدلاً من ذلك، يتم تسليم إستيم إلى الخلايا من خلال الوسيلة.
؛ أو2-الوسيطة من الخلايا الجذعية الثقافة في المتوسط أوستيوجينيك
- شراء وتخزين MSCs الفئران المتاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد) في النتروجين السائل حتى اليوم من هذه التجربة. وبدلاً من ذلك، عزل MSCs من الحيوانات الأخرى وفقا للبروتوكولات نشرت في مكان آخر7،8 وفقا للأنظمة المؤسسية المحلية للاستخدام الحيوانات التجريبية.
- في يوم التجربة، إزالة قنينة واحدة (1 × 106 خلايا) من MSCs من تخزين النيتروجين السائل، والذوبان بسرعة (في حدود 1 دقيقة) الخلايا في حمام مائي يسخن إلى 37 درجة مئوية.
- تحت ظروف معقمة في غطاء الاندفاق الصفحي، "الماصة؛" محتوى القنينة في أنبوب فالكون 50 مل وإضافة 9 مل متوسط العادي (NM) بريوارميد إلى 37 درجة مئوية، تتكون من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم; 1 x) مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) و 1% البنسلين/ستربتوميسين الحل. بيليه الخلايا لمدة 5 دقائق باستخدام الطرد المركزي في 300 x ز.
- في غطاء الاندفاق الصفحي، إزالة المادة طافية وعناية ريسوسبيند بيليه الخلية في 12 مل من شمال البحر الأبيض المتوسط بريوارميد إلى 37 درجة مئوية. نقل الخلايا ريسوسبينديد إلى قارورة ثقافة الخليوي T-75.
- ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، 5% O2 حتى بلوغهم التقاء 80%-90% (بعد حوالي 3-5 أيام).
- مرور الخلايا.
ملاحظة: إجراء كافة العمليات باستثناء الطرد المركزي والحضانة تحت ظروف معقمة في غطاء الاندفاق الصفحي.- وبعد التوصل التقاء 80%-90%، استرداد الخلايا مع الخلايا مفرزة الحل. نضح مستنبت الخلية وتغسل x 2 مع 1 x مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) وإضافة 5 مل 1 × الخلية المفرزة الحل والعودة الخلايا للحاضنة لمدة 5 دقائق.
- متى يتم فصل الخلايا، إضافة مبلغ مساو من الثقافة المتوسطة لإلغاء تنشيط الحل مفرزة. جمع الخلايا في أنبوب فالكون 50 مل وتدور لهم في 300 x غ لمدة 5 دقائق.
- تجاهل على المديين المتوسط وريسوسبيند الخلايا في 1 مل متوسط الطبيعي الطازج. تقييم عدد الخلايا قادرة على البقاء مع وصمة عار تريبان الأزرق.
- البذور 1 × 106 خلايا في قارورة T-75 جديدة مع 12 مل من بريوارميد شمال البحر الأبيض المتوسط. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، 5% O2 حتى بلوغهم التقاء 80%-90%.
ملاحظة: الخلية باساجينج (2.4.1–2.4.4 الخطوات) يمكن تكرارها عدة مرات حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من الخلايا. لا تستخدم الخلايا الأقدم من مرور 8.
- بذور 9 × 104 خلايا في 3 مل من شمال البحر الأبيض المتوسط (إبطال الحرارة 10% الجنين المصل البقري، 1% البنسلين/ستربتوميسين، دميم) في كل من لوحة الثقافة 6-جيدا جيدا. احتضان الخلايا لمدة يوم واحد في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، 5% O2.
- وفي اليوم التالي نضح المتوسطة الثقافة وتطبيق 3 مل من التمايز osteogenic المتوسطة (OM؛ المتوسطة العادية وتستكمل مع 10 الديكساميتازون-7 م و 10 مم β-جليسيروفوسفاتي و 0.05 ملم حمض الأسكوربيك-2-الفوسفات).
- ضع لوحة 6-جيدا مع الخلايا في الحاضنة واحتضان في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، 5% O2 بين عشية وضحاها.
3-علاج MSCs مع إستيم
- اليوم الخلايا تعامل مع إستيم، تعقيم أقطاب كهربائية في الحل الإيثانول 70% لمدة 30 دقيقة؛ ثم تجفيفها تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في مجلس الوزراء 30 دقيقة إضافية لسلامة.
- في غطاء الاندفاق الصفحي، تغطي لوحة 6-البئر الذي يحتوي على MSCs مثقف مع غطاء مزودة بأقطاب كهربائية، مع التأكد من أن أقطاب كهربائية مغمورة تماما في المتوسط (إذا لزم الأمر، أضف المتوسطة). نقل لوحة 6-بئر مغطاة (غرفة إستيم) مع الخلايا للحاضنة وتتصل أسلاك التيار الكهربائي.
- تحميل إخراج مجموعة الإمداد بالطاقة إلى 2.5 الخامس وعلاج الخلايا مع إستيم ح 13،9.
- بعد التحفيز، وقطع إمدادات الطاقة وإزالة الدائرة إستيم من الحاضنة. تحت ظروف معقمة، تبادل غطاء مزودة بأقطاب مع غطاء قياسية لوحة 6-جيدا.
- عودة الخلايا للحاضنة وتركهم بين عشية وضحاها. تنظيف أقطاب كهربائية، مع برنامج تلفزيوني أولاً ثم مع الحل الإيثانول 70%. تنظيف المنتجات الصدأ المتراكم من سطح القطب مع الصنفرة غرامة.
- كرر الخطوات من 3، 1-3.5 لمدة 6 أيام متتالية. في يوم 4، قبل تطبيق إستيم وتحت ظروف معقمة، تغيير الثقافة المتوسطة يسفط 1.5 مل متوسطة والاستعاضة عنه ب 1.5 مل OM. الطازج بريوارميد
- بعد تطبيق إستيم لمدة 7 أيام متتالية، الحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة 7 يوما إضافيا، تبادل المتوسطة كل 3 – 4 أيام.
4-قياسات التمايز أوستيوجينيك
- تحليل التغيرات مورفولوجيا الخلايا تحت مجهر.
- لتقييم تأثير إستيم على التمايز osteogenic لجنة السلامة البحرية وقياس ترسب الكالسيوم والنشاط الفوسفاتيز القلوية وعلامة أوستيوجينيك التعبير الجيني، كما وصفت في مكان آخر3،9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم تأثير 100 mV/مم من إستيم على التفريق بين osteogenic MSCs، الخلايا تعامل مع إستيم 3، 7، و 14 يوما أو نونتريتيد (مراقبة) حللت في يوم 14 من استزراع بتقييم التغييرات الشكلية وترسب الكالسيوم (الشكل 2 ). وقد تم ذلك بتصوير الخلايا باستخدام مشرق الميدان مجهرية (تغيرات مورفولوجية) أو بتحديد الخلايا في حل بارافورمالدهيد 4% وتلطيخ لهم مع الحل الأليزارين الأحمر 0.02 في المائة ثم التصوير لهم استخدام مشرق الميدان مجهرية (ترسب الكالسيوم تحليل).
وأجرى تحليلاً مفصلاً للتغييرات التعبير الجيني osteogenic ماركر في أيام 3 و 7 و 14 من تثقيف (الشكل 3). وقد تم ذلك بقياس التعبير النسبي للجينات RunX2و الكولاجين أنا، أوستيوبونتين، و أستر عن طريق الرايت قبكر ودلتا مقارنة الأسلوب Ct (عتبة دورة القيم)10، حيث واستخدمت الجينات التدبير المنزلي Rplp1 و ايواز11 للتطبيع.
تعريض MSCs إلى 100 mV/مم من إستيم لمدة 3 أيام (ح 1 في اليوم الواحد) لم يكن لها تأثير؛ ومع ذلك، 7 أيام تعرض أسفرت عن زيادة في التفريق بين أوستيوجينيك، حسبما تقرره مورفولوجيا التغييرات (الشكل 2 أ-ج) وترسب الكالسيوم (الشكل 2E– G) وعلامة osteogenic الجينات التعبير التغييرات ( الرقم 3) بالمقارنة مع عنصر تحكم وقت المطابقة دون إستيم. التعرض المطول إستيم (14 يوما) لا تعزز كذلك التفريق بين أوستيوجينيك إلى أبعد من ذلك وينظر بعد 7 أيام علاج (الشكل 2D، ح و الشكل 3).
كما هو مبين في الشكل 2، الخلايا تعامل مع إستيم 7 و 14 يوما ظهرت مكثف أكثر (الشكل 2، د) من تلك التي تعامل مع إستيم لمدة 3 أيام أو خلايا نونتريتيد (الشكل 2 أ، ب) وأظهر زيادة الكالسيوم الترسيب (الشكل 2، ح) مقارنة بتلك التي تعامل فقط 3 أيام أو عناصر تحكم نونتريتيد (الشكل 2Eوو). وأكد تحليل التعبير علامة أوستيوجينيك في أيام 3 و 7 و 14 من استزراع المفاضلة osteogenic المعززة في الخلايا تعامل مع إستيم لمدة 7 و 14 يوما (الشكل 3). التعبير عن علامة osteogenic المتصلة بالتمييز بين الجينات12RunX2و الكولاجين أناو أوستيوبونتينو أستر كانت أعلى في الخلايا تعامل مع إستيم لمدة 7 أيام.
رقم 1: دائرة الثقافة الخلية إستيم. (أ) الدائرة الكهربائية الرسم التخطيطي الدائرة إستيم تبين الأنودات الزركونيم (أسود)، (أحمر)، والمصابيح متصلة بالعاصمة إمدادات الطاقة. (ب) صورة ملحوظة 6-جيدا لوحة الأغطية واقطاب البلاتين على شكل L (منظر من أسفل) أدرجت في غطاء لوحة 6-جيدا. (ج) "تجميع إستيم" الدائرة (عرض أعلى) مع سلك موصل، والمصابيح، والشريط العزل الكهربائي التي تقي الخلايا من الصمام الخفيفة (الأسهم). خلية إستيم (د) إعداد العلاج مع الدائرة إستيم في الحاضنة متصلة بالعاصمة إمدادات الطاقة، في الخارج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تأثير إستيم على ماجستير علم التشكل والكالسيوم ترسب. الخلايا osteogenic الثقافة المتوسطة، مكشوف ولم يتعرض (عناصر التحكم) إلى 100 mV/مم من إستيم ل 3، 7 و 14 يوما (ح 1/يوم). (أ-د) مورفولوجيا و (ه–ح) ترسب الكالسيوم (تلطيخ الأليزارين الأحمر) في اليوم 14 من استزراع. تغييرات هامة في الخلية مورفولوجيا والكالسيوم الودائع كانت واضحة في الخلايا تعامل مع إستيم (ج وز) 7 و (دال و حاء) 14 يوما (10 x التكبير; شريط المقياس = 200 ميكرومتر). تم تعديل هذا الرقم من محمد اليوسف ايشين et al. 9- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: "تأثير إستيم" على التعبير الجيني علامة osteogenic MSC. التعبير الجيني أوستيوجينيك ماركر (تقاس مع الرايت قبكر في أيام 3 و 7 و 14 من استزراع) في الخلايا تعامل مع إستيم لأيام 3 و 7 و 14، أو نونترياتيد. (أ) في اليوم السابع من استزراع عبارة RunX2 كان أعلى بكثير في الخلايا تعامل مع إستيم لمدة 7 أيام. (ب) ColIa1 التعبير كان أعلى بكثير في العلاج لمدة 7 أيام، يقاس في اليوم 14 من استزراع الخلايا. (ج) التعبير عن Osteopontin ارتفع في الخلايا المعالجة إستيم في أيام 3 و 7 و 14 من استزراع. (د) أوستيريكس التعبير كان غائبا في السيطرة على خلايا في كل وقت النقاط وكان ينظر فقط في 7 و 14 يوما للثقافة في الخلايا المعرضة إستيم. وتشير إلى رسائل مختلفة على الأشرطة كبيرة (ف < 0.05) الفروق بين المجموعات في نفس الوقت نقطة. يشير إلى العلامة النجمية كبيرة (ف < 0.05) الاختلافات بين النقاط الزمنية ضمن نفس المجموعة. تم تعديل هذا الرقم من محمد اليوسف ايشين et al.9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يصف لنا بناء غرفة وأسلوب لعلاج الخلايا الجذعية الوسيطة مع إستيم التي ينتج عنها تعزيز التمايز أوستيوجينيك.
الإعداد إستيم قدم لا تتطلب معدات خاصة والمعرفة، ويمكن أن يؤديها الباحثين المبتدئين في مختبر علم الأحياء/الكيمياء حيوية لخلايا الجذعية قياسية. ومع ذلك، عند بناء واستخدام قاعة إستيم، يجب إيلاء عناية خاصة في بضع خطوات حاسمة. عند التعامل مع أقطاب البلاتين، يجب اتخاذ المزيد من الحيطة كما هذا المعدن طيع وحساسة للغاية. وفي حين يمكن استخدام معادن أخرى مثل الفولاذ أو التنغستن،، هذه لا ينصح كما أنها عرضه للتآكل، التي يمكن أن تكون سامة للخلايا13. أيضا، يجب أن يتم تنظيف تعقيم الغطاء مع الأقطاب بالضبط كما هو موضح في البروتوكول حيث تم اختباره مرارا وتكرارا هذا الأسلوب ووجد أن تكون فعالة في القضاء على مشاكل التلوث. أخيرا، في حين يمكن أن تستخدم هذه القاعة لدراسة أخرى أنشطة الخلية الحساسة إستيم مثل الهجرة14،15، والانتشار، والمبرمج16، غشاء الخلية الفولتية17، وسقالة التصاق19، بروتوكول إستيم يصف لنا هنا (100 mV/مم، 1 ساعة في اليوم، 7 أيام) ركزت فقط على التمايز أوستيوجينيك في الفئران ينبغي إيلاء اهتمام خاص MSCs. إذا كان أعلى الفولتية (mV إيه وان فايف زيرو/مم) و/أو مدد أطول من إستيم (> ح 4 – 5) يتم تطبيقها منذ المنتجات السامة للخلايا الناتجة عن التحليل الكهربائي يمكن أن تتراكم في الأجل المتوسط. وفي هذه الحالة، المتوسط يجب أن تكون بعناية رصد وتبادل تبعاً لذلك. لدراسة البارامترات الأخرى و/أو أنواع الخلايا والظروف الأخرى، فإننا نوصي أن فصل الجرعة (الجهد) وإجراء دراسات لمعايرة نظام يمكن أن تؤثر هذه التغييرات على كيفية استجابة الخلايا إستيم.
خلل ممكن في دائرة إستيم يمكن أن يكون سبب فواصل في الدوائر الكهربائية بعد الاستخدام المتكرر، ويمكن رصدها عبر مصابيح LED المضافة. في حالة الكسر (رد نونيلوميناتيد LED light[s])، الغطاء يمكن إزالتها وتفكيكها بسهولة لتحديد وإصلاح الفاصل. وبالإضافة إلى ذلك، تصميم بسيط في دائرة إستيم يجعل من السهل لتعديله وفقا لاحتياجات الأجهزة التجريبية المختلفة، وأساليب التحليل. وتشمل الأمثلة استخدام أحجام مختلفة من لوحات ثقافة الخلية، بالطول والمسافة بين أقطاب أو إضافة شروط مختلفة الثقافة (3D) مع مواد السيراميك سقالة4 أو الركازات موصلة18، مختلفة ببساطة من مجرد وضع هذه المواد المصنفة مع الخلايا بين الأقطاب.
كما هو الحال في جميع التجارب في المختبر، وسلوكيات الخلية ووظائف لاحظ/المستحث في قاعة إستيم غير قابلة دائماً مباشرة إلى في النماذج الحية. وبناء على ذلك، عند تفسير السلوكيات/وظائف الخلية الناجمة عن إستيم في الدائرة، الباحثين ويجب دائماً تأخذ ذلك في الاعتبار.
الإعداد والطريقة المعروضة هنا بالعديد من المزايا على الأساليب الأخرى في المختبر للكشف عن خلايا إستيم (نظم مع الجسور الملح5 ) ونظم مع الأقطاب في خلية ثقافة ويلز19. ميزة هامة من النظام المذكور هنا أنه، نظراً للخلايا تستزرع في معيار 6-جيدا لوحات، يمكن استخدامها بعد العلاج إستيم في البروتوكولات الأخرى في الحية أو في المختبر. وباﻹضافة إلى ذلك، حقيقة أن أقطاب ثابتة على غطاء لوحة 6-جيدا يجعل من السهل لتنظيف وتعقيم الجهاز بين التجارب وإعادة استخدامها. وأخيراً، يوفر القدرة على تحفيز الخلايا في ستة آبار في نفس الوقت مادة وافرة للتحليل وإمكانية تكرار نتائج.
للحصول على فهم أفضل لآليات على مستوى الغشاء الخلوي الذي يؤثر إستيم أنشطة الخلية في الدراسات الجارية باستخدام الدائرة المذكورة هنا، أننا ندرس العلاقة بين تسليم خارجياً إستيم وغشاء الخلية المحتملة (Vmem)17. وبالإضافة إلى ذلك، استناداً إلى السابقة نتائج9، دراسات في المستقبل، ونحن سوف بريتريت الخلايا مع إستيم في الدائرة، وحدها مع السقالات 3D مختلفة ومن ركائز موصلة، لتحفيز وظائف الخلية المحددة؛ ثم أننا سوف زرع لهم في نماذج حيوانية لتحديد إذا كان يحتفظون بمهام تعزيز الملاحظة المجراة. هذه الدراسات سوف تسهم المجموعة المتنامية من المعلومات عن الآليات التي إستيم التي تنظم وظيفة الخلية، وفي القيام بذلك، يمكن أن تسهم في الاستفادة المثلى من الخلية نهج العلاج في الطب التجديدي، والمستندة إلى هندسة الأنسجة العلاجات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل جزئيا بمنحه بدء مؤسسة AO (ح ق-14-03) ومؤسسة فريدريتششيم (فريدريتششيم Stiftung) مقره في فرانكفورت، ألمانيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
