Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Bau einer Zelle Kultur Kammer entwickelt, um Zellen zu verschiedenen Arten von elektrische Stimulation, und seine Verwendung bei der Behandlung von mesenchymalen Stammzellen zur Verbesserung der osteogene Differenzierung aufzudecken.
Abstract
Mesenchymale Stammzellen/Stromazellen Zellen (MSCs) wurden ausgiebig zur Förderung der Knochenheilung in Gewebetechnik Ansätze. Elektrostimulation (EStim) nachweislich zu erhöhen MSC osteogene Differenzierung in-vitro- und Förderung der Knochenheilung in klinischen Umgebungen. Hier beschreiben wir den Bau einer EStim Zelle Kultur Kammer und seine Verwendung bei der Behandlung von Ratte Bone-Marrow-derived MSC osteogene Differenzierung zu verbessern. Wir fanden, dass die Behandlung von MSCs mit EStim für 7 Tage führt zu einem deutlichen Anstieg der osteogene Differenzierung, und wichtig ist, diese Pro-osteogene Effekt bleibt lange nach (7 Tage) EStim eingestellt ist. Dieser Ansatz der Vorbehandlung MSCs mit EStim osteogene Differenzierung verbessern ließe sich Knochengewebe engineering Behandlungsergebnisse zu optimieren und so helfen ihnen, ihre volle therapeutische Potential zu erreichen. Neben dieser Anwendung dieser EStim Zelle Kultur Kammer und Protokoll auch einsetzbar, andere EStim-sensible Zelle Verhaltensweisen, z. B. Migration, Proliferation, Apoptose und Gerüst Anlage zu untersuchen.
Introduction
Zunahme/Trauma oder Krankheit-induzierte Knochendefekte sind mit unterschiedlichen Kombinationen der Zelltherapie und regenerative Medizin-Technologien behandelt werden. MSCs sind die Zelle der Auswahl in solche Behandlungen aufgrund ihrer relativ hohen knochenbildenden Aktivität, Isolierung und Ausbau Effizienz und Sicherheit1. Zur Maximierung ihrer knochenbildenden Aktivität und damit ihre therapeutische Wirksamkeit zu optimieren, wurden mehrere Methoden eingeführt, um MSCs vor ihrer Verwendung in diesen Behandlungen zu manipulieren (wie Mauney Et Al.2überprüft). Eine solche Methode ist EStim, das gezeigt worden ist, zu verbessern MSC osteogene Differenzierung in Vitro3 und Förderung der Knochenheilung in-vivo-4. Trotz der wachsenden Zahl von Studien mit Schwerpunkt auf die Behandlung von MSCs mit EStim muss eine optimale Therapie für die Maximierung der EStim Pro-osteogene Effekt noch definiert werden.
Andere in-vitro-Methoden mit EStim nutzen Salz Brücken, eingetaucht in das Kulturmedium, das Zellen von metallischen Elektroden5trennt. Der Vorteil hierbei ist, dass liefern EStim durch Salz Brücken die Einführung der chemischen Nebenprodukte (z.B. Korrosion von metallischen Elektroden) eliminiert, die zytotoxischen möglicherweise. Trotz dieses Vorteils Salz Brücken sind umständlich, mit zu arbeiten, und die EStim sie liefern unterscheidet, dass gelieferte in in-vivo-Modelle macht es schwierig, die Ergebnisse beim Einsatz der beiden Systeme korrelieren. Setups, die EStim über metallische oder Carbon Elektroden befestigt im Inneren der Zelle Kultur Brunnen liefern simulieren (wie Hronik Tupaj und Kaplan6überprüft) besser Geräte in Vivo; aber diese Geräte sind schwer zu reinigen sterilisieren/zwischen den Anwendungen und beschränkt sich die Anzahl der Zellen, die pro Experiment untersucht werden können. Wir entwarfen EStim Kammer präsentiert hier speziell um die Einschränkungen von diesen anderen Setups zu beheben. Während die meisten von unserer Erfahrung im Umgang mit diesem EStim-Saal wurde mit 2D und 3D Kulturen mit dem Knochenmark und Fettgewebe-Gewebe-abgeleitete MSCs3,4, ein großer Vorteil dieses Hauses ist, dass es ist vielseitig und mit relativ Änderungen, anpassbar andere Zelltypen unter einer Vielzahl von unterschiedlichen Bedingungen zu studieren.
Hier beschreiben wir den Bau einer EStim Zelle Kultur Kammer; dann zeigen wir Ihnen deren Nutzung durch Behandlung von MSCs mit verschiedenen Therapien EStim und den daraus resultierende Effekt auf osteogene Differenzierung zu messen. MSC osteogene Differenzierung wird durch Ablagerung von Kalzium, alkalische Phosphatase-Aktivität und osteogene Marker-gen-Expression beurteilt. Vor allem beobachtet Vergangenheit Experimente, die diese Einrichtung verwendet wir, dass diese Pro-osteogene Effekte bestehen, lange nach Beendigung der Therapie die EStim.
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Protocol
1. Bau der Elektrostimulation Zelle Kultur Kammer
- Um die EStim-Kammer zu bauen, sammeln Sie zwei Deckel der standard 6-Well Kultur Zellplatten; 99,99 % Platin Draht, 60 cm Länge mit einem Durchmesser von 0,5 – 1 mm; versilberter Kupferdraht, 70 cm in der Länge mit einem Durchmesser von 0,6 mm; Vornschneider; Lötkolben Kit; eine Tube supraleitenden Klebstoff; eine Anschlussklemme Lüsterklemme, sechs kleine 2,2 V LEDs (fakultativ); eine Tube korrosionsbeständig Silikonkleber Beschichtung (optional); eine Klebebandrolle schwarz elektrische Isolierung; Standard, flexible, isolierte elektrische Kupferdraht (0,14 mm2), 2 m Länge (Tabelle der Materialien).
- In einem 6-Well-Platte Deckel, Mark und dann zwei Bohrlöcher (mit einem Durchmesser von ~ 1 mm) Brunnen 25 mm voneinander entfernt, nahe dem äußeren Rand des jeder der sechs (12 Löcher insgesamt), wie in Abbildung 1A, Bgezeigt.
- Schnittlängen Sie 12 5 cm der Platindraht mit Vornschneider. Biegen Sie die Drähte manuell in eine L-Form, so dass einseitig 3 cm lang und die anderen 2 cm. Schneiden Sie den versilbertem Draht in zwei 35 cm Länge.
- Legen Sie das längere (3 cm) gebogene Ende des einen Platindraht (von innen nach außen) in jede Bohrung 1 – 2 mm ragt aus der Außenseite des Deckels, so dass es mit Pinzette biegen. Platindrähte in den Deckel Löcher mit supraleitenden Kleber zu sichern und für ca. 6 Stunden trocknen lassen.
- Löten Sie die Spitzen der alle sechs Platindrähte (das wird später als Kathoden dienen, siehe Abbildung 1A) ragen aus dem Deckel eines Silber-beschichtete Drähte. Wiederholen Sie den Vorgang, Löten die restlichen sechs Platindrähte (das später als Anoden dienen werden) zu den anderen versilbertem Draht.
- Fügen Sie LEDs in die Schaltung zwischen jedem der sechs Anoden-Kathoden Platin-Elektrodenpaare, um Funktionalität während der Experimente (optional) zu bestätigen. Legen Sie ein Stück schwarzes Isolierband unter jedem führte zur Aufdeckung der Zellen in der Kultur-Platten, das LED-Licht (Abbildung 1) verhindern.
- Kleben Sie Anschlussklemme Lüsterklemme an der oberen linken Ecke des Deckels 6-Well-Platte und verbinden Sie beide Silber beschichteten Drähte an die Eingangsklemmen, wie in Abbildung 1dargestellt.
- Schneiden Sie einen Abschnitt 20 x 20 mm von der oberen linken Ecke der zweiten 6-Well-Platte Deckel (Abbildung 1 b, Deckel Nr. 2) an den Klemmleiste-Connector auf dem ersten Deckel unterbringen. Decken Sie den ersten Deckel, ausgestattet mit den Elektroden mit dem zweiten Deckel ab und kleben Sie sie mit Klebeband.
- Verwenden Sie zur Verbesserung der Verklebung der beiden Deckel Silikonkleber Beschichtung (optional). Dazu decken Sie den Deckel mit der silbernen-Elektroden mit einer 3 – 5 mm Schicht Silikonkleber zu und decken Sie es mit den anderen Deckel, so dass 12 h für den Klebstoff trocknen.
- Schließen Sie ein Ende der zwei standard isolierten Kupferdrähte an die Ausgangsklemmen der Lüsterklemme und die anderen Enden an Bananen Stecker (4 mm).
Hinweis: Die Länge der Drähte richtet sich nach der Entfernung aus dem Regal im Brutkasten, wo die Zellen, an die Stromversorgung an, außerhalb des Inkubators (Abbildung 1 gehalten werden). - Passen Sie die Dosis (Spannung) und Therapie mit EStim an die Zellen durch die Regulierung der DC-Netzteil geliefert.
- Schalten Sie die Stromversorgung durch Drücken der ON/OFF -Taste auf der Frontplatte. Aktivieren Sie Kanal 1 durch Drücken der Taste 1.
- Drücken Sie Taste Nr. 4 (V-Satz), die Spannung eingestellt. Drücken Sie 2, . Tasten und 5 bis 2,5 V. Press Enterden Lastausgang festgesetzt.
- Sicherstellen, dass der Lastausgang 2,5 V (2.500 mV) entspricht einem EStim von 100 mV/mm, gemäß der folgenden, vereinfachten Gleichung.
V EStim =
; oder
V = VEStim × d
Hier, V = die Versorgungsspannung Ausgang in Millivolt; d = Abstand zwischen den Elektroden in Millimeter; V EStim = Stimulation Spannung in Millivolt pro Millimeter.
Hinweis: Diese Vereinfachung gilt nur im Falle einer konstanten Gleichspannung. Der Widerstand zwischen dem Medium und der Zellen ist vernachlässigbar, da Elektroden nicht in direkten Kontakt mit den Zellen sind; Stattdessen wird der Zellen durch das Medium EStim geliefert.
; oder2. mesenchymale Stammzellen Kultur in osteogene medium
- Erwerben Sie und im Handel erhältlichen Ratte MSCs (siehe Tabelle der Materialien) in flüssigem Stickstoff bis zum Tag des Experiments. Alternativ veröffentlicht Isolat MSCs von anderen Tieren nach Protokollen an anderer Stelle7,8 in Übereinstimmung mit lokalen institutionellen Regelungen für den Einsatz von Versuchstieren.
- Am Tag des Experiments ein Fläschchen (1 x 10-6 -Zellen) der MSCs aus dem flüssigen Stickstoff-Speicher zu entfernen und schnell (innerhalb von 1 min.) Auftauen der Zellen in einem Wasserbad auf 37 ° c vorgewärmt
- Unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow-Haube pipette des Ampulle Inhalts in ein 50 mL Falcon-Röhrchen und 9 mL normal Medium (NM) vorgewärmt auf 37 ° C, bestehend aus Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM; 1 X) mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin Lösung. Pellets für 5 min die Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g.
- In einem Laminar-Flow-Haube den Überstand zu entfernen und sorgfältig Aufschwemmen der Zelle Pellet in 12 mL NM auf 37 ° c vorgewärmt Übertragen Sie die resuspendierte Zellen in eine T-75 Zelle Kultur Kolben.
- Kulturzellen Sie bei 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2 , bis sie ein Zusammenfluss von 80 – 90 % (nach ca. 3 – 5 Tage) erreichen.
- Die Passage der Zellen.
Hinweis: Operationen Sie alle mit Ausnahme von Zentrifugation und Inkubation unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow-Haube.- Nach Erreichen einer Zusammenfluss von 80 – 90 %, Abrufen der Zellen mit Zelle Ablösung Lösung. Aspirieren das Zellkulturmedium, waschen 2 X mit 1 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 5 mL 1 x Zelle Ablösung Lösung hinzufügen und die Zellen in den Inkubator für 5 min zurück.
- Sobald die Zellen getrennt sind, Hinzufügen einer gleichen Menge von Kulturmedium, die Ablösung Lösung zu inaktivieren. Sammeln Sie die Zellen in einem 50 mL Falcon-Röhrchen und mit 300 X g für 5 min drehen.
- Entsorgen Sie das Medium und Aufschwemmen Sie Zellen in 1 mL frisches normal Medium. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Trypan blau Fleck zu beurteilen.
- 1 x 106 Samenzellen in einem neuen T-75-Kolben mit 12 mL vorgewärmte NM. Kulturzellen Sie bei 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2 , bis sie ein Zusammenfluss von 80 – 90 % erreichen.
Hinweis: Zelle Passagierung (Schritte 2.4.1–2.4.4) kann ein paar Mal wiederholt, bis die benötigte Anzahl der Zellen gewonnen wird. Verwenden Sie nicht älter als Durchgang 8 Zellen.
- 9 x 104 Samenzellen in 3 mL NM (10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 1 % Penicillin/Streptomycin, DMEM) in jede Vertiefung einer Kultur 6-Well-Platte. 1 Tag bei 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2inkubieren Sie Zellen.
- Am nächsten Tag aspirieren Sie Kulturmedium und gelten Sie 3 mL osteogene Differenzierung Medium (OM; normales Mittel ergänzt mit 10-7 M Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat und 0,05 mM Ascorbinsäure-2-Phosphat).
- Legen Sie die 6-Well-Platte mit Zellen im Inkubator und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2 .
3. Behandlung von MSCs mit EStim
- Am Tag, wie, den die Zellen mit EStim behandelt werden, Sterilisieren Sie die Elektroden in 70 % Ethanol-Lösung für 30 min; dann trocknen sie unter UV-Licht in einem Sicherheitsschrank für eine zusätzliche 30 Minuten.
- In einem Laminar-Flow-Haube, decken die 6-Well-Platte mit der kultivierten MSCs bei geschlossenem Deckel ausgestattet mit den Elektroden, um sicherzustellen, dass die Elektroden in Medium vollständig eingetaucht werden (falls erforderlich, fügen Medium). Die überdachte 6-Well-Platte (EStim Kammer) mit den Zellen in den Inkubator zu übertragen und die Drähte an die Stromversorgung anschließen.
- Legen Sie das Netzteil auf 2,5 V Lastausgang und behandeln Sie die Zellen mit EStim für 1 h3,9.
- Trennen Sie nach der Stimulation das Netzteil und entfernen Sie die EStim-Kammer aus dem Inkubator zu. Tauschen Sie unter sterilen Bedingungen den Deckel mit Elektroden mit einem standard 6-Well-Platte Deckel ausgestattet.
- Die Zellen in den Inkubator zurück und lassen sie über Nacht. Reinigen Sie die Elektroden, mit PBS und dann mit 70 % igem Ethanol-Lösung. Reinigen Sie die angesammelten Korrosionsprodukte von der Elektrodenoberfläche mit feinem Sandpapier.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.5 an 6 aufeinanderfolgenden Tagen. Am Tag 4, vor dem Auftragen EStim und unter sterilen Bedingungen ändern Sie das Kulturmedium durch Absaugen von 1,5 mL Medium und ersetzt es mit 1,5 mL vorgewärmte frische OM
- Nach dem Auftragen EStim für 7 aufeinander folgenden Tagen, pflegen Sie die Zellen in der Kultur für weitere 7 Tage, Austausch von dem Medium alle 3 – 4 Tage.
4. osteogene Differenzierung Messungen
- Analysieren Sie Zelle Morphologie Veränderungen unter dem Mikroskop.
- Zur Beurteilung der Wirkung von EStim auf MSC osteogene Differenzierung Maßnahme Kalzium Ablagerung, alkalische Phosphatase-Aktivität und osteogene Marker-gen-Expression, wie beschrieben an anderer Stelle3,9.
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Representative Results
Zur Bewertung der Wirkung der 100 mV/mm EStim auf die osteogene Differenzierung der MSCs, Zellen behandelt mit EStim für 3, wurden 7 und 14 Tagen oder aufbereitetem (Control) am 14. Tag der Kultivierung durch die morphologische Veränderungen und Kalzium Ablagerung (Abbildung 2 Bewertung analysiert ). Dies geschah durch bildgebende Zellen mittels Hellfeld Mikroskopie (Morphologie Änderungen) oder durch Befestigung Zellen in 4 % Paraformaldehyd Lösung, mit 0,02 % Alizarin rote Lösung beflecken und dann Bildgebung sie mit Hellfeld Mikroskopie (Kalzium Ablagerung -Analyse).
Eine detaillierte Analyse der Veränderungen der Genexpression osteogene Markierung wurde an Tag 3, 7 und 14 der Kultivierung (Abbildung 3) durchgeführt. Dies geschah durch die Messung der relativen Expression von Genen RunX2, Kollagen I, Osteopontinund Osterix mittels RT-qPCR und vergleichende Delta Ct-Zyklus (Schwellenwerte) Methode10, wo Housekeeping-Gene Rplp1 und Ywhaz11 dienten zur Normalisierung.
Verfügbarmachen von MSCs bis 100 mV/mm EStim für 3 Tage (1 h pro Tag), hatte keine Auswirkung; 7 Tage der Exposition führten jedoch eine Zunahme osteogene Differenzierung durch Änderungen der Morphologie (Abbildung 2A-C), Kalzium Ablagerung (Abbildung 2E– G) und osteogene Marker-gen Ausdruck Änderungen (bestimmt Abbildung 3) im Vergleich zu einer Zeit aufeinander abgestimmte Kontrolle ohne EStim. Über längere Zeit EStim (14 Tage) die osteogene Differenzierung darüber hinaus nach 7 Tagen nach der Behandlung (Abb. 2DH und Abbildung 3) gesehen nicht weiter ausbauen.
Wie in Abbildung 2dargestellt, Zellen behandelt mit EStim für 7 und 14 Tagen erschienen mehr kondensiert (Abbildung 2D) als diejenigen behandelt mit EStim für 3 Tage oder aufbereitetem Zellen (Abbildung 2AB) und zeigte ein erhöhtes Kalzium Ablagerung (Abbildung 2H) im Vergleich zu den behandelten für nur 3 Tage oder aufbereitetem Steuerelemente ()Abbildung 2EF). Analyse des Ausdrucks osteogene Marker bei 3, 7 und 14 Tagen der Kultivierung bestätigt die verbesserte osteogene Differenzierung in Zellen mit EStim für 7 und 14 Tagen (Abbildung 3) behandelt. Der Ausdruck osteogene Differenzierung-bezogenen Marker Gene12RunX2, Kollagen ich Osteopontinund Osterix waren die höchsten in Zellen mit EStim für 7 Tage behandelt.
Abbildung 1: EStim Zelle Kultur Kammer. (A) elektrischer Schaltplan der EStim Kammer zeigt die Anoden (schwarze), Kathoden (rot) und LEDs an die DC-Stromversorgung angeschlossen. (B) Bild des markierten 6-Well-Platte Deckel und L-förmigen Platin-Elektroden (Ansicht von unten) in den 6-Well-Platte Deckel integriert. (C) montiert EStim Kammer (Draufsicht) mit Lüsterklemme, LEDs und elektrische Isolierung Klebeband, das schützt die Zellen vor dem LED-Licht (Pfeile). (D) EStim cell Behandlung Setup mit EStim Kammer in den Inkubator DC Strom angeschlossen, auf der Außenseite. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Wirkung von EStim auf Morphologie und Kalzium Ablagerung MSC. Zellen in osteogene Kulturmedium, ausgesetzt und nicht ausgesetzt (Steuerelemente) bis 100 mV/mm der EStim für 3, 7 und 14 Tagen (1 h/Tag). (A-D) Morphologie und (E-H) Kalzium Ablagerung (Alizarin rote Färbung) am 14. Tag der Kultivierung. Wesentliche Änderungen in Zelle Morphologie und Kalzium Ablagerungen waren sichtbar in Zellen mit EStim für behandelt (C und G) 7 (D und H) 14 Tage (10-facher Vergrößerung; die Maßstabsleiste = 200 µm). Diese Zahl wurde aus Eischen-Loges Et Al. geändert. 9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Wirkung von EStim auf MSC osteogene Marker-gen-Expression. Osteogene Marker Genexpression (gemessen mit RT-qPCR Tage 3, 7 und 14 der Kultivierung) in Zellen mit EStim für 3, 7 und 14 Tagen oder aufbereitetem behandelt. (A) am 7. Tag der Kultivierung, die RunX2 Expression war signifikant höher in Zellen mit EStim für 7 Tage behandelt. (B) die ColIa1 Ausdruck war signifikant höher in den Zellen für 7 Tage behandelt, gemessen am 14. Tag der Kultivierung. (C) die Expression von Osteopontin wurde an Tag 3, 7 und 14 der Kultivierung in EStim-behandelten Zellen deutlich zugenommen. (D) die Osterix Ausdruck fehlte Kontrolle Zellen überhaupt Zeit Punkte und wurde nur bei 7 bis 14 Tage der Kultur in Zellen, EStim gesehen. Verschiedene Buchstaben auf den Balken zeigen signifikante (p < 0,05) Unterschiede zwischen den Gruppen zur gleichen Zeit Punkt. Das Sternchen zeigt signifikante (p < 0,05) Unterschiede zwischen den Zeitpunkten innerhalb der gleichen Gruppe. Diese Zahl wurde von Eischen-Loges Et Al.9geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier beschreiben wir den Bau einer Kammer und eine Methode für die Behandlung von mesenchymalen Stammzellen mit EStim, der verbesserte osteogene Differenzierung führt.
Das EStim Setup präsentiert erfordert keine spezielle Ausrüstung/wissen und von Nachwuchswissenschaftlern in einem standard Stammzell-Biologie/Biochemie Labor durchgeführt werden kann. Allerdings muss beim Erstellen und verwenden der EStim-Kammer, in ein paar wichtige Schritte geachtet werden. Beim Umgang mit der Platin-Elektroden muss extra darauf geachtet werden, da dieses Metall sehr formbar und zart ist. Während andere Metalle wie Stahl oder Wolfram, verwendet werden können, sind diese nicht empfohlen, da sie anfällig für Korrosion, sind die zytotoxischen13sein kann. Reinigung/Sterilisation des Deckels mit den Elektroden muss auch durchgeführt werden, so exakt wie im Protokoll beschrieben, da diese Methode wurde mehrfach getestet und effektiv bei der Beseitigung von Problemen mit Verschmutzung. Schließlich, während dieser Kammer verwendet werden könnten, um andere zu studieren EStim-Sensitive Zellaktivitäten wie Migration14,15, Proliferation, Apoptose16Zellmembran Spannungen17, und Gerüst Adhäsion19, die EStim Protokoll wir beschreiben hier (100 mV/mm, 1 h/Tag, 7 Tage) konzentrierte sich nur auf osteogene Differenzierung in Ratte MSCs besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden, wenn höhere Spannungen (≥150 mV/mm) und/oder längere Laufzeiten der EStim (> 4 – 5 h) gelten seit zytotoxische Produkte infolge der Elektrolyse kann im Medium ansammeln. In diesem Fall muss das Medium sorgfältig überwacht und entsprechend ausgetauscht. Um weitere Parameter und/oder anderen Zelltypen und Bedingungen zu untersuchen, wird empfohlen, die Dosierung (Spannung) zu trennen und Therapie Titration Studien durchgeführt werden, da diese Änderungen beeinflussen können, wie Zellen auf EStim reagieren.
Mögliche Fehlfunktion der EStim Kammer kann durch Brüche in der elektrischen Schaltung nach wiederholtem Gebrauch und kann über die zusätzlichen LED-Lampen überwacht werden. Bei Bruch (angegeben durch nonilluminated LED-light[s]), der Deckel kann leicht ausgebaut und zu identifizieren und den Bruch zu reparieren. Das schlichte Design der EStim Kammer erleichtert darüber hinaus das es nach den Bedürfnissen der verschiedenen Versuchsaufbauten und Methoden der Analyse zu modifizieren. Beispiele mit verschiedenen Größen der Kultur Zellplatten, variieren einfach die Länge und der Abstand zwischen den Elektroden oder Hinzufügen von verschiedenen (3D) Kulturbedingungen mit keramischen Gerüst Material4 oder leitfähige Substrate18, durch einfaches platzieren diese Materialien ausgesät mit Zellen zwischen den Elektroden.
Wie bei allen in-vitro-Experimente, Zelle Verhaltensweisen und Funktionen immer beobachtet/induziert in der Kammer EStim nicht direkt auf in-vivo-Modelle übertragbar. Dementsprechend müssen bei der Interpretation der EStim-induzierte Verhaltensweisen/Zellfunktionen in der Kammer Forscher immer dies berücksichtigen.
Die Einrichtung und die hier vorgestellte Methode haben viele Vorteile gegenüber anderen in-vitro-Methoden verwendet, um Zellen zu EStim (mit Salz Brücken5 ) und Systeme mit Elektroden eingearbeitet in Zelle Kultur Brunnen19verfügbar zu machen. Ein wichtiger Vorteil des hier beschriebenen Systems ist, dass, da die Zellen im standard 6-Well-Platten kultiviert werden, sie nach EStim Behandlung in anderen in-vivo oder in vitro Protokollen verwendet werden können. Darüber hinaus macht es die Tatsache, die Elektroden auf dem Deckel des 6-Well-Platte fixiert sind leicht zu reinigen und sterilisieren Sie das Gerät zwischen Experimenten und wiederverwenden. Schließlich bietet die Möglichkeit, gleichzeitig stimulieren Zellen in sechs Bohrungen reichlich Stoff für Analyse und Reproduzierbarkeit.
Um zu gewinnen, ein besseres Verständnis der Mechanismen der zellulären Membran-Ebene durch die EStim Zellaktivitäten in laufenden Studien mit der Kammer beschrieben hier betrifft, untersuchen wir die Beziehung zwischen extern gelieferten EStim und Zellmembran mögliche (VMem)17. Basierend auf bisherigen Erkenntnissen9, in Zukunft Studien werden wir darüber hinaus die Zellen mit EStim in der Kammer, allein mit verschiedenen 3D Gerüste und mit leitfähigen Substraten, um bestimmte Zellfunktionen anzuregen vorbehandeln; dann werden wir implantieren sie in Tiermodellen zu bestimmen, ob sie die beobachteten erweiterten Funktionen in-vivo behalten. Diese Studien werden dazu beitragen, die wachsende Zahl von Informationen über die Mechanismen, durch welche EStim Zellfunktion zu regulieren und auf diese Weise könnte zur Optimierung der Zelle Therapieansätze in der regenerativen Medizin und Tissue-Engineering-basierte Behandlungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch eine AO Foundation Gründungshilfe (03 / 14 / S-H) und die Stiftung Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) mit Sitz in Frankfurt/Main, Deutschland unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
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