Summary
Her præsenterer vi en protokol til opførelse af en celle kultur kammer designet til at eksponere celler til forskellige typer af elektrisk stimulation og dets anvendelse i behandling af mesenkymale stamceller for at forbedre osteogenic differentiering.
Abstract
Mesenkymale stamceller/stromale celler (MSCs) er blevet brugt flittigt til at fremme knogleheling i tissue engineering tilgange. Elektrisk stimulation (EStim) har påvist at øge MSC osteogenic differentiering in vitro- og fremme knogle heling i klinisk indstillinger. Beskriver her vi opførelsen af en EStim celle kultur kammeret og dets anvendelse i behandling af rotte knogle-marv-afledte MSC til at forbedre osteogenic differentiering. Vi fandt, at behandling af MSCs med EStim til 7 dage resulterer i en betydelig stigning i den osteogenic differentiering, og vigtigst, denne pro-osteogenic effekt fortsætter længe efter (7 dage) EStim afbrydes. Denne tilgang af forbehandling MSCs med EStim til at forbedre osteogenic differentiering kunne bruges til at optimere knoglevæv engineering behandlingsresultater og således hjælpe dem med at opnå deres fulde terapeutiske potentiale. Ud over dette program, kan denne EStim celle kultur kammer og protokollen også bruges til at undersøge andre EStim-følsomme celle adfærd, såsom migration, spredning, apoptose og stillads vedhæftet fil.
Introduction
En forøgelse af traumer og/eller sygdom-induceret knogledefekter bliver behandlet ved hjælp af forskellige kombinationer af celleterapi og regenerativ medicin teknologier. MSC'er er celle valg i sådanne behandlinger, på grund af deres relativt høje osteogenic aktivitet, isolation og ekspansion effektivitet og sikkerhed1. For at maksimere deres osteogenic aktivitet, og dermed optimere deres terapeutiske effektivitet, der er indført flere metoder til at manipulere MSCs forud for deres anvendelse i disse behandlinger (som anmelder af Mauney et al.2). En sådan metode er EStim, som har vist sig at forbedre MSC osteogenic differentiering i vitro3 og fremme knogle heling in vivo4. Trods det stigende antal undersøgelser med fokus på behandling af MSCs med EStim, endnu en optimal regime til at maksimere Estim's pro-osteogenic effekt ikke defineres.
Andre in vitro-metoder, EStim udnytte salt broer neddykket i substratet, som adskiller celler fra metallisk elektroder5. Fordelen ved dette er, at levere EStim gennem salt broer eliminerer indførelsen af kemiske biprodukter (fx, korrosion i metalliske elektroder) der kan være cytotoksiske. Trods denne fordel, salt broer er besværlige at arbejde med og EStim de levere adskiller sig fra de leverede i in vivo modeller, hvilket gør det vanskeligt at korrelere resultater, der opnås ved brug af de to systemer. Opsætninger, der leverer EStim via metalliske eller carbon elektroder fast inde i celle kultur wells simulere (som anmelder af Hronik-Tupaj og Kaplan6) bedre enheder, der bruges i vivo; men disse enheder er vanskelige at rengøre/sterilisere mellem bruger og antallet af celler, der kan studeres pr. eksperiment er begrænset. Vi designede EStim salen præsenteres her specifikt for at løse begrænsningerne af disse andre opsætninger. Mens de fleste af vores erfaring med at bruge denne EStim afdeling har været med 2D og 3D kulturer indeholdende knoglemarv - og fedtholdigt-væv-afledt MSCs3,4, en stor fordel af salen er der det er alsidig, og med mindre relativt ændringer, kan tilpasses til at studere andre celletyper under en række forskellige betingelser.
Her beskriver vi opførelsen af en EStim celle kultur kammer; derefter, vi demonstrere brugen af behandling af MSCs med forskellige regimer EStim og måle den resulterende virkning på osteogenic differentiering. MSC osteogenic differentiering er vurderet via calcium deposition, alkalisk fosfataseaktivitet og osteogenic markør genekspression. Vigtigere, konstaterede i tidligere eksperimenter, bruges denne opsætning, vi, at disse pro-osteogenic virkninger persistere længe efter EStim behandlingen blev afbrudt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opførelse af elektrisk stimulation celle kultur kammer
- For at opbygge EStim kammer, indsamle to låg af standard 6-godt celle kultur plader; 99,99% platin wire, 60 cm i længden med en diameter på 0,5-1 mm; sølv-belagte kobbertråd, 70 cm i længden med en diameter på 0,6 mm; Cutting tænger; loddekolbe sæt; et rør af superledende lim; én ledning klemmerække stik, seks små 2,2 V lysdioder (valgfri); en tube af noncorrosive silikone klæbemiddel belægning (valgfri); en rulle sorte elektriske isoleringstape; standard, bøjelige, isolerede kobber elektriske ledninger (0,14 mm2), 2 m i længde (tabel af materialer).
- I en 6-godt plade låg, mark og derefter boret to huller (med en diameter på ~ 1 mm) wells 25 mm fra hinanden, nær den ydre kant af hver af seks (12 huller i alt), som vist i figur 1A, B.
- Skær 12 5 cm længder af platin tråd med opskæring tænger. Bøje hver af ledningerne manuelt i en L-form, forlader ene ende 3 cm lang og de andre 2 cm. skær af sølv-belagt ledning i to 35 cm længder.
- Indsæt den længere (3 cm) bøjede ende af en platin tråd (fra indersiden til ud) i hver boret hul, forlader 1 – 2 mm fremspringende fra ydersiden af låget, bøje det med pincet. Sikre platin ledningerne i låget huller med superledende lim og lade det tørre i omkring 6 h.
- Lodde tips af alle seks platin ledninger, (det vil senere fungere som katoder, se figur 1A) fremspringende fra låg til en af sølv-belagt tråde. Gentag den samme procedure, lodning de resterende seks platin ledninger, (som senere vil tjene som anoder) til andre Sølv-belagt tråd.
- Tilføje lysdioder i kredsløb mellem hver af seks anode-katode platin elektrode par, at bekræfte funktionalitet under eksperimenter (valgfrit). Placer et stykke sort isoleringstape under hver førte til forhindre afsløre celler i kultur plader til LED lys (figur 1 c).
- Lime wire klemmerække stik til det øverste venstre hjørne af 6-godt plade låget og forbinde begge sølv-belagte ledninger til indgangsterminal, som vist i figur 1 c.
- Skære en 20 mm x 20 mm sektion fra øverste venstre hjørne af en anden 6-godt plade låg (figur 1B, låg Nr. 2) til at rumme klemmerække stik på den første låg. Dække de første låg, udstyret med elektroder, med den anden låg og tape dem sammen med dobbeltklæbende tape.
- For at forbedre limning af to låg, bruge silikone klæbemiddel belægning (ekstraudstyr). At gøre det, dække låg med sølv elektroderne med en 3-5 mm lag af silikone lim og dække det med andre låget, så 12 h for limen tørrer.
- Tilslut den ene ende af de to standard isolerede kobber ledninger til output terminalerne af wire-stik og anden ende til banan hanstik (4 mm).
Bemærk: Længden af disse ledninger afhænger af afstanden fra hylden i rugemaskinen, hvor cellerne vil blive holdt, til strømforsyningen udenfor inkubator (fig. 1 d). - Justere dosering (spænding) og regime for EStim leveret til cellerne ved at regulere DC strømforsyning.
- Tænd strømforsyningen ved at trykke på ON/OFF -knappen på frontpanelet. Aktivere kanal 1 ved at trykke på knappen 1.
- Tryk på knap Nr. 4 (V-sæt) til at indstille spændingen. Tryk på knapperne 2, . og 5 for at indstille belastning output på 2,5 V. Tryk på Enter.
- Sikre, at belastningen output på 2,5 V (2.500 mV) svarer til en EStim 100 mV/mm, efter følgende, forenklet ligning.
V EStim =
; eller
V = VEStim × d
Her, V = forsyningsspændingen output i millivolt; d = afstanden mellem elektroderne i millimeter; V EStim = stimulation spændingen i millivolt pr. millimeter.
Bemærk: Denne forenkling gælder kun i tilfælde af konstant DC spænding. Modstand mellem medium og cellerne er ubetydelig, da elektroderne ikke er i direkte kontakt med cellerne; i stedet er EStim leveret til celler gennem mediet.
; eller2. mesenkymale stamceller kultur i osteogenic medium
- Købe og gemme kommercielt tilgængelige rotte MSCs (Se Tabel af materialer) i flydende nitrogen indtil dagen af forsøget. Alternativt kan du offentliggjort isolere MSCs fra andre dyr ifølge protokoller andetsteds7,8 i overensstemmelse med lokale institutionelle regler for brugen af forsøgsdyr.
- På dagen for eksperimentet, fjerne et hætteglas (1 x 106 celler) med MSCs udlagringsdatoen flydende kvælstof, og hurtigt (inden for 1 min) tø celler i et bad med vand forvarmet til 37 ° C.
- Under sterile forhold i en laminar flow hætte, hætteglas indhold der afpipetteres i en 50 mL falcon tube og tilføje 9 mL af normale medium (NM) forvarmet til 37 ° C, bestående af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM; 1 x) med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin løsning. Sammenpresse cellerne i 5 min ved centrifugering ved 300 x g.
- I en laminar flow hætte, Fjern supernatanten og omhyggeligt resuspenderes celle i 12 mL af NM forvarmet til 37 ° C. Overføre de resuspenderede celler til en T-75 celle kultur kolbe.
- Kultur cellerne ved 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 , indtil de når en 80% – 90% sammenløbet (efter ca 3-5 dage).
- Passage af celler.
Bemærk: Udføre alle operationer undtagen centrifugering og inkubering under sterile forhold i en laminar flow hætte.- Efter at have nået en 80-90% sammenløb, hente celler med celle detachement løsning. Opsug cellekulturmedium, vask 2 x med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS), der tilsættes 5 mL af 1 x celle detachement løsning og returnere cellerne til inkubator i 5 min.
- Når cellerne er frakoblet, tilføje en lige stor del af dyrkningsmediet til at inaktivere de udstationerede løsning. Indsamle cellerne i et 50 mL falcon rør og spin dem ved 300 x g i 5 min.
- Kassér mediet og resuspend celler i 1 mL frisk normale medium. Vurdere antallet af levedygtige celler med trypan blå plet.
- Frø 1 x 106 celler i en ny T-75 kolben med 12 mL af forvarmet NM. Kultur cellerne ved 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 , indtil de når en 80% – 90% sammenløb.
Bemærk: Celle passaging (trin 2.4.1–2.4.4) kan gentages med et par gange, indtil det nødvendige antal celler er opnået. Brug ikke celler ældre end passage 8.
- Frø 9 x 104 celler i 3 mL af NM (10% varme-inaktiverede føtal bovint serum, 1% penicillin/streptomycin, DMEM) i hver brønd med en 6-godt kultur plade. Inkuber cellerne i 1 dag på 37 ° C, 5% CO2, 5% O2.
- Den næste dag, Aspirér næringssubstratet og anvende 3 mL af osteogenic differentiering medium (OM; normale medium suppleret med 10-7 M dexamethason, 10 mM β-glycerophosphate og 0,05 mM ascorbinsyre-2-fosfat).
- 6-godt plade med celler i rugemaskinen og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 natten over.
3. behandling af MSCs med EStim
- Den dag cellerne behandles med EStim, sterilisere elektroder i 70% ethanol løsning til 30 min. derefter tørre dem under UV-lys i en sikkerhed fryser i en yderligere 30 min.
- I en laminar flow hætte, dækker 6-godt pladen som indeholder de kulturperler MSCs med låg udstyret med elektroder, og sørg for, at elektroderne er helt nedsænket i medium (om nødvendigt tilføje medium). Overføre den dækkede 6-godt plade (EStim kammer) med celler til rugemaskine og dens ledninger tilsluttes strømforsyningen.
- Sæt strømforsyningen til 2,5 V belastning output og behandle celler med EStim til 1 h3,9.
- Efter stimulation, Frakobl strømforsyningen og fjerne EStim salen fra rugemaskinen. Under sterile forhold, udveksle låget udstyret med elektroder med standard 6-godt plade låg.
- Returnere cellerne til rugemaskine og forlader dem natten over. Ren elektroder, først med PBS og derefter med 70% ethanol løsning. Ren de akkumulerede korrosion produkter fra elektrode overfladen med fint sandpapir.
- Gentag trin 3.1-3.5 for 6 på hinanden følgende dage. Dag 4, før EStim og under sterile forhold, ændre dyrkningsmediet ved sugning 1,5 mL medium og erstatte det med 1,5 mL af forvarmet frisk OM.
- Efter anvender EStim i 7 dage i træk, opretholde cellerne i kultur for yderligere 7 dage, udveksling medium hver 3-4 dage.
4. osteogenic differentiering målinger
- Analysere celle morfologi ændringer under et mikroskop.
- For at vurdere effekten af EStim på MSC osteogenic differentiering, foranstaltningen calcium deposition, alkalisk fosfataseaktivitet og osteogenic markør genekspression, som beskrevet andetsteds3,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at evaluere effekten af 100 mV/mm af EStim på osteogenic differentiering af MSC'er, celler behandles med EStim for 3, blev 7 og 14 dage eller nontreated (kontrol) analyseret på dag 14 i dyrkning af vurderingen af morfologiske ændringer og calcium deposition (figur 2 ). Dette blev gjort ved imaging celler ved hjælp af-lysfelt mikroskopi (morfologi ændringer) eller ved fastsættelse af celler i 4% PARAFORMALDEHYD løsning, farvning dem med 0,02% alizarin rød løsning og derefter imaging dem ved hjælp af-lysfelt mikroskopi (calcium deposition analyse).
En detaljeret analyse af osteogenic markør gen expression ændringer blev udført på dage 3, 7 og 14 i dyrkningsbaserede (figur 3). Dette blev gjort ved at måle den relative udtryk for gener RunX2 kollagen jeg, Osteopontinog Osterix ved hjælp af RT-qPCR og sammenlignende delta Ct (tærskelværdier cyklus) metode10, hvor husholdning gener Rplp1 og Ywhaz11 blev brugt til normalisering.
Udsætter MSC'er til 100 mV/mm for EStim til 3 dage (1 h per dag) havde ingen effekt; dog resulterede 7 dage efter eksponering i en stigning i osteogenic differentiering, som bestemt af morfologi ændringer (figur 2A-C), calcium deposition (figur 2E-G) og osteogenic markør gen expression ændringer ( Figur 3) i forhold til en tid-matchede kontrol uden EStim. Langvarig EStim eksponering (14 dage) ikke yderligere styrke den osteogenic differentiering ud over der ses efter 7 dages behandling (figur 2DH og figur 3).
Som vist i figur 2, celler behandles med EStim til 7 og 14 dage syntes mere kondenseret (figur 2 cD) end dem, der behandles med EStim til 3 dage eller nontreated celler (figur 2AB) og viste en øget calcium deposition (figur 2 gH) i forhold til dem behandles for kun 3 dage eller nontreated kontrolelementer ()figur 2EF). Analyse af osteogenic markør udtrykket på 3, 7 og 14 dage for dyrkning bekræftet den forbedrede osteogenic differentiering i celler behandles med EStim til 7 og 14 dage (figur 3). Den udtryk for osteogenic-differentiering-relaterede markør gener12RunX2 kollagen jeg, Osteopontinog Osterix var det højeste i celler behandles med EStim til 7 dage.
Figur 1: EStim celle kultur afdeling. (A) elektrisk Ledningsdiagram for EStim afdeling viser anoder (sort), katoder (rød), og lysdioder tilsluttet DC strømforsyning. (B) billedet af den markerede 6-godt plade låg og L-formede platin elektroder (underside) indarbejdet i 6-godt plade låget. (C) samlet EStim kammer (ovenfra) wire-stik, lysdioder og elektriske isoleringstape, som beskytter cellerne fra LED lys (pile). (D) EStim celle behandling setup med EStim kammer i rugemaskinen tilsluttet DC strømforsyning på ydersiden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: effekten af EStim på MSC morfologi og calcium deposition. Celler i osteogenic næringssubstrat, udsættes og ikke eksponerede (kontrol) til 100 mV/mm for EStim til 3, 7 og 14 dage (1 t/dag). (A-D) Morfologi og (E-H) calcium deposition (alizarin rød farvning) på dag 14 i dyrkning. Væsentlige ændringer i celle morfologi og calcium indskud var synlige i celler behandles med EStim (C og G) 7 og (D og H) 14 dage (10 x forstørrelse; skalalinjen = 200 µm). Dette tal blev ændret fra Eischen-Loges mfl. 9. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Effekt af EStim på MSC osteogenic markør genekspression. Osteogenic markør genekspression (målt med RT-qPCR på dage 3, 7 og 14 i dyrkning) i celler behandles med EStim for 3, 7 og 14 dage, eller nontreated. (A) på dag 7 i dyrkning, RunX2 udtryk var betydeligt højere i celler behandles med EStim til 7 dage. (B) ColIa1 udtryk var betydeligt højere i celler behandles i 7 dage, målt på dag 14 i dyrkning. (C) et udtryk for Osteopontin var steget betydeligt i EStim-behandlede celler på dage 3, 7 og 14 i dyrkning. (D) Osterix udtryk var fraværende i kontrol celler på alle tid point og blev set kun på 7 og 14 dage af kultur i celler udsat for EStim. Forskellige breve på stængerne viser signifikant (p < 0,05) forskelle mellem grupper på samme tid punkt. Stjernen angiver signifikant (p < 0,05) forskelle mellem tidspunkter inden for samme gruppe. Dette tal blev ændret fra Eischen-Loges et al.9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi opførelsen af et kammer og en metode til behandling af mesenkymale stamceller med EStim, der resulterer i øget osteogenic differentiering.
Opsætningen EStim præsenteret kræver ikke specialviden udstyr og kan udføres i en standard stamcelle biologi/biokemi laboratorium af yngre forskere. Når bygge og bruge EStim kammer, skal særlig forsigtig træffes i et par kritiske trin. Når du håndterer platin elektroderne, skal ekstra pleje tages som dette metal er meget formbart og delikat. Mens andre metaller, såsom stål eller tungsten, kan bruges, er disse ikke anbefales som de er udsat for korrosion, som kan være cytotoksiske13. Også, rengøring/sterilisering låget med elektroderne skal udføres så præcist som beskrevet i protokollen, da denne metode er blevet testet igen og igen og fundet for at være effektiv i at eliminere problemer med forurening. Endelig, mens salen kunne bruges til at studere andre EStim-følsomme celle aktiviteter som migration14,15, spredning, apoptose16, cellemembranen spændinger17og stillads vedhæftning19, den EStim protokol vi beskrive her (100 mV/mm, 1 t/dag, 7 dage) fokuserede kun på osteogenic differentiering i rotte MSCs. særlig opmærksomhed bør gives, hvis højere spændinger (≥150 mV/mm) og/eller længere varighed af EStim (> 4-5 h) er anvendt siden cytotoksiske produkter som følge af elektrolyse kan ophobes i mediet. I dette tilfælde skal mediet nøje overvåges og udveksles i overensstemmelse hermed. For at studere andre parametre og/eller andre celletyper og betingelser, anbefales det, at adskille dosering (spænding) og regime titrering undersøgelser foretages da disse ændringer kan påvirke, hvordan celler reagerer på EStim.
Mulige forstyrrelse af EStim salen kan være på grund af pauser i den elektriske kredsløb efter gentagen brug og kan overvåges via de tilføjede LED lamper. I tilfælde af brud (anført af nonilluminated LED light[s]), låget kan fjernes og let skilles ad for at identificere og reparere pausen. Derudover gør EStim kammer enkle design det let at ændre det efter behov af forskellige eksperimentelle opsætninger og metoder til analyse. Eksempler omfatter brug af forskellige størrelser af celle kultur plader, ved simpelthen at variere længden af og afstanden mellem elektroderne eller tilføje forskellige (3D) dyrkningsbetingelser med keramiske stillads materiel4 eller ledende substrater18, af blot at placere disse materialer seedede med celler mellem elektroderne.
Som i alle in vitro-eksperimenter, celle adfærd og funktioner er observeret/induceret i EStim salen ikke altid direkte overføres til in vivo modeller. Derfor, når tolkning EStim-induceret celle adfærd/funktioner i salen, forskere skal altid tage hensyn.
Opsætning og præsenteret her-metoden har mange fordele i forhold til andre in vitro-metoder til at afsløre celler til EStim (systemer med salt broer5 ) og systemer med elektroder indarbejdet i celle kultur wells19. En vigtig fordel af systemet beskrevet her er, at da cellerne er kulturperler i standard 6-godt plader, de kan bruges efter EStim behandling i andre in vivo eller in vitro-protokoller. Derudover gør, at elektroderne er fast på låget af 6-godt pladen det let at rengøre og sterilisere enhed mellem eksperimenter og genbruge den. Endelig, evnen til at samtidig stimulere cellerne i seks brønde giver rigelig materiale til analyse og reproducerbarhed.
For at få en bedre forståelse af mekanismerne på det cellulære membran niveau som EStim påvirker celle aktiviteter i igangværende undersøgelser ved hjælp af salen beskrevet her, udforsker vi forholdet mellem eksternt leveret EStim og cellemembranen potentielle (Vmem)17. Derudover vil baseret på tidligere resultater9, i fremtidige undersøgelser, vi forbehandle celler med EStim i salen, alene og med forskellige 3D stilladser og ledende substrater, til at stimulere bestemte cellefunktioner; derefter vil vi implantat dem i dyremodeller for at afgøre, om de bevarer de observerede forbedrede funktioner in vivo. Disse undersøgelser vil bidrage til den voksende mængde af information om mekanismerne af hvilke EStim regulere cellefunktion og dermed kunne bidrage til at optimere celle terapi tilgange i regenerativ medicin og væv-ingeniør-baseret behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet i en del af en AO Foundation starttilskud (S-14-03 H) og Friedrichsheim-fonden (Stiftung Friedrichsheim) hjemsted i Frankfurt am Main, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
