Summary
Здесь мы представляем протокол для строительства палаты культуры клеток, предназначен подвергать клетки различных видов электрической стимуляции и его использование в лечении мезенхимальных стволовых клеток для повышения Остеогенные дифференциации.
Abstract
Для ускорения заживления кости в ткани, инженерные подходы широко использовались мезенхимальных стволовых стромальных клеток (Майкрософт) (MSCs). Электрическая стимуляция (приблиз) продемонстрировал увеличение MSC Остеогенные дифференциации в пробирке и поощрять кости Исцеление в клинических условиях. Здесь мы описываем строительной палаты культуры клеток приблиз и его использование в лечении крыса кости-костного мозга производные MSC активизировать Остеогенные дифференциации. Мы обнаружили, что лечение MSCs с приблиз на 7 дней приводит к значительным увеличением Остеогенные дифференциации, и главное, это про Остеогенные эффект сохраняется долго после того, как прекращается (7 дней) приблиз. Этот подход предварительной обработки MSCs с приблиз активизировать Остеогенные дифференциация может использоваться для оптимизации костной ткани, инженерные результаты лечения и, таким образом, помочь им в достижении их полный терапевтический потенциал. Помимо этого приложения эта палата культуры клеток приблиз и протокол может также использоваться для расследования других приблиз чувствительных клеток поведения, такие как миграция, распространения, апоптоз и насадку леска.
Introduction
Увеличение травма или заболевание индуцированной костных дефектов проходят лечение с использованием различных сочетаний технологий регенеративной медицины и клеточной терапии. MSCs являются клетки выбора такого лечения, из-за их относительно высокой активности остеогенные, изоляции и расширение эффективности и безопасности1. Для максимизации их Остеогенные активность и, таким образом, оптимизировать их терапевтической эффективности, были введены несколько методов для манипулирования MSCs до их использования в этих методов лечения (как рассмотрено Mauney et al.2). Один из таких методов является приблиз, который был показан для повышения MSC Остеогенные дифференциации в пробирке3 и кости Исцеление в естественных условиях4. Несмотря на растущее количество исследований, посвященных лечении MSCs с приблиз оптимальный режим для максимального приблиз в про Остеогенные эффект еще предстоит определить.
Другие в пробирке методы, с помощью приблиз используют соли мосты, погруженной в среде культуры, которая отделяет клетки от металлических электродов5. Преимуществом этого является, что доставку приблиз через мосты соли устраняет введение химических побочных продуктов (например, коррозии металлических электродов), которые могут быть цитотоксических. Несмотря на это преимущество соль мосты являются обременительными для работы с, и они доставить приблиз отличается от что поставленный в в естественных условиях модели, что делает его трудно соотнести результаты, полученные при использовании двух систем. Установок, которые доставляют приблиз через металлические или углеродных электродов, фиксированной внутри скважины культуры клеток (как рассмотрено Hronik-Тупак и Каплан6) лучше имитировать устройства, используемые в естественных условиях; Однако эти устройства являются трудно очистить/стерилизации между использованиями и ограничено количество клеток, которые могут быть изучены на эксперимент. Мы разработали приблиз камеры, представленные здесь, специально для устранения ограничений этих установок. Хотя большинство из нашего опыта, с помощью этой камеры приблиз с 2D и 3D культур, содержащих костного мозга и жировой ткань производных MSCs3,4, основным преимуществом этой камеры является то, что он универсален и с относительно малой изменения, могут быть адаптированы для изучения других типов клеток под целый ряд различных условий.
Здесь мы описываем строительство приблиз палаты культуры клеток; Затем мы продемонстрировать его использование в лечении MSCs с различных схем приблиз и измерения результирующий эффект на Остеогенные дифференциации. MSC Остеогенные дифференциация оценивается через отложение кальция, щелочной фосфатазы и остеогенном маркер экспрессии генов. Важно отметить, что в прошлых экспериментов, которые используются этой установки, мы наблюдали что эти про Остеогенные эффекты сохраняются долго после того, как приблиз лечение было прекращено.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Строительство электрической стимуляции клеток культуры камеры
- Чтобы построить приблиз камеры, соберите две крышки стандартной ячейки 6-ну культуры пластин; 99,99% платиновой проволоки, 60 см в длину с диаметром 0,5 – 1 мм; серебро покрытием медной проволоки, 70 см в длину с диаметром 0.6 мм; Плиткорезы кусачки; комплект на Паяльники; одна трубка сверхпроводящие клея; один провод клеммы разъем, шесть небольших 2.2 V светодиоды (опционально); одна трубка нержавеющих силиконовый клей покрытие (опционально); один рулон Черный Электроизоляционные ленты; стандарт, гибкие, изолированные медные электрические провода (0,14 мм2), 2 м в длину (таблица материалов).
- В 6-ну пластина крышки, Марк и затем просверлить два отверстия (диаметром ~ 1 мм) 25 мм друг от друга, около внешнего края каждого из шести скважин (12 отверстий в целом), как показано на Рисунок 1A, B.
- Вырежьте 12 5 см длины провода платины Плиткорезы кусачки. Согнуть каждый из провода вручную в L-образной формы, оставив один конец длиной 3 см и других 2 см. вырезать серебро покрытием проволоки в две длины 35 см.
- Вставить больше (3 см) загнутым концом одного провода платины (от внутренности вне) в каждой просверленное отверстие, оставляя 1-2 мм, торчащий из внешней крышкой, согнуть его, используя пинцет. Безопасный платинового провода в крышку отверстия сверхпроводящие клеем и оставьте его для просушки на около 6 ч.
- Припой советы всех шести провода платины (которые позднее будут служить катодов, см. Рисунок 1A) выступающие от крышки к одному из серебра покрытием провода. Повторите эту же процедуру, пайка оставшиеся шесть платинового провода (которые позднее будут служить аноды) к другим покрытием серебра проволоки.
- Добавьте светодиоды в цепи между каждой из шести пар Платиновый электрод анод катод, для подтверждения функциональности во время экспериментов (необязательно). Поместите кусок черной изоляционной лентой под каждым привело к предотвратить предоставление клетки в культуре пластины для светодиодные (рис. 1 c).
- Приклейте разъем провода терминальный блок в верхний левый угол 6-ну пластина крышки и подключите оба серебро покрытием провода на входные клеммы, как показано на рисунке 1 c.
- Вырежьте из раздела 20 мм х 20 мм от верхнего левого угла второй 6-ну пластина крышки (рис. 1B, крышка Nr. 2) для размещения разъема терминальный блок на крышке первого. Обложка первого крышкой, оборудованный с электродами, второй крышкой и приклейте их вместе с клейкой лентой.
- Для улучшения сцепления двух крышек, используйте силиконовый клей, покрытие (по желанию). Чтобы сделать это, охватывают крышку с серебряными электродами с 3 – 5 мм слоем силиконового клея и накрыть крышкой, позволяя 12 h для клей для просушки.
- Подключите один конец два стандартных изолированные медные провода к клеммам выходной разъем провода и другие концы для мужчин разъемы банан (4 мм).
Примечание: Длина провода зависит от расстояния от шельфа в инкубаторе, где будет храниться клетки, блока питания, за пределами инкубатора (рис. 1 d). - Отрегулируйте дозировку (напряжения) и режим приблиз доставлены клетки путем регулирования питания постоянного тока.
- Включите блок питания, нажав на кнопку Включения/выключения на передней панели. Активируйте канал 1, нажав кнопку 1.
- Нажмите кнопку Nr. 4 (V-набор) для установки напряжения. Пресс кнопки 2, . и 5 , чтобы задать выходной нагрузки на 2.5 V. Нажмите клавишу Enter.
- Убедитесь, что выход нагрузки 2.5 V (2500 МВ) соответствует приблиз 100 МВ/мм, согласно следующим, упрощенный уравнение.
V Приблиз =
; или
V = Vприблиз × d
Здесь, V = напряжение питания выход в милливольтах; d = расстояние между электродами в миллиметрах; V Приблиз = стимуляции напряжения в милливольтах на миллиметр.
Примечание: Это упрощение применяется только в случае постоянного напряжения постоянного тока. Сопротивление между средой и клетки незначительна, как электроды находятся не в прямой контакт с клетками; Вместо этого клетки через посредство доставляется приблиз.
; или2. мезенхимальных стволовых клеток культуры в остеогенном среднего
- Покупка и хранения MSCs коммерчески доступных крыса (смотрите Таблицу материалы) в жидком азоте до дня проведения эксперимента. Кроме того изолировать MSCs от других животных согласно протоколов опубликованы в другом месте8 7,в соответствии с местной институциональные правила для использования экспериментальных животных.
- В день эксперимента удалить один флакон (1 х 106 клеток) MSCs из хранения жидкого азота и быстро (в течение 1 мин) размораживать клетки на водяной бане, разогретую до 37 ° C.
- В стерильных условиях в Ламинарный шкаф Пипетка содержимое флакона в 50 мл трубки сокола и добавить 9 мл обычной среды (Нм) разогретую до 37 ° C, состоящий из среднего Дульбекко изменение орла (DMEM; 1 x) с 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% раствора пенициллина/стрептомицина. Пелле клетки для 5 мин центрифугированием при 300 x g.
- Ламинарный шкаф удалить супернатант и тщательно Ресуспензируйте Пелле клеток в 12 мл Нм подогретую до 37 ° C. Ресуспензированы клетки перехода к колбе культуры клеток T-75.
- Культура клетки при 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 до тех пор, пока они достигают слияния 80 – 90% (после приблизительно 3-5 дней).
- Проход клетки.
Примечание: Все операции за исключением центрифугирования и инкубации в стерильных условиях в Ламинарный шкаф.- После достижения 80 – 90% слияния, получить клетки клетки отряд раствором. Аспирационная среднего культуры клеток, мыть 2 x 1 x фосфат амортизированное saline (PBS), добавить 5 мл 1 x мобильный отряд решение и вернуть клетки для инкубатора для 5 мин.
- После того, как отдельные клетки, добавьте равное количество питательной среды для инактивации отряд решение. Собрать клетки в 50 мл трубки сокола и спина их на 300 x g за 5 мин.
- Отказаться от среднего и Ресуспензируйте клеток в 1 мл свежей нормальной среды. Оцените количество жизнеспособных клеток с Трипановый синий пятно.
- Семена, 1 x 106 клеток в новой T-75 колбу с 12 мл подогретую Нм. Культура клетки при 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 до тех пор, пока они достигают слияния 80 – 90%.
Примечание: Клетки пассированый (шаги 2.4.1–2.4.4) может повторяться несколько раз до тех пор, пока получено необходимое количество клеток. Не используйте старше проход 8 клеток.
- 4 клетки семян 9 x 10 в 3 мл Нм (10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным, пенициллин 1% / стрептомицина, DMEM) в каждой скважине пластины 6-ну культуры. Инкубируйте 1 день при 37 ° C, 5% CO2, 5% O2клетки.
- На следующий день, аспирационная питательной среды и применить 3 мл Остеогенные дифференциации среднего (ом; нормальный средний с 10-7 M дексаметазон, 10 мм β-метронидазол и 0,05 мм аскорбиновой кислоты-2-фосфат).
- Место пластину 6-колодец с ячейками в инкубаторе и инкубировать и при 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 на ночь.
3. Лечение MSCs с приблиз
- На следующий день клетки лечат приблиз стерилизуйте электродов в 70% этанола раствор для 30 мин; затем высушите их под ультрафиолетовым светом в безопасности кабинета для дополнительных 30 мин.
- В Ламинарный шкаф, крышка 6-ну содержащие культивировали MSCs с крышкой, с электродами, убедившись, что электроды полностью погружены в среде (если необходимо, добавьте среднего). Передать инкубатора покрыты пластины 6-ну (приблиз камеры) с клетками и подключите его провода к источнику питания.
- Установите блок питания 2,5 В выходной нагрузки и лечить клетки с приблиз для 1 h3,9.
- После стимуляции отключите блок питания и снимите камеру приблиз из инкубатора. В стерильных условиях обменять крышку с электродами с крышкой стандартной 6-ну пластины.
- Возвращение клетки в инкубаторе и оставить их на ночь. Очистите электроды, сначала с PBS и затем с 70% этанола раствор. Чистота продуктов накопленной коррозии от поверхности электрода с тонкой наждачной бумагой.
- Повторите шаги 3.1-3.5 для 6 дней подряд. День 4, перед применением приблиз и в стерильных условиях измените питательной среды, аспирационных 1,5 мл среды и заменив его с 1,5 мл подогретую свежие РЭ.
- После применения приблиз 7 дней подряд, сохранить клетки в культуре еще 7 дней, обмена носитель каждые 3 – 4 дня.
4. Остеогенные дифференциация измерения
- Анализ изменения морфологии клеток под микроскопом.
- Чтобы оценить влияние приблиз на Остеогенные дифференциация MSC, отложение кальция в меру, активность щелочной фосфатазы и остеогенном маркер экспрессии генов, как описано в других разделах3,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы оценить эффект 100 МВ/мм приблиз на Остеогенные дифференциация MSCs, клетках, обработанных с приблиз на 3, 7 и 14 дней или nontreated (управления) были проанализированы на 14 день культивирования путем оценки морфологических изменений и отложение кальция (Рисунок 2 ). Это было сделано путем визуализации ячейки, используя яркие поля микроскопии (морфология изменения) или фиксации клетки в параформальдегида 4% раствор, окрашивание их с 0,02% раствора ализарин красный и затем изображений их с помощью микроскопии ярко поле (отложение кальция анализ).
Подробный анализ Остеогенные маркер изменения выражения гена была исполнена на дня 3, 7 и 14 культивирования (рис. 3). Это было сделано путем измерения относительной экспрессии генов RunX2, коллаген I, Остеопоэтини Osterix с помощью RT-ПЦР и дельты сравнительный метод Ct (пороговые значения цикла)10, где Уборка генов Rplp1 и Ywhaz11 были использованы для нормализации.
Подвергая MSCs 100 МВ/мм приблиз на 3 дня (1 час в день) было никакого эффекта; Однако 7 дней воздействия привели к увеличению в остеогенном дифференциации, устанавливаемых изменений морфологии (рисунок 2A– C), отложение кальция (Рисунок 2E-G) и (изменения выражения гена Остеогенные маркер Рис. 3) по сравнению с соответствием время управления без приблиз. Длительное воздействие приблиз (14 дней) сделал не расширить Остеогенные дифференциация вне что видел после 7 дней лечения (Рисунок 2DH и рис. 3).
Как показано на рисунке 2, клетки лечат приблиз для 7 и 14 дней появился более конденсированных (рис. 2 cD) чем те, которые лечили приблиз на 3 дня или nontreated клетки (Рисунок 2аБ) и показал увеличение кальция осаждения (Рисунок 2 gH) по сравнению с теми лечить только для 3 дней или nontreated управления ()Рисунок 2EF). Анализ выражения Остеогенные маркер на 3, 7 и 14 дней культивирования подтвердил расширенной Остеогенные дифференциации в клетках, обработанных с приблиз на 7 и 14 дней (рис. 3). Выражение связанных с Остеогенные дифференциации маркер гены12RunX2, коллаген , я, Остеопоэтини Osterix были высокими в клетках, обработанных с приблиз на 7 дней.
Рисунок 1: Палата культуры клеток приблиз. (A) электрическая схема приблиз камеры показаны аноды (черный), катоды (красный), и светодиоды, подключен к источнику питания постоянного тока. (B) изображение заметно 6-ну пластина крышки и L-образный платиновыми электродами (вид снизу) включены в крышке 6-ну пластины. (C) собрал приблиз камеры (вид сверху) с разъемами, светодиоды и Электроизоляционные ленты, который защищает клетки от светодиодный свет (стрелки). (D) приблиз сотовый лечение установки с приблиз Камера в инкубаторе, подключен к источнику питания постоянного тока, на улице. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: влияние приблиз на MSC морфологии и кальция осаждений. Клетки в остеогенном питательной среды, воздействию и не подвергаются (элементы управления) до 100 МВ/мм приблиз на 3, 7 и 14 дней (1 час/день). (A-D) Морфология и (E–H) отложение кальция (ализарин красный окрашивание) на 14 день культивирования. Значительные изменения в ячейке морфологии и кальция вкладов были видны в клетки лечат приблиз (C и G) 7 и (D и H) 14 дней (10 крат; масштаб бар = 200 мкм). Эта цифра была изменена от Eischen-лож и др. 9. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Эффект приблиз на MSC Остеогенные маркер экспрессии гена. Остеогенные маркер экспрессии генов (измеряется с RT-ПЦР на дня 3, 7 и 14 культивирования) в клетках лечение приблиз на 3, 7 и 14 дней, или nontreated. (A) в день 7 культивирования, выражение RunX2 был значительно выше в клетках, обработанных с приблиз на 7 дней. (B) ColIa1 выражение был значительно выше в клетках, обработанных за 7 дней, на 14 день культивирования. (C) выражения Остеопоэтин значительно был увеличен в клетках, обработанных приблиз на дня 3, 7 и 14 культивирования. (D) Osterix выражение отсутствовал в управления клетки вообще время точек и был замечен только на 7 и 14 дней культуры в клетках подвергаются приблиз. Разные буквы на бары указывают на значительные различия (p < 0,05) между группами в то же время точкой. Звездочка указывает на существенные различия (p < 0,05) между моментами времени в рамках той же группы. Эта цифра была изменена Eischen-лож et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем строительной палаты и метод для лечения мезенхимальных стволовых клеток с приблиз, что приводит к расширенной Остеогенные дифференциации.
Приблиз установки представлены не требует специального оборудования/знаний и могут выполняться в лаборатории стандартного стволовых клеток биологии/Биохимия младших исследователей. Однако когда построение и использование камеры приблиз, особое внимание следует несколько важных шагов. При обработке платиновыми электродами, осторожность должны быть приняты как этот металл очень податливый и деликатный. В то время как другие металлы, такие как сталь или вольфрама, могут быть использованы, они не рекомендуются как они подвержены коррозии, которая может быть цитотоксических13. Кроме того как точно, как описано в протоколе, поскольку этот метод неоднократно испытаны и оказался эффективным в устранении проблем с загрязнением должны выполняться очистка и стерилизация крышку с электродами. Наконец, в то время как эта палата может использоваться для изучения других приблиз чувствительных клеток деятельности как миграции14,15, распространения, апоптоз16, клеточной мембраны напряжения17и эшафот адгезии19, Приблиз протокол мы описываем здесь (100 МВ/мм, 1 час в сутки, 7 дней) сосредоточены только на Остеогенные дифференциации в крыса MSCs. особого внимания следует, если выше напряжения (≥150 мВ/мм) и/или дольше длительности приблиз (> 4-5 ч) применяются с цитотоксическим продукты в результате электролиза могут накапливаться в среде. В этом случае средство необходимо тщательно контролируется и обменялись соответственно. Для изучения других параметров и/или другие типы клеток, мы рекомендуем, что отдельные дозы (напряжения) и режим титрования исследования как эти изменения могут повлиять на, как клетки реагируют на приблиз.
Возможные неисправности приблиз палаты может быть из-за перерывов в электрической схемы после многократного использования и может отслеживаться через добавлен Светодиодные лампы. В случае поломки (обозначается nonilluminated LED light[s]), крышку можно снять и легко разобрать для выявления и исправления перерыв. Кроме того простой дизайн приблиз камеры делает его легко изменить его в соответствии с потребностями различных экспериментальных установок и методы анализа. Примеры включают в себя использование различных размеров пластин культуры клеток, просто изменяя Длина и расстояние между электродами или Добавление условий различные культуры (3D) с керамической эшафот материала4 или токопроводящих подложках18, по просто поставив эти материалы семенами с ячейками между электродами.
Как и все эксперименты в лабораторных условиях, поведение клеток и функций наблюдается/наведено в зале приблиз не всегда непосредственно переданы в естественных условиях модели. Соответственно при интерпретации поведения/функции приблиз индуцированной клеток в камере, исследователи должны всегда учитывать это.
Установки и метод, представленные здесь имеют много преимуществ над другими в пробирке методы, используемые для разоблачить клетки приблиз (систем с мосты соли5 ) и систем с электродами, включены в ячейку культуры скважин19. Важным преимуществом системы, описанные здесь является, что, поскольку клетки культивировали в стандартной 6-ну пластин, они могут использоваться после приблиз лечения в другие протоколы, в естественных условиях или в пробирке. Кроме того тот факт, что электроды крепятся на крышке 6-ну пластины делает его легко чистить и стерилизовать устройства между эксперименты и повторно использовать его. Наконец способность одновременно стимулировать клетки в шести скважин обеспечивает обширный материал для анализа и воспроизводимость.
Чтобы получить более глубокое понимание механизмов на уровне клеточных мембран, в которой приблиз влияет на деятельность клеток в текущих исследованиях с использованием камеры описанных здесь, мы изучаем отношения между внешне приблиз и клеточной мембраны потенциал (memV)17. Кроме того на основе предыдущих результатов9, в будущем исследования, мы будет предварительной обработки клеток с приблиз в камере, в одиночку и с различными 3D подмостей и токопроводящих подложках, чтобы стимулировать функций конкретных клеток; Затем мы будет имплантировать их в животных моделей для определения, если они сохраняют наблюдаемое Расширение функций в естественных условиях. Эти исследования будут способствовать растущей органу информацию о механизмах, которые приблиз регулировать функции клеток и, поступая таким образом, могли бы способствовать оптимизации клетки терапии подходы в регенеративной медицине и на основе ткани Инжиниринг лечение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержали АО Фонд пособия (S-14-03 H) и Фонд Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim), базирующийся в Франкфурт-на-Майне, Германия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
