यहां हम एक सेल संस्कृति विद्युत उत्तेजना के विभिंन प्रकार के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए डिज़ाइन चैंबर के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, और mesenchymal स्टेम सेल के इलाज में इसके उपयोग के लिए osteogenic भेदभाव को बढ़ाने के ।
Mesenchymal स्टेम/stromal कोशिकाओं (MSCs) बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण में हड्डी चिकित्सा को बढ़ावा देने के । विद्युत उत्तेजना (EStim) के लिए इन विट्रो में एमएससी osteogenic भेदभाव को बढ़ाने और नैदानिक सेटिंग्स में हड्डी चिकित्सा को बढ़ावा देने के लिए प्रदर्शन किया गया है । यहां हम एक EStim सेल संस्कृति कक्ष के निर्माण का वर्णन और चूहे की अस्थि मज्जा-प्राप्त एमएससी osteogenic भेदभाव को बढ़ाने के इलाज में इसके उपयोग करते हैं । हमने पाया है कि osteogenic भेदभाव में एक महत्वपूर्ण वृद्धि में 7 दिनों के परिणाम के लिए EStim के साथ MSCs का इलाज है, और महत्वपूर्ण बात, इस समर्थक osteogenic प्रभाव लंबे समय के बाद बनी रहती है (7 दिन) EStim बंद है । EStim के साथ MSCs का इलाज करने के इस दृष्टिकोण osteogenic भेदभाव को बढ़ाने के लिए अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग उपचार परिणामों का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और, इस प्रकार, उन्हें अपनी पूरी चिकित्सीय क्षमता को प्राप्त करने में मदद. इस अनुप्रयोग के अतिरिक्त, इस EStim कक्ष संस्कृति कक्ष और प्रोटोकॉल का उपयोग अंय EStim-संवेदी कक्ष व्यवहारों, जैसे माइग्रेशन, प्रसार, apoptosis, और पाड़ अनुलग्नक की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है ।
आघात और/या रोग-प्रेरित अस्थि दोषों में वृद्धि कोशिका चिकित्सा और अपक्षयी चिकित्सा प्रौद्योगिकियों के विभिंन संयोजनों का उपयोग कर इलाज किया जा रहा है । MSCs इस तरह के उपचार में पसंद की कोशिका हैं, उनके अपेक्षाकृत उच्च osteogenic गतिविधि के कारण, अलगाव और विस्तार दक्षता, और सुरक्षा1. उनके osteogenic गतिविधि को अधिकतम करने के लिए और, इस प्रकार, उनके चिकित्सीय प्रभाव का अनुकूलन, कई तरीकों को इन उपचार में उनके उपयोग करने से पहले MSCs हेरफेर शुरू किया गया है (के रूप में Mauney एट अल.2द्वारा की समीक्षा) । ऐसा ही एक तरीका है EStim, जिसमें3 विट्रो में एमएससी osteogenic भेदभाव को बढ़ाने और vivo4में हड्डी हीलिंग को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है । EStim के साथ MSCs के इलाज पर ध्यान केंद्रित अध्ययन की बढ़ती संख्या के बावजूद, EStim प्रो osteogenic प्रभाव अधिकतम करने के लिए एक इष्टतम आहार अभी तक परिभाषित किया जाना है ।
अंय इन विट्रो विधियों का उपयोग कर EStim नमक की संस्कृति के माध्यम है, जो धातु इलेक्ट्रोड5से अलग कोशिकाओं में जलमग्न पुलों का प्रयोग । इस का लाभ यह है कि नमक पुलों के माध्यम से EStim देने रासायनिक प्रतिफल (जैसे, धातु इलेक्ट्रोड की जंग) है कि साइटोटोक्सिक जा सकता है की शुरूआत समाप्त । इस लाभ के बावजूद, नमक पुल के साथ काम करने के लिए बोझिल हैं, और EStim वे उद्धार है कि vivo मॉडलों में दिया से अलग है, यह मुश्किल परिणाम प्राप्त करने के लिए जब दो प्रणालियों का उपयोग करने को सहसंबंधी बनाना । setups कि धातु के माध्यम से EStim देने या सेल संस्कृति वेल्स के अंदर तय की कार्बन इलेक्ट्रोड (के रूप में Hronik द्वारा की समीक्षा-टॊपाज और कापलान6) बेहतर अनुकरण उपकरणों में प्रयुक्त vivo; हालांकि, इन उपकरणों का उपयोग करता है और प्रति प्रयोग अध्ययन किया जा सकता है कि कोशिकाओं की संख्या सीमित है के बीच साफ/ हम EStim यहां प्रस्तुत विशेष रूप से इन अंय setups की सीमाओं को संबोधित चैंबर बनाया । जबकि हमारे अनुभव के सबसे इस EStim चैंबर का उपयोग कर 2d और 3 डी अस्थि मज्जा-और वसा-ऊतक-MSCs3,4, इस चैंबर के एक प्रमुख लाभ व्युत्पंन युक्त संस्कृतियों के साथ किया गया है कि यह बहुमुखी है और अपेक्षाकृत छोटे के साथ परिवर्तन, विभिंन स्थितियों की एक किस्म के तहत अंय प्रकार के सेल के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
यहां हम एक EStim सेल संस्कृति चैंबर के निर्माण का वर्णन; फिर, हम EStim के विभिंन परहेजों के साथ MSCs के इलाज और osteogenic भेदभाव पर जिसके परिणामस्वरूप प्रभाव को मापने के द्वारा इसके उपयोग का प्रदर्शन । एमएससी osteogenic भेदभाव कैल्शियम जमाव, alkaline फॉस्फेट गतिविधि, और osteogenic मार्कर जीन अभिव्यक्ति के माध्यम से मूल्यांकन किया है । महत्वपूर्ण बात, पिछले प्रयोग में है कि इस सेटअप का इस्तेमाल किया, हमने देखा है कि इन समर्थक osteogenic प्रभाव लंबे समय के बाद जारी रहती है EStim उपचार बंद कर दिया गया था ।
यहां हम एक कक्ष के निर्माण और EStim के साथ mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के इलाज के लिए एक विधि का वर्णन है कि बढ़ाया osteogenic भेदभाव में परिणाम है ।
EStim प्रस्तुत सेटअप विशेष उपकरण/ज्ञान की आवश्यकता नहीं है और एक ?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम एक ए ओ फाउंडेशन स्टार्ट-अप ग्रांट (एस-14-03H) और Friedrichsheim फाउंडेशन (Stiftung Friedrichsheim) द्वारा फ्रैंकफर्ट/मेन, जर्मनी में आधारित हिस्से में समर्थित था ।
Estim fabrication | |||
Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
MSC culture | |||
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |