Summary
Qui presentiamo un protocollo per la costruzione di un alloggiamento della coltura cellulare progettato per esporre le cellule a vari tipi di stimolazione elettrica e il suo uso nel trattamento di cellule staminali mesenchimali per migliorare la differenziazione osteogenica.
Abstract
Cellule staminali/stromali mesenchimali (MSCs) sono stati ampiamente utilizzate per promuovere la guarigione dell'osso in approcci di ingegneria tissutale. Stimolazione elettrica (EStim) ha dimostrata di aumentare la differenziazione osteogenica MSC in vitro e promuovere nelle regolazioni cliniche di guarigione ossea. Qui descriviamo la costruzione di un alloggiamento della coltura delle cellule EStim e suo uso nel trattamento dell'osso-zucchino-derivate MSC per migliorare la differenziazione osteogenica del ratto. Abbiamo trovato che il trattamento MSCs con EStim per 7 giorni si traduce in un aumento significativo nel differenziamento osteogenico e d'importanza, questo effetto pro-osteogenico persiste a lungo dopo (7 giorni) EStim è interrotto. Questo approccio di pretrattamento MSCs con EStim per migliorare la differenziazione osteogenica potrebbe essere usato per ottimizzare i risultati del trattamento di tessuto osseo e, quindi, di aiutarli a raggiungere il loro potenziale terapeutico completo. Oltre a questa applicazione, questo alloggiamento della coltura delle cellule EStim e protocollo utilizzabile anche per studiare altri comportamenti di cella EStim-sensibili, come la migrazione, la proliferazione, apoptosi e impalcatura allegato.
Introduction
Un aumento nel trauma e/o difetti ossei malattia-indotta sono stati trattati utilizzando diverse combinazioni di tecnologie di medicina rigenerativa e terapia cellulare. MSCs sono le cellule di scelta in tali trattamenti, a causa della loro attività osteogenica relativamente elevata, isolamento ed espansione efficienza e sicurezza1. Per massimizzare la loro attività osteogenica e, quindi, ottimizzare la loro efficacia terapeutica, sono stati introdotti diversi metodi per manipolare MSCs prima del loro utilizzo in questi trattamenti (come Recensito da Mauney et al.2). Uno di questi metodi è EStim, che ha dimostrato di migliorare la differenziazione osteogenica MSC in vitro3 e promuovere in vivo4di guarigione ossea. Nonostante il numero crescente di studi concentrandosi sul trattamento MSCs con EStim, un regime ottimale per massimizzare l'effetto pro-osteogenico di EStim deve ancora essere definito.
Altri metodi in vitro utilizzando EStim utilizzano sale ponti sommersi nel terreno di coltura, che separa le cellule da elettrodi metallici5. Il vantaggio di questo è che la prestazione EStim tramite ponti sale Elimina l'introduzione di sottoprodotti chimici (ad esempio, la corrosione degli elettrodi metallici) che possono essere citotossici. Nonostante questo vantaggio, sale ponti sono ingombranti per lavorare con ed EStim consegnano differisce da quello consegnato in modelli in vivo, che lo rende difficile da correlare i risultati ottenuti con i due sistemi. Configurazioni che consegnare EStim tramite elettrodi metallici o carbonio fissati all'interno dei pozzi di cultura delle cellule (come Recensito da Hronik-Tupaj e Kaplan6) meglio simulano dispositivi utilizzati in vivo; Tuttavia, questi dispositivi sono difficili da pulire/sterilizzare tra un utilizzo e il numero delle cellule che possono essere studiate per esperimento è limitato. Abbiamo progettato la camera EStim presentata qui appositamente per risolvere le limitazioni di queste altre configurazioni. Mentre la maggior parte della nostra esperienza nell'utilizzo di quest'Aula EStim è stato con 2D e 3D colture contenenti midollo adiposo-tessuto-derivata e MSCs3,4, dei principali vantaggi di questa camera è che è versatile e, con relativamente minori modifiche, può essere adattato per studiare altri tipi di cellule in una varietà di condizioni diverse.
Qui descriviamo la costruzione di un alloggiamento della coltura delle cellule EStim; quindi, dimostriamo l'uso dal servizio MSCs trattante con regimi differenti di EStim e misurando l'effetto risultante sul differenziamento osteogenico. Differenziazione osteogenica MSC è valutata tramite il deposito del calcio, attività della fosfatasi alcalina ed espressione genica osteogenica marcatore. Importante, in passato esperimenti che hanno usato questa configurazione, abbiamo osservato che questi effetti pro-osteogenico persistono lungamente dopo che il trattamento di EStim è stato interrotto.
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Protocol
1. costruzione di alloggiamento della coltura di stimolazione elettrica delle cellule
- Per costruire la camera EStim, raccogliere due coperchi delle piastre per colture cellulari 6 pozzetti standard; filo di platino al 99,99%, 60 cm di lunghezza con un diametro di 0,5 – 1 mm; filo di rame argentati, 70 cm di lunghezza con un diametro di 0,6 mm; pinze di taglio; kit saldatore; un tubetto di colla superconduttore; connettore del blocchetto terminali di monofilo, sei piccolo 2,2 V LED (opzionale); un tubo di adesivo siliconico anti corrosivo rivestimento (opzionale); un rotolo di nastro nero dell'isolamento elettrico; standard, flessibile, isolato legare elettrico di rame (0,14 mm2), 2 m di lunghezza (tabella materiali).
- In un coperchio piastra a 6 pozzetti, segno e poi due fori di trapano (con un diametro di ~ 1 mm), 25 mm apart, vicino al bordo esterno di ciascuna delle sei pozzi (12 buche in totale), come mostrato in Figura 1A, B.
- Tagliate dodici lunghezze di 5 cm di filo di platino con pinze di taglio. Piegare ciascuno dei fili manualmente in una forma di L, lasciando un'estremità lungo 3 cm e gli altri 2 cm. tagliare il filo argento-rivestito in due lunghezze di 35 cm.
- Inserire l'estremità piegata (3 cm) più lunga di un filo di platino (da dentro a fuori) ogni foro praticato, lasciando una sporgenza dalla parte esterna del coperchio, 1 – 2 mm piegarlo usando il forcipe. Fissare i cavi platino nei fori coperchio con superconduttore colla e lasciare asciugare per circa 6 ore.
- Saldare i suggerimenti di tutti i sei fili di platino (che sarà poi servire come catodi, vedere Figura 1A) che sporge dai coperchi ad uno dei fili argentati. Ripetere la stessa procedura, saldare i fili di platino sei rimanenti (che serviranno poi come anodi) per l'altro filo argento-rivestito.
- Aggiungere il LED nel circuito tra ognuna delle sei coppie anodo catodo elettrodo di platino, per confermare la funzionalità durante gli esperimenti (opzionali). Posizionare un pezzo di nastro isolante nero sotto ogni LED per prevenire l'esposizione delle cellule in piastre di coltura per la luce del LED (Figura 1).
- Il connettore del blocchetto terminali di filo all'angolo in alto a sinistra del coperchio piastra a 6 pozzetti per colla e collegare entrambi i fili argentati ai morsetti di ingresso, come mostrato in Figura 1.
- Tagliare una sezione di 20 x 20 mm dall'angolo superiore sinistro di un secondo coperchio piastra a 6 pozzetti (Figura 1B, coperchio Nr. 2) per ospitare il connettore del blocchetto terminali sul coperchio del primo. Coprire il coperchio primo, dotato di elettrodi, con il secondo coperchio e fissarli con nastro adesivo insieme con nastro adesivo.
- Per migliorare l'incollaggio dei due coperchi, utilizzare adesivo siliconico, rivestimento (opzionale). A tale scopo, coprire il coperchio con gli elettrodi d'argento con uno strato di adesivo siliconico 3 – 5 mm e coprire con coperchio, permettendo 12 h per l'adesivo ad asciugare.
- Collegare un'estremità dei due fili di rame isolati standard ai terminali di uscita del filo connettore e le altre estremità di connettori maschio a banana (4 mm).
Nota: La lunghezza di questi fili dipende dalla distanza dalla mensola in incubatrice, dove verranno mantenute le celle, all'alimentazione, all'esterno dell'incubatrice (Figura 1). - Regolare il dosaggio (tensione) e regime di EStim consegnati alle cellule regolando l'alimentazione DC.
- Accendere l'alimentazione premendo il pulsante ON/OFF sul pannello frontale. Attiva il canale 1 premendo il tasto 1.
- Premere il pulsante Nr. 4 (V-set) per impostare la tensione. Premere contemporaneamente i tasti 2, . e 5 per impostare l'uscita di carico a 2,5 V. Premere invio.
- Accertarsi che l'uscita di carico di 2,5 V (2.500 mV) corrisponde a una stima di 100 mV/mm, secondo l'equazione seguente, semplificata.
V EStim =
; o
V = VEStim × d
Qui, V = tensione di alimentazione di uscita in millivolt; d = la distanza tra gli elettrodi in millimetri; V EStim = stimolazione tensione in millivolt per millimetro.
Nota: Questa semplificazione si applica solo in caso di costante tensione di CC. La resistenza tra il mezzo e le cellule è trascurabile come elettrodi non sono a diretto contatto con le cellule; invece, EStim è trasportato alle cellule attraverso il mezzo.
; o2. mesenchymal stem cell cultura in medium osteogenica
- Acquistare e conservare MSCs ratto commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali) in azoto liquido fino al giorno dell'esperimento. In alternativa, MSCs l'isolato dagli altri animali secondo i protocolli pubblicati altrove7,8 disposizioni istituzionali locali per l'uso di animali da esperimento.
- Il giorno dell'esperimento, rimuovere un flaconcino (1 x 106 cellule) di cellule staminali mesenchimali dallo stoccaggio di azoto liquido e rapidamente (entro 1 min) scongelare le cellule in un bagno di acqua preriscaldato a 37 ° C.
- In condizioni di sterilità in cappa a flusso laminare, pipettare il contenuto del flacone in un tubo falcon 50 mL e aggiungere 9 mL di medium normale (NM) preriscaldata a 37 ° C, che consiste del mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM; 1x) con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e 1% soluzione di penicillina/streptomicina. Agglomerare le cellule per 5 min per centrifugazione a 300 x g.
- In una cappa a flusso laminare, rimuovere il supernatante e Risospendere accuratamente il pellet cellulare in 12 mL di NM preriscaldata a 37 ° C. Trasferire le cellule sedimento in un pallone di cultura delle cellule T-75.
- Coltura, le cellule a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 fino a raggiungere una confluenza di 80 – 90% (dopo circa 3 – 5 giorni).
- Le cellule del passaggio.
Nota: Eseguire tutte le operazioni tranne centrifugazione e incubazione in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.- Dopo aver raggiunto una confluenza di 80 – 90%, recuperare le cellule con soluzione di distacco delle cellule. Aspirare il terreno di coltura cellulare, lavare 2x con 1 soluzione salina x tampone fosfato (PBS), aggiungere 5 mL di soluzione per distacco delle cellule 1x e restituire le cellule nell'incubatore per 5 min.
- Una volta che le cellule sono staccate, aggiungere una pari quantità di terreno di coltura per inattivare la soluzione di distacco. Raccogliere le cellule in un tubo falcon 50 mL e li spin a 300 x g per 5 min.
- Eliminare il terreno e risospendere le cellule in 1 mL di medium normale fresco. Valutare il numero di cellule vitali con la macchia blu di trypan.
- Semi di 1 x 106 cellule in una nuova staffa di T-75 con 12 mL di NM preriscaldati. Coltura, le cellule a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 fino a raggiungere una confluenza di 80 – 90%.
Nota: Cella passaggio (misure 2.4.1–2.4.4) può essere ripetuto alcune volte fino ad ottenuta il numero necessario di cellule. Non utilizzare cellule oltre passaggio 8 anni di età.
- 4 cellule di seme 9 x 10 in 3 mL di nanometro (10% inattivati siero fetale bovino, 1% di penicillina/streptomicina, DMEM) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti. Incubare le cellule per 1 giorno a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2.
- Il giorno successivo, aspirare il terreno di coltura e applicare 3 mL di mezzo di differenziazione osteogenica (OM; normale supplementato con 10-7 M desametasone, β-glicerofosfato di 10 mM e 0,05 mM acido ascorbico-2-fosfato).
- Posizionare la piastra 6 pozzetti con cellule nell'incubatrice e incubare a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 durante la notte.
3. trattamento di MSCs con EStim
- Il giorno che le cellule sono trattate con EStim, sterilizzare gli elettrodi in soluzione di etanolo 70% per 30 min; quindi, asciugarli sotto la luce in un armadietto per altri 30 min di sicurezza UV.
- In una cappa a flusso laminare, coprire la piastra 6 pozzetti contenenti i MSCs coltivate con il coperchio dotato di elettrodi, assicurandosi che gli elettrodi sono completamente sommerse in mezzo (se necessario, aggiungere il terreno). Trasferire la piastra 6 pozzetti coperta (EStim sezione) con le cellule nell'incubatore e collegare i suoi fili dell'alimentazione.
- Impostare l'alimentazione a 2,5 V carico uscita e trattare le cellule con EStim per 1h3,9.
- Dopo stimolazione, scollegare l'alimentazione elettrica e rimuovere la camera EStim dall'incubatrice. In condizioni di sterilità, scambiare il coperchio dotato di elettrodi con un coperchio piatto 6 pozzetti standard.
- Riporre le cellule nell'incubatore e lasciarli durante la notte. Pulire gli elettrodi, prima con PBS e poi con soluzione di etanolo al 70%. Pulire i prodotti di corrosione accumulato dalla superficie dell'elettrodo con carta vetrata fine.
- Ripetere i passaggi da 3.1 – 3,5 per 6 giorni consecutivi. Il giorno 4, prima dell'applicazione EStim e in condizioni di sterilità, modificare il terreno di coltura ad aspirazione 1,5 mL di terreno e la sua sostituzione con 1,5 mL di preriscaldati om fresco
- Dopo aver applicato EStim per 7 giorni consecutivi, mantenere le cellule in coltura per altri 7 giorni, scambiando il mezzo ogni 3 – 4 giorni.
4. misurazioni di differenziazione osteogenica
- Analizzare i cambiamenti di morfologia delle cellule al microscopio.
- Per valutare l'effetto di EStim il differenziamento osteogenico MSC, misura il deposito del calcio, attività della fosfatasi alcalina ed espressione del gene marcatore osteogenica, come descritto altrove3,9.
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Representative Results
Per valutare l'effetto di 100 mV/mm di EStim sul differenziamento osteogenico di cellule staminali mesenchimali, cellule trattate con EStim per 3, 7 e 14 giorni o non trattato (controllo) sono stati analizzati al giorno 14 di coltura valutando i cambiamenti morfologici e deposizione di calcio (Figura 2 ). Questo è stato fatto da imaging celle utilizzando la microscopia a campo chiaro (cambiamenti di morfologia) o fissando le cellule in soluzione di paraformaldeide 4%, loro colorazione con soluzione di colore rosso di alizarina di 0,02% e poi li imaging utilizzando la microscopia a campo chiaro (deposizione di calcio analisi).
Giorni 3, 7 e 14 di coltura (Figura 3) è stata eseguita un'analisi dettagliata dei cambiamenti di espressione del gene marcatore osteogenico. Questo è stato fatto misurando l'espressione relativa dei geni RunX2, collagene I, osteopontinae Osterix mediante RT-qPCR e il delta comparativo Ct (valori di ciclo soglia) metodo10, dove geni housekeeping Rplp1 e Ywhaz11 sono stati utilizzati per la normalizzazione.
Esponendo MSCs a 100 mV/mm di EStim per 3 giorni (1 h al giorno) non ha avuto effetto; Tuttavia, 7 giorni di esposizione ha provocato un aumento nel differenziamento osteogenico, come determinato da cambiamenti di morfologia (Figura 2A– C), il deposito del calcio (Figura 2E– G) e osteogenica marcatore gene espressione modifiche ( Figura 3) in confronto ad un controllo di pari tempo senza EStim. L'esposizione prolungata EStim (14 giorni) non ha migliorato ulteriormente la differenziazione osteogenica oltre quello visto dopo 7 giorni di trattamento (Figura 2DH e Figura 3).
Come illustrato nella Figura 2, cellule trattati con EStim per 7 e 14 giorni è apparso più condensato (Figura 2D) rispetto a quelli trattati con EStim per 3 giorni o non trattate cellule (Figura 2AB) e hanno mostrato un'aumentata del calcio deposizione (Figura 2H) rispetto a quelli trattati solo per 3 giorni o controlli non trattati (Figura 2EF). Analisi dell'espressione marcatore osteogenica in 3, 7 e 14 giorni di coltura ha confermato il maggiore differenziazione osteogenica in cellule trattate con EStim per 7 e 14 giorni (Figura 3). L'espressione di marker correlati di differenziazione osteogenica geni12RunX2, collagene I, osteopontinae Osterix erano il più alto in cellule trattate con EStim per 7 giorni.
Figura 1: alloggiamento della coltura di EStim cell. (A) diagramma di circuito elettrico di sezione EStim mostrando gli anodi (neri), catodi (rosso) e LED collegati alla rete di alimentazione DC. (B) immagine del coperchi contrassegnato piastra a 6 pozzetti ed elettrodi di platino a forma di L (vista dal basso) incorporata nel coperchio piastra a 6 pozzetti. (C) assemblati EStim dell'alloggiamento (vista superiore) con connettore del legare, LED e nastro di isolamento elettrico che protegge le cellule dalla luce LED (frecce). (D) EStim cellulare installazione di trattamento con la camera di EStim nell'incubatrice collegato all'alimentatore DC, all'esterno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: effetto di EStim sulla deposizione di calcio e morfologia MSC. Cellule in coltura osteogenica, esposti e non esposti (controlli) a 100 mV/mm di EStim per 3, 7 e 14 giorni (1 ora al giorno). (A–D) Morfologia e (E–H) deposito di calcio (macchie di colore rosso di alizarina) il giorno 14 di coltura. Cambiamenti significativi nei depositi di calcio e morfologia delle cellule erano visibili in cellule trattate con EStim (C e G) 7 e (D e H) 14 giorni (ingrandimento 10x; la barra della scala = 200 µm). Questa figura è stata per volta da Eischen-Loges et al.. 9. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetto di EStim sull'espressione del gene marcatore osteogenica MSC. L'espressione di gene marcatore osteogenica (misurato con RT-qPCR a giorni 3, 7 e 14 della coltura) in cellule trattate con EStim per 3, 7 e 14 giorni, o non trattati. (A) a 7 giorno di coltura, l'espressione RunX2 era significativamente più alta in cellule trattate con EStim per 7 giorni. (B) il ColIa1 espressione era significativamente più alta in cellule trattate per 7 giorni, misurato al giorno 14 di coltura. (C), l'espressione di osteopontina è stata aumentata significativamente in cellule trattate con EStim ai giorni 3, 7 e 14 di coltura. (D) la Osterix espressione era assente nel controllo celle affatto tempo punti ed è stato visto solo alle 7 e 14 giorni di cultura in cellule esposte a EStim. Diverse lettere sulle barre indicano significative differenze (p < 0,05) fra i gruppi allo stesso tempo punto. L'asterisco indica significative differenze (p < 0,05) tra i punti di tempo all'interno del gruppo stesso. Questa figura è stata modificata da Eischen-Loges et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui descriviamo la costruzione di una camera e un metodo per il trattamento di cellule staminali mesenchimali con EStim che si traduce in una maggiore differenziazione osteogenica.
Il setup di EStim presentato non richiede particolare attrezzature/conoscenza e può essere eseguito in un laboratorio di Biologia/biochimica standard sulle cellule staminali dai ricercatori junior. Tuttavia, quando costruire e usare la camera di EStim, è necessario prestare attenzione speciale in pochi passaggi critici. Quando si maneggiano gli elettrodi di platino, deve prestare attenzione supplementare come questo metallo è molto malleabile e delicato. Mentre altri metalli, come l'acciaio o di tungsteno, possono essere utilizzati, questi non sono raccomandati come essi sono soggetti a corrosione, che può essere citotossici13. Inoltre, il coperchio con gli elettrodi di pulizia/sterilizzazione deve essere eseguita come proprio come descritto nel protocollo, poiché questo metodo è stato testato più volte e trovato per essere efficace nell'eliminazione di problemi di contaminazione. Infine, mentre quest'Aula potrebbe essere usata per studiare altro attività cellulare EStim-sensibili come migrazione14,15, proliferazione, apoptosi16, membrana cellulare tensioni17e impalcature e adesione19, il EStim protocollo Descriviamo qui (100 mV/mm, 1 ora al giorno, 7 giorni) concentrata solo sulla differenziazione osteogenica in ratto MSCs. speciale attenzione dovrebbe essere prestata se maggiore tensione (mV/mm ≥150) e/o le durate più lunghe di EStim (> 4 – 5 h) vengono applicate dal prodotti citotossici derivanti dall'elettrolisi può accumularsi nel mezzo. In questo caso, il mezzo deve essere attentamente monitorato e scambiato conseguenza. Per studiare altri parametri e/o altri tipi di cellule e condizioni, si consiglia di che separano il dosaggio (tensione) e regime titolazione studi condotti come questi cambiamenti possono influenzare come le cellule rispondono a EStim.
Eventuali malfunzionamenti della camera EStim può essere a causa di interruzioni nei circuiti elettrici dopo un uso ripetuto e può essere monitorato tramite l'aggiunta lampade a LED. In caso di rottura (indicato da nonilluminated LED light[s]), il coperchio può essere rimosso e facilmente smontato per identificare e riparare la rottura. Inoltre, il design semplice della camera EStim rende facile per modificarlo secondo le necessità delle diverse configurazioni sperimentali e metodi dell'analisi. Esempi includono l'utilizzo di diverse dimensioni delle piastre per colture cellulari, semplicemente variando la lunghezza del e la distanza tra gli elettrodi o aggiungendo differenti (3D) condizioni di coltura con impalcatura in ceramica materiale4 o substrati conduttivi18, da semplicemente mettendo questi materiali seminati con cellule tra gli elettrodi.
Come in tutti gli esperimenti in vitro, dei comportamenti delle cellule e funzioni osservato/indotta nella camera EStim non sono sempre direttamente trasferibile in modelli in vivo. Di conseguenza, quando si interpretano i comportamenti/funzioni EStim-indotta delle cellule nella camera, i ricercatori devono sempre tenerne conto.
L'installazione e il metodo presentato qui presentano molti vantaggi sopra altri metodi in vitro utilizzati per esporre le cellule a EStim (sistemi con sale ponti5 ) e con elettrodi incorporati nella cella cultura pozzi19. Un importante vantaggio del sistema descritto qui è che, poiché le cellule sono coltivate in piastre da 6 pozzetti standard, può essere utilizzati dopo il trattamento EStim in altri protocolli in vivo o in vitro. Inoltre, il fatto che gli elettrodi sono fissati sul coperchio della piastra 6 pozzetti lo rende facile da pulire e sterilizzare il dispositivo tra esperimenti e di riutilizzarla. Infine, la possibilità di stimolare contemporaneamente le cellule in sei pozzi offre ampio materiale per l'analisi e la riproducibilità.
Per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi a livello di membrana cellulare con cui EStim influenza l'attività delle cellule negli studi in corso utilizzando la camera descritta qui, stiamo esplorando il rapporto tra esternamente consegnati EStim e membrana cellulare potenziale (Vmem)17. Inoltre, basato su precedenti risultati9, in futuro studi, abbiamo pretrattare le cellule con EStim in aula, da solo e con diverse impalcature 3D e con i substrati conduttivi, per stimolare le funzioni specifiche delle cellule; quindi, ci saranno impiantarli in modelli animali per determinare se essi conservano le funzioni avanzate osservate in vivo. Questi studi contribuiranno al corpo crescente di informazioni circa i meccanismi da cui EStim regolano la funzione delle cellule e, così facendo, potrebbe contribuire a ottimizzare gli approcci di terapia cellulare nella medicina rigenerativa e ingegneria-tissutali trattamenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di Start-up di fondazione AO (S-14-03 H) e la Fondazione di Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) con sede a Francoforte sul meno, Germania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
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