Summary
Här presenterar vi ett protokoll för byggandet av en cell kultur kammare för att exponera celler till olika typer av elektrisk stimulering, och dess användning vid behandling av mesenkymala stamceller för att förbättra osteogent differentiering.
Abstract
Mesenkymala stamceller/stromaceller (MSCs) har använts i stor utsträckning främja läkning i Vävnadsrekonstruktion metoder. Elektrisk stimulering (EStim) har visat sig öka MSC osteogent differentiering in vitro- och främja ben healing i kliniska inställningar. Beskriver här vi byggandet av en EStim cell kultur avdelningen och dess användning vid behandling av råtta ben-märg-härledda MSC att förbättra osteogent differentiering. Vi fann att behandling av MSCs med EStim för 7 dagar resulterar i en betydande ökning i osteogent differentiering, och viktigast av allt, denna pro-osteogent effekt kvarstår länge efter (7 dagar) EStim sätts. Detta tillvägagångssätt av förbehandling MSCs med EStim att förbättra osteogent differentiering kunde användas för att optimera benvävnad engineering behandlingsresultat och, således, hjälpa dem att uppnå sin fulla terapeutiska potential. Förutom denna ansökan, kan denna EStim cell kultur avdelningen och protokoll även användas att undersöka andra EStim-känsliga cell beteenden, såsom migration, proliferation, apoptos och byggnadsställning fastsättning.
Introduction
En ökning av trauma eller sjukdom-inducerad ben defekter behandlas med hjälp av olika kombinationer av cellterapi och regenerativ medicin-teknik. MSCs är cellen i val i sådana behandlingar, på grund av sin relativt höga osteogent aktivitet, isolering och expansion effektivitet och säkerhet1. För att maximera deras osteogent aktivitet och, således, optimera deras terapeutiska effektivitet, har flera metoder införts för att manipulera MSCs innan används i dessa behandlingar (som granskas av Mauney et al.2). En sådan metod är EStim, som har visat sig förbättra MSC osteogent differentiering i vitro3 och främja ben healing invivo4. Trots det växande antalet studier med fokus på behandling av MSCs med EStim, ännu en optimal regim för att maximera Estim's pro-osteogent effekt definieras.
Andra in vitro-metoder som använder EStim utnyttja salt broar nedsänkt i odlingsmediet, som separerar celler från metalliska elektroder5. Fördelen med detta är att leverera EStim igenom salt överbryggar eliminerar införandet av kemiska biprodukter (t.ex., korrosion av metalliska elektroder) som kan vara cytotoxiska. Trots denna fördel, salt broar är omständligt att arbeta med, och den EStim de levererar skiljer sig från att levereras i in vivo modeller, vilket gör det svårt att korrelera resultat när du använder de två systemen. Uppställningar som levererar EStim via metallic eller kol elektroder fast inuti cellen kultur brunnarna simulera (som granskas av Hronik-Tupaj och Kaplan6) bättre enheter används i vivo; emellertid, dessa enheter är svåra att rengöra/sterilisera mellan användningar och antalet celler som kan studeras per experiment är begränsad. Vi designade EStim kammaren presenteras här specifikt för att hantera begränsningar i dessa andra uppställningar. Medan de flesta av vår erfarenhet av att använda kammaren EStim har varit med 2D och 3D kulturer som innehåller benmärg - och adipose-vävnad-härledda MSCs3,4, en stor fördel med denna kammare är att den är mångsidig och, med små relativt förändringar, kan anpassas att studera andra celltyper under en mängd olika förhållanden.
Här beskriver vi byggandet av en EStim cell kultur kammare; sedan visar vi dess användning av behandlande MSCs med olika regimer av EStim och mäta den resulterande effekten på osteogent differentiering. MSC osteogent differentiering bedöms via kalcium nedfall, alkaliskt fosfatasaktiviteten och osteogent markör genuttryck. Allt observerat i tidigare experiment som används här installationen vi att dessa pro-osteogent effekter kvarstår långt efter EStim behandlingen avbröts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. konstruktion av elektrisk stimulering cell kultur avdelningen
- För att bygga EStim kammaren, samla två locken på standard 6-väl cell kultur plåtar. 99,99% platina tråd, 60 cm i längd med en diameter av 0,5 – 1 mm; Silver-överdragen koppartråd, 70 cm i längd med en diameter av 0,6 mm; Avbitartänger; lödkolv kit; en tub supraledande lim; en sladdkopplingsdonet kopplingsplint, sex små 2,2 V lysdioder (valfritt). en tub av galvaniserade silikon lim beläggning (valfritt). en rulle svart elektrisk isolering tejp; standard, flexibel, isolerad koppar elektrisk tråd (0,14 mm2), 2 m i längd (tabell material).
- I 6-well platta lock, mark och sedan borra två hål (med en diameter på ~ 1 mm) brunnar 25 mm mellanrum, nära den yttre kanten av varje av sex (12 hål totalt), som visas i figur 1A, B.
- Skär tolv 5 cm längder av platina tråd med Avbitartänger. Böja var och en av trådarna manuellt i en L-form, lämnar ena änden 3 cm lång och den andra 2 cm. skär silver-belagd tråd i två 35 cm längder.
- Längre (3 cm) böjd ände en platina tråd (från inne till ute) i varje borrade hål, lämnar 1 – 2 mm utskjutande från utsidan av locket, böja den med pincett. Säkra platina trådarna i locket hålen med supraledande lim och låt den torka i ca 6 h.
- Löda tips av alla sex platina ledningar (som kommer senare fungera som katoder, se figur 1A) sticker ut från locken till en silver-belagd sladdar. Upprepa samma procedur, lödning återstående sex platina kablarna (som senare kommer att fungera som anoder) till andra silver-belagd tråd.
- Lägg till lysdioder i kretsen mellan varje av de sex anod-katod platina elektrod paren, bekräfta funktionalitet under experimenten (valfritt). Placera en bit svart isoleringstejp under varje ledde till förhindra utsätta celler i kultur plattorna att LED-lampan (figur 1 c).
- Limma kopplingsplint kontakten till det övre vänstra hörnet av 6-well platta lock och Anslut båda silver-belagd sladdarna på ingångarna, som visas i figur 1 c.
- Klipp ut en 20 x 20 mm avsnitt från det övre vänstra hörnet av andra 6-well platta lock (figur 1B, locket Nr. 2) att rymma kopplingsplint kontakten på det första locket. Täcka det första lock, utrustade med elektroderna, med andra locket och tejpa dem tillsammans med tejp.
- För att förbättra limning av två locken, Använd silikon lim beläggning (valfritt). Till gör så, täcka locket med silver elektroderna med en 3 – 5 mm lager av silikon lim och täck den med andra locket, så att 12 h för limmet torka.
- Anslut ena änden av de två standard isolerade koppartrådar till output uttagen av kontakten och de andra ändarna till banan hankontakter (4 mm).
NOTE: Längden på dessa trådar beror på avståndet från hyllan i inkubatorn, där cellerna kommer att hållas, till strömförsörjningen, utanför inkubatorn (figur 1 d). - Justera doseringen (spänning) och regim av EStim levereras till cellerna genom att reglera DC strömförsörjningen.
- Slå på strömmen genom att trycka på ON/OFF -knappen på frontpanelen. Aktivera kanal 1 genom att trycka på knappen 1.
- Tryck på knapp Nr. 4 (V-set) ställa in spänningen. Tryck på knapparna 2, . och 5 att fastställa belastning utdata till 2,5 V. Tryck på RETUR.
- Säkerställa att lasten utdata 2,5 V (2,500 mV) motsvarar en EStim 100 mV/mm, enligt följande, förenklat ekvation.
V EStim =
; eller
V = VEStim × d
Här, V = nätspänningen utgång i millivolt; d = avståndet mellan elektroderna i millimeter; V EStim = stimulering spänningen i millivolt per millimeter.
Obs: Denna förenkling gäller endast vid konstant likspänning. Resistansen mellan mediet och cellerna är försumbar eftersom elektroderna inte är i direkt kontakt med celler; i stället levereras EStim till cellerna genom mediet.
; eller2. mesenkymala stamceller kultur i osteogent medium
- Köpa och förvara kommersiellt tillgängliga råtta MSCs (se Tabell för material) i flytande kväve tills dagen i experimentet. Alternativt, MSCs isolera från andra djur enligt protokoll publiceras någon annanstans7,8 i enlighet med lokala institutionella bestämmelser för användningen av försöksdjur.
- På dagen för experimentet, ta bort en injektionsflaska (1 x 106 celler) av MSCs från flytande kväve lagring, och snabbt (inom 1 min) Tina cellerna i ett vattenbad som förvärmts till 37 ° C.
- Under sterila förhållanden i en LAF och Pipettera injektionsflaska innehållet i en 50 mL falconrör och lägga till 9 mL normal medium (NM) föruppvärmd till 37 ° C, bestående av Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM; 1 x) med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin lösning. Pellet cellerna för 5 min genom centrifugering vid 300 x g.
- I en LAF, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten noggrant i 12 mL nm föruppvärmd till 37 ° C. Överföra de återsuspenderade cellerna till en T-75 cell kultur kolv.
- Odla cellerna vid 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 tills de når en 80 – 90% sammanflödet (efter cirka 3 – 5 dagar).
- Passagen cellerna.
Obs: Utför alla åtgärder utom centrifugering och inkubering under sterila förhållanden i en LAF.- Efter att ha nått en 80 – 90% sammanflödet, Hämta cellerna med cell avlossning lösning. Aspirera i cellodlingsmedium, tvätta 2 x med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt 5 mL av 1 x cell avlossning lösning och återgå cellerna till inkubatorn för 5 min.
- När cellerna är fristående, lägga till en lika stor mängd odlingssubstrat att inaktivera avlossning lösningen. Samla in cellerna i ett 50 mL falconrör och snurra dem vid 300 x g i 5 min.
- Kassera mediet och resuspendera cellerna i 1 mL färsk normal medium. Bedöma antalet livskraftiga celler med trypan blå fläck.
- Frö 1 x 106 celler i en ny T-75 kolv med 12 mL förvärmd nm. Odla cellerna vid 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 tills de når en 80 – 90% sammanflödet.
Obs: Kan cellen passaging (steg 2.4.1–2.4.4) upprepas ett par gånger tills det nödvändiga antalet celler erhålls. Använd inte äldre än passage 8 celler.
- Utsäde 9 x 104 celler i 3 mL NM (10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum, 1% penicillin/streptomycin, DMEM) i varje brunn 6-väl kultur platta. Inkubera cellerna i 1 dag vid 37 ° C, 5% CO2, 5% O2.
- Nästa dag, aspirera odlingsmedium och applicera 3 mL osteogent differentiering medium (OM; normal medium kompletteras med 10-7 M dexametason, 10 mM β-glycerofosfat och 0,05 mM askorbinsyra-2-fosfat).
- Placera 6-väl plattan med celler i inkubatorn och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 över natten.
3. behandling av MSCs med EStim
- Den dagen cellerna behandlas med EStim, sterilisera elektroderna i 70% etanol lösning för 30 min; sedan torka dem under UV-ljus i ett säkerhetsskåp för en ytterligare 30 min.
- I en LAF, täcka 6-väl plattan som innehåller de odlade MSCs med locket utrustad med elektroderna, att se till att elektroderna är helt nedsänkt i medium (om det behövs, tillsätt medium). Överföra 6-väl täckt plattan (EStim avdelningen) med celler till inkubatorn och Anslut dess ledningar till strömförsörjningen.
- Ställ in strömförsörjningen till 2,5 V belastning utgång och behandla cellerna med EStim för 1 h3,9.
- Efter stimulering, nätdelen och avlägsna EStim kammaren från inkubatorn. Under sterila förhållanden och utbyta locket utrustad med elektroder med 6-väl Kantbockade lock.
- Återgå cellerna till inkubatorn och lämna dem över natten. Ren elektroderna, först med PBS och sedan med 70% etanol lösningen. Ren de ackumulerade korrosionsprodukterna från elektrod ytan med fint sandpapper.
- Upprepa steg 3,1 – 3,5 6 dagar. Dag 4, innan du tillämpar EStim och under sterila förhållanden och ändra odlingsmediet genom aspirera 1,5 mL medium och ersätta den med 1,5 mL förvärmd färska OM.
- Efter att tillämpa EStim 7 dagar, upprätthålla celler i kultur ytterligare 7 dagar, utbyte av medlet var 3 – 4 dagar.
4. osteogent differentiering mätningar
- Analysera morfologi cellförändringar under ett mikroskop.
- För att bedöma effekten av EStim på MSC osteogent differentiering, åtgärd kalcium nedfall, alkaliskt fosfatasaktiviteten och osteogent markör genuttryck, som beskrivs på andra ställen3,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera effekten av 100 mV/mm för EStim på osteogent differentiering av MSCs celler behandlas med EStim för 3, analyserades 7, och 14 dagar eller nontreated (kontroll) dag 14 av odling genom att bedöma morfologiska förändringar och kalcium nedfall (figur 2 ). Detta skedde genom imaging celler med ljusa fält mikroskopi (morfologi ändringar) eller genom fastställande celler i 4% PARAFORMALDEHYD lösning, färgning dem med 0,02% alizarin röd lösning och sedan imaging dem med ljusa fält mikroskopi (kalcium nedfall analys).
En detaljerad analys av osteogent markör gen uttryck förändringar utfördes på dagar 3, 7 och 14 i odling (figur 3). Detta gjordes genom att mäta den relativa uttrycket av gener RunX2, kollagen I, Osteopontinoch Osterix med hjälp av RT-qPCR och jämförande deltan Ct (cykel tröskelvärden) metod10, där städning gener Rplp1 och Ywhaz11 användes för normalisering.
Utsätta MSCs till 100 mV/mm för EStim i 3 dagar (1 h per dag) hade ingen effekt; men resulterade 7 dagar efter exponering i en ökning osteogent differentiering, som bestäms av morfologi förändringar (figur 2A– C), kalcium nedfall (figur 2E– G) och osteogent markör gen uttryck förändringar ( Figur 3) i jämförelse med en tidsmatchade kontroll utan EStim. Långvarig EStim exponering (14 dagar) inte ytterligare förbättra osteogent differentieringen okända som ses efter 7 dagars behandling (figur 2DH och figur 3).
I figur 2visas celler behandlas med EStim för 7 och 14 dagar verkade mer kondenserad (figur 2 cD) än de som behandlades med EStim för 3 dagar eller nontreated celler (figur 2AB) och visade en ökad kalcium nedfall (figur 2 gH) jämfört med dem som behandlas för endast 3 dagar eller nontreated kontroller ()figur 2EF). Analys av uttrycket osteogent markör vid 3, 7 och 14 dagars odling bekräftade den förbättra osteogent differentieringen i celler behandlas med EStim för 7-14 dagar (figur 3). De uttryck för osteogent-differentiering-relaterade markör gener12RunX2, kollagen jag, Osteopontinoch Osterix var den högsta i celler behandlas med EStim för 7 dagar.
Figur 1: EStim cell kultur avdelningen. (A) elektriska kopplingsschemat EStim kammaren visar anoderna (svart), katoder (röd) och lysdioder ansluten till DC strömförsörjning. (B) bilden av den markerade 6-well platta lock och L-formad platina elektroder (underifrån) införlivas med 6-väl pläterar locket. (C) monteras EStim kammare (ovanifrån) med sladdkopplingsdonet, lysdioder och elektrisk isoleringstejp som skyddar cellerna från LED-lampan (pilar). (D) EStim cell behandling setup med EStim kammaren i inkubatorn ansluten till DC strömförsörjning, på utsidan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: effekt av EStim på MSC morfologi och kalcium nedfall. Celler i osteogent odlingsmedium, utsatt och inte exponerade (kontroller) till 100 mV/mm för EStim för 3, 7 och 14 dagar (1 h/dag). (A–D) Morfologi ochE–Hkalcium nedfall (alizarin röda färgning) på dag 14 av odling. Betydande förändringar i cell morfologi och kalcium inlåning var synliga i celler behandlas med EStim för (C och G) 7 och (D och H) 14 dagar (10 x förstoring; skalstapeln = 200 µm). Denna siffra ändrades från Eischen-Loges et al. 9. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekt av EStim på MSC osteogent markör genuttryck. Osteogena markör genuttrycket (mätt med RT-qPCR dagar 3, 7 och 14 i odling) i celler behandlas med EStim för 3, 7 och 14 dagar, eller nontreated. (A) vid dag 7 av odling, RunX2 uttrycket var signifikant högre i celler behandlas med EStim för 7 dagar. (B), det ColIa1 uttrycket var betydligt högre i celler som behandlas i 7 dagar, mätt vid dag 14 av odling. (C), uttryck av Osteopontin ökades betydligt i EStim-behandlade celler dagar 3, 7 och 14 i odling. (D), det Osterix uttryck var frånvarande i kontroll celler vid alla tidpunkter och sågs endast vid 7 och 14 dagar av kultur i celler utsätts för EStim. Olika bokstäver på staplarna anger signifikant (p < 0,05) skillnader mellan grupper vid samma tid punkt. Asterisken indikerar signifikant (p < 0,05) skillnader mellan tidpunkter inom samma grupp. Denna siffra ändrades från Eischen-Loges et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi byggandet av en kammare och en metod för behandling av mesenkymala stamceller med EStim som resulterar i förbättrad osteogent differentiering.
EStim installationen presenteras kräver inte speciell utrustning/kunskap och kan utföras i ett standard stamcell biologi/biokemi laboratorium av juniora forskare. Dock när bygga och använda EStim kammaren, måste särskild försiktighet iakttas i några kritiska steg. Vid hantering av platina elektroderna, måste extra vara försiktig eftersom denna metall är mycket formbara och delikat. Medan andra metaller såsom stål eller volfram, kan användas, rekommenderas dessa inte som de är utsatta för korrosion, vilket kan vara cytotoxiska13. Rengöring/sterilisera locket med elektroderna måste också utföras så exakt som beskrivs i protokollet eftersom denna metod har testats flera gånger och visat sig vara effektiva för att eliminera problem med kontaminering. Slutligen, medan denna kammare kunde användas för att studera andra EStim-känsliga cell aktiviteter som migration14,15, spridning, apoptos16, cellmembranet spänningar17och schavotten vidhäftning19, den EStim protokollet beskriver vi här (100 mV/mm, 1 tim/dag, 7 dagar) enbart fokuserat på osteogent differentiering i råtta MSCs. särskild uppmärksamhet bör ägnas om högre spänningar (≥150 mV/mm) och/eller längre löptider EStim (> 4-5 h) tillämpas eftersom cytotoxiska produkter följd av elektrolys kan ansamlas i mediet. I det här fallet måste mediet noga övervakas och utbyts med detta. För att studera andra parametrar och/eller andra celltyper och villkor, rekommenderar vi att separata dosering (spänning) och regim titrering studier utföras eftersom ändringarna kan påverka hur celler svarar på EStim.
Eventuella funktionsstörningar i EStim kammaren kan bero på avbrott i den elektriska kretsen efter upprepad användning och kan övervakas via de extra LED-lamporna. Vid brott (indikeras av nonilluminated LED light[s]), locket kan tas bort och enkelt demonteras för att identifiera och reparera avbrottet. Dessutom, gör den enkla konstruktionen av EStim kammaren det enkelt att ändra den enligt behoven hos olika försöksuppställningar och metoder för analys. Exempel med olika storlekar på cell kultur plattor, genom att helt enkelt varierande längd och avståndet mellan elektroderna eller lägga till olika (3D) odlingsbetingelser med keramiska scaffolden materiell4 eller ledande substrat18, av helt enkelt placera dessa material som ympats med celler mellan elektroderna.
Liksom alla in vitro-experiment, cell beteenden och funktioner är observerade/inducerad i EStim kammaren inte alltid direkt överförbar till invivo modeller. Följaktligen, när man tolkar de EStim-inducerad cell beteenden/funktionerna i kammaren, forskare måste alltid beakta detta.
Inställning och metoden som presenteras här har många fördelar jämfört med andra in vitro-metoder som används för att exponera celler till EStim (system med salt broar5 ) och system med elektroder som införlivas i cell kultur brunnar19. En viktig fördel med det system som beskrivs här är att, eftersom cellerna odlas i standard 6-bra plattor, kan de användas efter EStim behandling i andra in vivo eller in vitro-protokoll. Det faktum att elektroderna är fasta på locket till 6-väl plattan gör det dessutom lätt att rengöra och sterilisera enheten mellan experiment och att återanvända den. Slutligen, förmågan att samtidigt stimulera celler i sex brunnar ger gott om material för analys och reproducerbarhet.
För att få en bättre förståelse av mekanismerna på cellulära membran nivå som påverkar EStim cell aktiviteter i pågående studier med kammaren beskrivs här, undersöker vi förhållandet mellan externt levereras EStim och cellmembranet potentiella (Vmem)17. Dessutom, kommer att baserat på tidigare resultat9, i framtida studier, vi förbehandla cellerna med EStim i kammaren, ensam och med olika 3D ställningar och med ledande substrat, att stimulera särskilda cellfunktioner; sedan kommer vi implantatet dem i djurmodeller att avgöra om de behåller de observerade förbättrade funktionerna i vivo. Dessa studier kommer att bidra till den växande mängden information om mekanismerna genom vilka EStim reglera cellernas funktion och, därigenom kan bidra till att optimera cell terapi metoder inom regenerativ medicin och tissue-teknik-baserade behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av ett AO Foundation startpeng (S-14-03 H) och stiftelsen Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) är baserat i Frankfurt am Main, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
