Summary
Burada çeşitli elektriksel stimülasyon ve Osteojenik farklılaşma geliştirmek için mezenkimal kök hücre tedavisinde kullanımı yapan hücreleri göstermek için tasarlanmış bir hücre kültürü odası yapımı için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Mezenkimal kök/stromal hücreler (MSCs) kapsamlı yaklaşımlar mühendislik dokusunda kemik iyileşmesine katkıda bulunmak üzere kullanılmaktadır. Elektriksel stimülasyon (EStim) kemik klinik ayarlarında şifa teşvik ve MSC Osteojenik farklılaşma tüp bebek artırmak için gösterilmiştir. Burada biz bir EStim hücre kültürü odası İnşaatı tarif ve tedavisinde kullanımı sıçan kemik iliği türevi MSC Osteojenik farklılaşma geliştirmek için. MSCs EStim ile 7 gün süreyle tedavi Osteojenik farklılaşma önemli bir artış sonuçlanır ve önemlisi, uzun (7 gün) EStim kesilir sonra bu pro osteojenik etkisi devam ederse bulduk. Bu yaklaşım ile EStim Osteojenik farklılaşma geliştirmek için MSCs pretreating, tedavi sonuçları mühendislik kemik dokusu optimize etmek ve böylece, onlara tam terapötik potansiyellerini elde etmenize yardımcı için kullanılabilir. Bu uygulamanın yanı sıra, bu EStim hücre kültürü odası ve iletişim kuralı da geçiş, nükleer silahların yayılmasına karşı apoptozis ve iskele eki gibi diğer EStim duyarlı hücre davranışlar araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Travma ve/veya hastalık kaynaklı kemik defektleri artış hücre tedavisi ve rejeneratif tıp teknolojileri farklı kombinasyonları kullanarak tedavi. MSCs onların nispeten yüksek osteojenik etkinlik, yalıtım ve genişleme verimlilik ve güvenlik1nedeniyle bu tür tedavi seçiminde hücreyiz. Osteojenik faaliyetlerini en üst düzeye çıkarmak ve böylece, tedavi edici etkinliği onların en iyi duruma getirmek için çeşitli Yöntemler (Mauney ve ark.2tarafından gözden olarak) önce bu tedaviler kullanımları MSCs işlemek için getirilmiştir. Bir tür vitro3 MSC Osteojenik farklılaşma geliştirmek ve kemik içinde vivo4şifa teşvik için gösterilen EStim yöntemdir. MSCs EStim ile tedavi üzerinde odaklanan çalışmalar giderek artan sayıda rağmen EStim'ın pro osteojenik etkisi maksimize etmek için en uygun bir rejimi henüz tanımlanması gerekir.
EStim kullanarak diğer tüp bebek yöntemleri tuz köprüleri hücreleri metalik elektrotlar5' ten ayıran kültür orta sular altında kullanmak. Bunun yararı EStim tuz köprüler teslim sitotoksik olabilir kimyasal yan (Örneğin, korozyon metalik elektrot) getirilmesi ortadan kaldırır olduğunu. Bu avantaj rağmen tuz köprüleri ile çalışmak için hantal ve dağıttıkları EStim iki sistem kullanırken elde edilen sonuçlar ilişkilendirmek üzere o içinde teslim edilen içinde vivo modellerden farklıdır. Hücre kültür kuyu içinde sabit metalik veya karbon elektrotlar ile EStim teslim kurulumları (Hronik-Tupaj ve Kaplan6tarafından gözden olarak) daha iyi vivo içinde kullanılan aygıtlar simülasyonu; Ancak, bu cihazların temiz/kullanır arasında sterilize etmek zor ve deney okudu hücre sayısı sınırlıdır. Burada özellikle bu diğer ayarlar sınırlamaları gidermek için sunulan EStim odası dizayn ettik. Çoğu bu EStim odası kullanarak deneyimi ile 2D ve 3D kültürler, kemik iliği ve yağ-doku-kaynaklı MSCs3,4içeren bir önemli yararı bu odası bu iken bu çok yönlü ve, nispeten küçük değişiklikleri, diğer hücre tipleri farklı koşullarda çeşitli altında çalışmaya adapte olabilir.
Burada biz bir EStim hücre kültürü odası İnşaatı tarif; o zaman, biz kullanımı EStim ve Osteojenik farklılaşma ortaya çıkan etkisini ölçme farklı rejimleri ile tedavi MSCs tarafından göstermek. MSC Osteojenik farklılaşma kalsiyum birikimi, alkalen fosfataz aktivitesi ve osteojenik marker gen ekspresyonu ile değerlendirilir. Önemlisi, bu kurulum programı, kullanılan deneyler biz uzun EStim tedavi kesildi sonra bu pro osteojenik efektleri geçerli gözlenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. inşaat elektrik stimülasyonu hücre kültürü odası
- EStim odası kurmak için Standart 6-şey hücre kültür plakaların iki kapakları toplamak; % 99.99 platin tel, 60 cm çapında uzunluğu 0,5-1 mm; gümüş kaplı bakır tel, 70 cm 0.6 mm çapında uzunluğundadır; kesmek kerpeteni; Havya Seti; bir tüp dinamiğinin tutkal; bir kablo terminal bloğu bağlayıcı, (isteğe bağlı); altı küçük 2,2 V LED bir tüp küflenmez silikon yapıştırıcı kaplama (isteğe bağlı); bir rulo siyah elektrikli yalıtım bant; Standart, esnek, bakır elektrik tel (0.14 mm2), 2 m uzunluğunda (tablo malzemelerin) izole.
- 6-şey plaka kapak, mark ve sonra matkap iki delik (~ 1 mm çaplı), 25 mm ayrı, her altı dış kenarı 1A, B şekilgösterildiği gibi (Toplam 12 delikli), Kuyu yapımı.
- On iki 5 cm uzunlukta platin tel kesme pense ile kesti. Tel el ile şekle bir L-bir ucundan 3 cm uzunluğunda bırakarak, her viraj ve diğer 2 cm. iki 35 cm boy içine gümüş kaplı tel kesme.
- Bir platin kablo daha uzun (3 cm) bükülmüş ucunu bağlayın (--dan iç dışarı) her delinmiş deliğe forseps kullanarak viraj 1-2 mm kapak, dışarıdan çıkıntılı bırakarak. Platin tel dinamiğinin tutkal ile kapak delik güvenli ve yaklaşık 6 h kurumaya bırakın.
- İpuçları (Bu daha sonra katotlar hizmet, 1A anlamayagörmek) tüm altı platin tel lehim gümüş kaplı teller birine kapakları çıkıntılı. (Daha sonra anotlar görev yapacak) kalan altı platin teller lehim aynı işlemi diğer gümüş kaplı tel için tekrarlayın.
- LED devre her işlevsellik (isteğe bağlı) deneyler sırasında onaylamak için altı anot-katot platin elektrot çiftleri arasında ekleyin. Siyah izolasyon bandı her kültür tabakaları bana LED ışık (Şekil 1 c) hücrelerde maruz önlemek için liderliğindeki altında bir parça yerleştirin.
- 6-şey plaka kapak sol üst köşesine tel terminal bloğu konektöre tutkal ve her iki gümüş kaplı teller Şekil 1 cgösterildiği gibi giriş terminallere bağlayın.
- Bir ikinci 6-şey plaka kapak (Şekil 1B, kapak Nr. 2) ilk kapak terminal bloğu konektörüne karşılamak için bir 20 x 20 mm bölümünü sol üst üzerinden kesip. İlk kapağı ikinci kapak ile elektrotlar ile donatılmış, kapak ve yapışkan bant ile birlikte bant.
- İki kapak yapıştırma geliştirmek için (isteğe bağlı) kaplama silikon yapıştırıcı kullanın. Bunu yapmak için kapak silikon yapıştırıcı 3-5 mm tabakası ile gümüş elektrotlar ile kapak ve kuruması yapıştırıcı için 12 h sağlayan diğer kapak ile yeterli.
- Bir ucunu iki standart yalıtılmış bakır tel tel bağlayıcı ve muz erkek Rakorlar (4 mm) diğer biter çıkış terminallere bağlayın.
Not: Nerede hücreleri, güç kaynağı, inkübatör (Şekil 1 d) dışında için tutulacaktır mesafe kuluçka raf bu kabloların uzunluğu bağlıdır. - Doz (gerilim) ve DC güç kaynağı düzenleyerek hücrelere teslim EStim rejimi ayarlayın.
- Güç kaynağı ön panelde ON/OFF düğmesine basarak kapatın. Kanal 1 buton 1basarak etkinleştirin.
- Gerilim ayarla düğmesini Nr. 4 (V-set) tuşuna basın. Basın düğmeleri 2, . ve yük çıkış 2.5 V. basın Enterayarlamak için 5 .
- 2,5 V yük çıkışını sağlamak (2.500 mV) 100 mV/mm, bir EStim için aşağıdaki, Basitleştirilmiş denklem göre karşılık gelir.
V EStim =
; veya
V = VEStim × d
Burada, V = millivolts; çıkış güç besleme gerilimi d = milimetre; elektrot arasındaki mesafe V EStim stimülasyon gerilim Milivolt olarak milimetre başına =.
Not: Bu basitleştirme yalnızca sabit DC voltaj durumunda geçerlidir. Elektrotlar hücreleri ile doğrudan temas değildir olarak orta ve hücreler arasında direnç düzeydedir; Bunun yerine, EStim hücreleri vasıtasıyla teslim edilir.
; veya2. osteojenik orta mezenkimal kök hücre kültüründe
- Satın almak ve ticari olarak mevcut fare MSCs ( Tablo malzemelerigörmek) sıvı azot içinde deneme güne kadar saklayın. Alternatif olarak, izole MSCs protokolleri göre diğer hayvanlardan başka bir yerde7,8 deneysel hayvan kullanımı için yerel kurumsal düzenlemelerine uygun olarak yayınlandı.
- Deneme günü, bir şişe (1 x 106 hücreler) MSCs sıvı azot depolama biriminden çıkarın ve hızlı bir şekilde (1 içinde) 37 ° C'ye ısıtılmış bir su banyosu hücrelerde tezcan
- Steril koşullarda laminar akış başlıklı 50 mL şahin tüp içine şişe içeriği pipette ve % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 ile 9 mL normal Orta (NM) 37 ° C, Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM; 1 x) oluşan prewarmed ekleyin penisilin/streptomisin çözüm. 5 min için hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x gde cips.
- Laminar akış başlıklı süpernatant kaldırmak ve dikkatle 37 ° C'ye prewarmed NM 12 ml hücre Pelet resuspend Resuspended hücreleri bir T-75 hücre kültür şişesi aktarın.
- (Yaklaşık 3-5 gün sonra) bir % 80-%90 izdiham ulaşana kadar 37 ° C, % 5 CO2, %5 O2 hücre kültür.
- Hücreleri geçiş.
Not: bir laminar akış mahallede Santrifüjü ve steril koşullarda kuluçka hariç tüm işlemleri gerçekleştirir.- Bir % 80-%90 izdiham ulaştıktan sonra hücre hücre dekolmanı çözümü ile almak. Hücre kültür orta Aspire edin, 2 x 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın, 5 mL 1 x hücre dekolmanı çözümü ekleyin ve 5 min için kuluçka hücreleri geri dönün.
- Sonra hücreleri ayrılır, kültür dekolmanı çözüm devre dışı bırakabilirsiniz için orta eşit miktarda ekleyin. 50 mL şahin tüp hücrelerde toplamak ve onları vasıl 300 x g 5 min için spin.
- Orta atın ve 1 mL taze normal Orta hücrelerde resuspend. Trypan mavi leke ile hücrelerin sayısını değerlendirmek.
- 1 x 106 hücre içinde yeni bir T-75 şişesi 12 mL prewarmed NM ile tohum. Onlar bir % 80-%90 izdiham ulaşana kadar 37 ° C, % 5 CO2, %5 O2 hücre kültür.
Not: hücre gerekli sayısı elde edilir kadar hücre passaging (adımları 2.4.1–2.4.4) bir kaç kez tekrar edilebilir. Hücreleri geçiş 8 büyük kullanmayın.
- Tohum 9 x 104 NM (% 10 ısı inaktive fetal Sığır serum, % 1 penisilin/streptomisin, DMEM) 6-şey kültür plaka her iyi 3 mL hücrelerde. Hücreleri 37 ° C, % 5 CO2, %5 O21 gün kuluçkaya.
- Ertesi gün, kültür orta Aspire edin ve Osteojenik farklılaşma Orta (OM; normal Orta 10-7 M deksametazon, 10 mM β-gliserofosfat ve 0.05 mM askorbik asit-2-fosfat ile desteklenmiş) 3 mL uygulayın.
- 6-şey plaka hücrelerle da kuluçka makinesine koyun ve 37 ° C, % 5 CO2, %5 O2 bir gecede kuluçkaya.
3. tedavi MSCs ile EStim
- Hücreleri EStim ile tedavi edilir günde 30 dk için % 70 etanol çözümde elektrotlar sterilize; o zaman, UV ışığı bir güvenlik için ek bir 30 dk Kabin altında Kuru onları.
- Bir laminar akış başlık, elektrotlar tamamen ortamda batık emin elektrotlar ile donatılmış kapaklı kültürlü MSCs içeren 6-şey plaka kapak (gerekirse, orta ekleyin). Kuluçka makinesi için hücreleri ile kapalı 6-şey plaka (EStim odası) aktarmak ve onun teller güç kaynağını bağlayın.
- Güç kaynağı 2.5 V yük çıktısına ayarla ve 1 h3,9EStim hücrelerle tedavi.
- Stimülasyon sonra güç kaynağı bağlantısını kesin ve EStim odası da kuluçka kaldırın. Steril koşullarda, elektrotlar Standart 6-şey plaka kapak ile donatılmış kapak değişimi.
- Hücreleri için kuluçka dönün ve gece bırakın. Elektrotlar, ilk PBS ve daha sonra ile % 70 etanol çözüm temiz. Birikmiş korozyon ürünleri ince zımpara kağıdı ile elektrot yüzeyinden temizlemek.
- 3.1-3.5 6 gün boyunca yineleyin. Günde 4, EStim uygulamadan önce ve steril koşullarda kültür orta orta 1,5 mL alıyorum ve prewarmed taze OM 1,5 mL ile değiştirerek değiştirin.
- EStim 7 gün üst üste uygulandıktan sonra hücre kültüründe bir izleyen 7 gün boyunca orta her 3-4 gün alışverişi korumak.
4. Osteojenik farklılaşma ölçümleri
- Hücre morfolojisi değişiklikleri bir mikroskop altında analiz.
- Olarak EStim MSC Osteojenik farklılaşma, ölçü kalsiyum birikimi, alkalen fosfataz aktivitesi ve osteojenik marker gen ekspresyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için başka bir3,9bölümünde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
100 mV/mm EStim MSCs, hücreleri ile EStim 3 için tedavi Osteojenik farklılaşma üzerinde etkisini değerlendirmek için 7 ve 14 gün veya nontreated (kontrol) analiz tarafından değerlendirilmesi morfolojik değişiklikler ve kalsiyum birikimi (Şekil 2 kültür, 14 gün ). Bu parlak alan mikroskobu (morfoloji değişiklikleri) kullanarak hücreleri görüntüleme veya % 4 paraformaldehyde çözüm hücrelerde sabitleme, onları %0.02 alizarin kırmızı çözüm ile boyama ve sonra onları Imaging yapıldı parlak alan mikroskobu (kalsiyum birikimi kullanarak Analizi).
Osteojenik marker gen ifade değişiklikler ayrıntılı bir analizini gün 3, 7 ve 14 kodlamayla (Şekil 3) gerçekleştirildi. Bu genlerin RunX2göreli ifade, kollajen ben, Osteopontinve Osterix RT-qPCR ve karşılaştırmalı delta Ct (eşik döngüsü değerleri) yöntemi10, ölçerek yapıldı nerede temizlik genlerin Rplp1 ve Ywhaz11 normalleştirme için kullanılan.
MSCs 100 mV/mm için EStim 3 gün (günde 1 h) açığa bir etkisi olmadı; Ancak, morfoloji değişiklikleri (Şekil 2A-C), kalsiyum birikimi (Şekil 2E-G) ve osteojenik marker gen ifade değişiklik () tarafından belirlenen Osteojenik farklılaşma artış maruz kalma 7 gün sonuçlandı Şekil 3) zaman uyumlu denetim ile karşılaştırıldığında EStim olmadan. Uzun süre EStim maruz (14 gün) daha Osteojenik farklılaşma (Şekil 2BH ve Şekil 3) 7 gün sonra görülen ötesinde geliştirmek değil.
Şekil 2' de gösterildiği gibi hücreleri ile EStim 7 için tedavi ve 14 gün daha yoğun (Şekil 2CD) ile EStim 3 gün veya nontreated hücreler (Şekil 2AB) için tedavi daha ortaya çıktı ve bir artan kalsiyum gösterdi sadece 3 gün veya nontreated denetimleri (Şekil 2EF) için tedavi göre ifade (Şekil 2 gH)). Osteojenik marker ifade kültür 3, 7 ve 14 gün itibariyle analizini gelişmiş Osteojenik farklılaşma ile EStim 7 ila 14 gün (Şekil 3) için tedavi hücrelerdeki doğruladı. İfade işareti farklılaşma ile ilgili osteojenik genler12RunX2, kolajen ben, Osteopontinve Osterix en yüksek hücrelerdeki EStim ile 7 gün süreyle tedavi edildi.
Şekil 1: EStim hücre kültürü odası. (A)elektrik devre şeması anotlar (siyah), katotlar (kırmızı) gösterilen EStim odası ve DC güç kaynağına bağlı LED. (B) görüntü işaretli 6-şey tabak kapakları ve platin elektrotlar (alt görünümü) L şeklinde 6-şey plaka kapak dahil. (C) monte EStim tel bağlayıcı, LED ve LED ışık (oklar) hücrelerden kalkanlar elektrikli yalıtım bandı ile (yukarıdan) odası. (D) EStim tedavi kurulum DC güç kaynağı, dışarıdan bağlı kuluçka EStim odası ile hücre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: MSC Morfoloji ve kalsiyum birikimi EStim etkisi. Osteojenik kültür orta maruz ve değil maruz (denetimlere) 100 mV/mm EStim 3, 7 ve 14 gün (1 h/gün) hücreleri. (A-D) Morfoloji ve (E-H) (alizarin kırmızı boyama) kalsiyum birikimi kültür, 14 gün. Hücre morfolojisi ve kalsiyum mevduat önemli değişiklikler görünür hücreleri tedavi ile EStim (C ve G) ve (D ve 7 H) 14 gün (10 x büyütme; ölçek çubuğu 200 µm =). Bu rakam Eischen Loges. ark dan güncellenmiştir 9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Etkisi EStim MSC osteojenik marker gen ekspresyonu üzerine. (Gün 3, 7 ve 14 kültür, RT-qPCR ile ölçülen) osteojenik marker gen ekspresyonu hücrelerdeki ile EStim 3, 7 ve 14 gündür veya nontreated tedavi. (A)kültür, gün 7, önemli ölçüde daha yüksek RunX2 ifade ile EStim 7 gün süreyle tedavi hücrelerdeki. (B) ColIa1 ifade hücre kültürü çalışmalarının gün 14 ölçülen 7 gün süreyle tedavi anlamlı olarak daha yüksek. (C) Osteopontin ifade EStim tedavi hücrelerde gün 3, 7 ve 14 kültür, önemli ölçüde yükseltilmiştir. (D) Osterix ifade yok kontrol hücreleri her zaman puan ve sadece 7 ila 14 gün için EStim maruz hücrelerdeki kültürünün görüldü. Farklı harfler çubuklarında önemli gösterir (p < 0,05) farklılıklar aynı gruplar arasında zaman noktası. Yıldız işareti önemli gösterir aynı grup içindeki zaman noktaları arasındaki farklar (p < 0,05). Bu rakam Eischen Loges vd.9' dan güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir odası ve gelişmiş Osteojenik farklılaşma sonuçları EStim ile mezenkimal kök hücre tedavisi için bir yöntem açıklanmaktadır.
Sunulan EStim Kur özel ekipman/bilgi gerektirmez ve bir standart kök hücre biyolojisi/Biyokimya laboratuarında genç araştırmacılar tarafından gerçekleştirilebilir. Ancak, ne zaman bina ve EStim odası kullanarak, kritik bir kaç adımda özel bakım alınmalıdır. Bu metal çok yumuşak ve hassas olduğu gibi platin elektrotlar işlerken, ekstra bakım alınması gerekir. Diğer metaller, çelik veya akkor lamba ışığı, gibi-ebilmek var olmak kullanılmış iken, sitotoksik13olabilir korozyona karşı eğilimli oldukları gibi bunlar tavsiye edilmez. Ayrıca, bu yöntem defalarca test edilmiş ve kirlenme sorunları giderilmesinde etkili olduğu bulundu beri iletişim kuralında açıklandığı gibi tam olarak temizlik/sterilizasyon kapak elektrotlar ile gerçekleştirilmelidir. Son olarak, bu odayı, diğer eğitim için kullanılabilir gibi görünse EStim duyarlı hücre aktivitelerini gibi geçiş14,15, nükleer silahların yayılmasına karşı apoptozis16, hücre zarının gerilimleri17ve yapışma19, İskele yapısı- Biz tarif EStim protokolü yalnızca MSCs. özel dikkat-meli verilmek daha yüksek izin verirseniz sıçan Osteojenik farklılaşma odaklı burada (100 mV/mm, 1 h/7 gün) gerilimleri (≥150 mV/mm) ve/veya EStim uzun süreleri (> 4-5 h) beri sitotoksik ürünler uygulanır Elektroliz kaynaklanan ortamda birikebilir. Bu durumda, orta gerekir dikkatle izlenmeli ve buna göre değiş tokuş. Diğer parametreler ve/veya diğer hücre tipleri ve koşullar çalışmaya, dozaj (gerilim) ayrı tavsiye ve bu değişiklikleri nasıl hücreleri EStim için yanıt etkileyebilir gibi yürütülen rejimi titrasyon çalışmalar.
Olası arıza EStim TMMOB elektrik devresi içinde tatili nedeniyle sonra tekrar tekrar kullanımı olabilir ve eklenen LED lambalar ile izlenebilir. Kırılması durumunda (nonilluminated LED light[s]) tarafından belirtilen, kapağı olabilir kaldırılır ve kolayca tanımlamak ve aradan onarmak için demonte. Buna ek olarak, EStim odası basit tasarımı farklı deneysel kurulumları gereksinimlerine ve analiz yöntemleri göre değişiklik yapmak kolay yapar. Sadece uzunluğu ve elektrotlar veya ekleme farklı (3D) kültür koşullarını seramik iskele malzeme4 ya da iletken yüzeylerde18, ile arasındaki uzaklığı tarafından değiştirerek hücre kültür plakaların farklı boyutlarını kullanarak örnek verilebilir Sadece bu malzemelerin yerleştirme elektrot arasındaki hücreleri ile seribaşı.
Tüm tüp bebek deneyler, hücre davranışları ve işlevleri olduğu gibi gözlenen/indüklenen EStim odasında her zaman içinde vivo modellere doğrudan transfer edilebilir değildir. Buna göre EStim indüklenen hücre davranışları/fonksiyonlar odasında yorumlarken, araştırmacılar her zaman bu dikkate almak gerekir.
Kurulum ve burada sunulan Yöntem EStim (tuz köprüleri5 sistemleri) ve hücre kültür kuyu19' dahil elektrotlar ile sistemleri için yapan hücreleri göstermek için kullanılan diğer tüp bebek yöntemleri üzerinde pek çok avantajı var. Bir önemli burada açıklanan sistem hücreleri Standart 6-şey levha kültürlü, onlar diğer içinde vivo veya tüp bebek protokolleri EStim tedavi sonrası kullanılabilir, avantajdır. Buna ek olarak, elektrotlar 6-şey plaka kapak üzerinde sabitlenir aslında kolay temiz ve cihaz deneyler arasında sterilize ve kullanabilmek için yapar. Son olarak, aynı anda altı Wells hücreleri uyarmak için analiz ve tekrarlanabilirlik için yeterli malzeme sağlar.
Mekanizmaları tarafından EStim devam eden çalışmalar burada açıklanan odası kullanarak hücre aktivitelerini etkileyen hücre membran düzeyinde daha iyi anlaşılmasını sağlamak için biz ilişki harici olarak teslim edilen EStim ve hücre zarı arasında keşfetmek potansiyel (Vmem)17. Buna ek olarak, önceki bulgular9tarihinde, gelecek çalışmalar, temel EStim odasında yalnız ve ile farklı 3D iskele ve iletken yüzeylerde ile belirli hücre fonksiyonları uyarmak için hücrelerle pretreat; o zaman, onlara hayvan modelleri içine onlar gözlenen gelişmiş işlevler içinde vivo korumak belirlemek için implant. Bu çalışmalar hangi EStim tarafından mekanizmaları hakkında bilgi büyüyen vücut katkıda bulunacak ve hücre işlevi düzenleyen, bunu yaparken, hücre terapisi yaklaşımlar rejeneratif tıp ve doku mühendisliği-tabanlı en iyi duruma getirme için katkıda bulunabileceğini tedaviler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser kısmen bir AO Vakfı Start-Up hibe (S-14-03 H) ve Friedrichsheim Frankfurt am Main, Almanya tabanlı Vakfı (Stiftung Friedrichsheim) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
