Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En murine model af dengue virus-induceret akut viral encephalitis-lignende sygdom

doi: 10.3791/59132 Published: April 28, 2019

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at skabe en immun kompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model af centralnervesystemet infektion for at vise udviklingen af neuropati. Overvågning af akutte virale encephalitiske lidelser ved identiske sygdoms scorer kan udføres for at vise denguevirus-induceret neuropati in vivo.

Abstract

Dengue virus (DENV), en arthropod-bårne virus overføres af myg, kan forårsage alvorlig sygdom kendt som Dengue hæmoragisk feber, som er karakteriseret ved dødelige komplikationer på grund af plasma lækage, ascites, pleural effusion, åndedrætsbesvær, svær blødning og organ svækkelse. Et par tilfælde af DENV infektion nuværende neurologiske manifestationer; Men, undersøgelser har ikke udforsket DENV-induceret Neuro patogenese yderligere. I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol til at bruge en immun kompetent udvokset ICR (Institute of Cancer Research) mus til at undersøge induktion af centralnervesystemet (CNS) infektion med DENV, efterfulgt af progression af akut viral encephalitis-lignende Sygdom.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DENV, en arthropod-båret virus af Flaviviridae familien, indeholder et positivt-Sense RNA-genom, der koder tre virale strukturelle proteiner (capsid, premembran, og konvolut) og syv virale materialer proteiner (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B og NS5). De fire serotyper af DENV (DENV1-4), som inficere ca 390.000.000 mennesker årligt, forårsage en global byrde, selv om regeringerne har rettet betydelige bestræbelser mod myg vektor og sygdomskontrol1. I øjeblikket er beskyttende vacciner og terapeutiske antivirale lægemidler under udvikling og kræver yderligere langsigtet validering2. I klinisk praksis, selv om en dengue patient med CNS-infektion er sjælden, det skal udforskes yderligere for at forstå mangfoldigheden af dengue sygdomsudvikling3. Der er behov for yderligere undersøgelser og validering. især Verdenssundhedsorganisationen (WHO) har inkluderet involvering af CNS-svækkelse, såsom kognitiv svækkelse, kramper, encefalopati, og encephalitis, i klassificeringen af svær dengue3,4. Konstruere animalske modeller af DENV infektion er uundværlig for at udforske Neuro patogenesen af DENV infektion.

For at generere CNS-infektion med DENV, flere undersøgelser har henrettet forskellige ruter af DENV infektion, herunder (1) intracerebral inokulation af C57BL/6 mus, der modtog 4 x 103 plaque-Forming enheder (PFU) af ikke-tilpassede DENV35, 6, (2) intraperitoneal inokulering af Balb/c-mus, der fik 7 x 104 PFU af in vitro Neuro tilpasset DENV47, (3) intracerebral inokulation af schweiziske mus, der fik 1 x 105 PFU af in vivo neurotilpasset DENV18og (4) intracerebral og intraperitoneal Co-inoculation af ICR-patte-mus, som fik 1 x 106 PFU af ikke-tilpassede DENV29. Ifølge resultaterne af disse undersøgelser5,6,7,8,9, DENV infektion i mus resulterer i viral replikation i hjernen, fører til akut viral encephalitis-lignende syndromer, adfærdsmæssige ændringer ledsaget af lemmer lammelse og postural ustabilitet, CNS neurotoksicitet og inflammation, generel og lokaliseret plasma lækage gennem blod-hjerne barrieren (BBB), og dødelighed. Alle resultaterne fra disse undersøgelser5,6,7,8,9 har vist, at DENV er i stand til at inficere CNS og induktion af akut viral encephalitis-lignende sygdom efter infektion.

Baseret på vores nuværende resultater9,10,11,12,13,14,15, har vi skabt en murine model af DENV infektion som en in vivo platform til at undersøge den terapeutiske virkning af målrettede agenter/faktorer mod viral replikation, samt neurotoksicitet. Her rapporterer vi protokollen udnyttet til at oprette en immun kompetent udvokset ICR mus til at studere CNS-infektion og til at overvåge udviklingen af neuropatier med forskellige severiteter forårsaget af DENV. Resultaterne viser den signifikante progression af encephalitis-lignende sygdom i DENV-inficerede mus i en tidsafhængig måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Eksperimentelle protokoller af dyreforsøg blev godkendt af den institutionelle Animal Care og brugerudvalg af National Defense Medical Center (IACUC nummer: 16-261), ifølge retningslinjer fastlagt af Ministeriet for videnskab og teknologi, Taiwan.

1. infektion procedure

  1. Forbered ikke-tilpassede DENV2 (stamme PL046) aktier9 (oprindeligt opnået fra centre for Disease Control i Taiwan, spænder fra 2,5 x 107 til 1 x 109 PFU/ml).
  2. Fortynder virus bestanden til 1 x 106 PFU med Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium til et samlet volumen på 40 μl.
  3. Fyld en 0,3 mL sprøjte med en 30 G nål med 10 μL (2,5 x 105 PFU) fortyndet virus, og fyld en anden 0,3 ml sprøjte med en 30 g nål med 30 μl (7,5 x 105 PFU) fortyndet virus.
  4. Hold den 7 daggamle ICR patte Mouse og udføre følgende trin.
    1. For intracerebral injektion, hold musen i en udsat position ved at trykke på øremuslingen mellem pegefingeren og tommelfingeren, og intracerebralt injicere 10 μl fortyndet virus i lambda-området, det punkt i skæringspunktet mellem sagittale og lambdoid sutur 16.
    2. Efter intracerebral injektion, hold musen i en liggende position ved hjælp af pegefingeren og tommelfingeren og intraperitonealt injicere 30 μL fortyndet virus forsigtigt ind i murine abdomenl.
      Bemærk: for at undgå kannibalisme, 75% alkohol bruges til at skabe et midlertidigt tab af moderens olfaktoriske sensation. Derudover, dækker kuld med deres mors afføring og urin er foreslået.
  5. Læg de dieende mus tilbage i deres bure og vent i 5 minutter for at kontrollere deres sikkerhed post stimulation med aviditet af mus, herunder Walking og modermælk suger.
    Bemærk: Oftest, mus demonstrere normal aktivitet post stimulation og der synes ikke at være nogen skadelige virkninger efter den tekniske udfordring. Under dette eksperiment, blev dyrene vedligeholdt af den institutionelle Animal Care og brugerudvalg af National Defense Medical Center, Taiwan.
  6. Evaluer den daglige fremdrift af musene med hensyn til legemsvægt (ved hjælp af en mikrogram balance), akut viral encephalitis-lignende sygdom (ved sygdoms scoring som beskrevet i afsnit 2) og overlevelsesrate9,10,11 ,12,13,14,15.

2. sygdoms scoring

  1. Overvåge karakteren af akut viral encephalitis-lignende sygdomme. Tildel en score på 0 til raske mus; 1 til mus med mindre sygdomssymptomer, herunder vægttab, nedsat mobilitet, og en Klokkeren krop orientering; 2 til mus, der udviser limbiske beslaglæggelse; 3 til mus udviser limbiske svaghed, herunder bevæger sig med vanskeligheder og forreste lemmer eller bageste lemmer svaghed; 4 for lammelse; 5 for døden.
    Bemærk: Når score når 3, sygdomssymptomerne anses for at udvikle sig hurtigt.
  2. Afbild scoringen af sygdommen i henhold til trin 2,1 for hver dag som en kurve baseret figur ved hjælp af middelværdien ± SD af de daglige testresultater i hver gruppe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Svær dengue-associerede neurologiske komplikationer er blevet rapporteret hos patienter for dengue patogenese4. Selv om disse tilfælde er sjældne i klinikken, at skabe en immun kompetent murine model af DENV infektion kan bruges ikke kun til at studere immunopathogenesen, men også for at udforske CNS-infektion, neuroinflammation, neurotoksicitet, og akut viral encephalitis-lignende sygdom. I denne undersøgelse, i henhold til vores nuværende model9,10,11,12,13,14,15, 7 daggamle ICR patte mus blev inokuleret samtidig med DENV2 gennem en intracerebral mikroinjektion (2,5 x 105 PFU) og en intraperitoneal injektion (7,5 x 105 PFU) (figur 1). Efter infektion udførte vi talrige analyser for at vise tilstedeværelsen af dsRNA-replikation, viral protein ekspression og virus frigivelse i den DENV-inficerede hjerne9,10,11,12 ,13,14,15. Disse eksperimenter viste, at en vellykket in vivo model af DENV infektion, replikation, og frigivelse er blevet etableret.

For at evaluere induktion af akut viral encephalitis-lignende sygdomme9,10,11,12,13,14,15, overvågede vi ændringerne i kropsvægt i DENV-inficerede mus. Sammenlignet med ændringer i kropsvægten i mock-gruppen (hvor musene kun blev inokuleret med RPMI-medium) viser figur 2 en stigning i mock-gruppen, men en signifikant (P < 0,01) fald i legemsvægten hos de inficerede mus. Ifølge symptomerne på encephalitis-lignende sygdomme, herunder Klokkeren kropsholdning, limbiske beslaglæggelse, limbiske svaghed, lammelse, og død, som manifesteret i DENV-inficerede mus, figur 3 viser en signifikant (P < 0,05) stigning i klinisk score i de DENV-inficerede mus. Overlevelses analysen i figur 4 viser en tidsafhængig reduktion i overlevelsesraten (P < 0,001) af de DENV-inficerede mus. Dataene indikerer etableringen af en smitsom model af DENV i CNS, som viser progression af akut viral encephalitis-lignende sygdomme.

Figure 1
Figur 1: eksperimentel design for dengue virus (DENV) infektion i patte mus. Syv daggamle ICR-diende mus blev vaccineret med DENV2 PL046 ved samtidige intrakranielle injektioner. Vi målte ændringer i legemsvægt, sygdoms score og dødelighed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: legemsvægten i patte mus under infektion med dengue virus (DENV). I DENV2-inficerede ICR patte-mus (n = 12) blev ændringer i legemsvægten målt pr. dag. Efter en Wilcoxon signed-Rank-test præsenteres værdierne som middelværdien ± SD. * *p < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: den encephalitiske sygdom score i patte mus under dengue virus (DENV) infektion. Efter DENV2 infektion i ICR patte mus (n = 12), tids kinetiske ændringer i kliniske scores for Klokkeren kropsholdning (score 1), limbiske anfald (score 2), limbiske svaghed (score 3), lammelse (score 4), og død (score 5) blev målt. Efter en Wilcoxon signed-Rank-test præsenteres værdierne som middelværdien ± SD. *p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: overlevelsesraten i patte-mus under infektion med dengue virus (DENV). Tids kinetiske ændringer i overlevelsesrater blev målt i DENV2-inficerede ICR-patte mus (n = 12). Efter en log-Rank-test vises værdierne som middelværdien ± SD. * * *p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DENV infektion er blevet påvist i CNS af svær dengue patienter3,17, tyder på muligheden for manifestation af akut viral encephalitis opstod under dengue patogenesen. Her rapporterer vi en in vivo murine model af DENV infektion for at studere involvering af CNS dysfunktion i svær dengue, især med fokus på DENV-induceret akut viral encephalitis-lignende sygdomme. Sammenlignet med de tidligere modeller, især for en-Route-infektion (kun intravenøs, intraperitoneal eller kun intracerebral), udnyttes en ekstremt høj titer (1 x 108 PFU) af DENV i immunkompetente mus. Men, i immunkompromitterede mus, en relativt lav, men variant titer (1 x 105 til 1 x 108 PFU) af DENV kan udføres18,19,20. I denne undersøgelse, vi brugte to-Route infektion til at inducere samtidige CNS og systemisk infektion med en lav titer (intrakraniel: 2,5 x 105 PFU; itraperitoneal: 7,5 x 105 PFU) af DENV i immunkompetente ICR patte mus. Progression af encephalitis-lignende sygdom er fuldstændig reproducerbar9,10,11,12,13,14,15 . Den mulige begrænsning af denne undersøgelse er derfor afbødet ved hjælp af en samtidig intrakraniel og intraperitoneal injektion. Selv om det er kunstigt-dog i overensstemmelse med tidligere værker af andre5,6,7,8 og US9,10,11, 12,13,14,15-DENV er aktivt replikeret i den eksperimentelle murine hjernen9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15, og de mulige virkninger af virale faktorer og vært svar på neuroinflammation, samt neurotoksicitet, er derfor af interesse.

For Neuro patogenese udløses stimuleringen af neuronal celle apoptose af DENV-infektion samt betændelse i CNS, såsom mikroglial celle aktivering efterfulgt af proinflammatorisk cytokintumor nekrose faktor-α (TNF-α) produktion8, 12,15. Direkte neurotoksicitet forårsaget af DENV infektion og indirekte neuroinflammation initieret af Host immunrespons er spekuleret på at være involveret i dengue encephalitis. Akut viral encephalitis er forårsaget af virus-induceret CNS betændelse i hjernen3,21. Almindeligt forekommende kliniske symptomer er høj feber, hovedpine, stiv nakke og ryg, opkastning og forvirring, mens alvorlige tilfælde også udvikler krampeanfald, lammelse og koma21. Ved at overvåge ændringer i scores med Klokkeren kropsholdning, limbiske beslaglæggelse, limbiske svaghed, lammelse, og død, udviklingen af disse sygdomme viser progression af akut viral encephalitis-lignende sygdom i DENV-inficerede mus9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. generelt, de DENV-inficerede mus med en score på 3 (ifølge den sygdoms scoring metode præsenteret i protokollen) hurtigt skred til lammelse og død. De sygdomsfremkaldende mekanismer, som forårsager disse sygdomme, kræver yderligere undersøgelser. Men, det er spekuleret, at neuronal dysfunktion efterfulgt af neuropati induktion er involveret21. Målretning mod viral replikation samt TNF-α-medieret CNS-inflammation10,11,12,13,14, i det mindste delvis, giver terapeutiske virkninger progression af dengue-associeret akut viral encephalitis-lignende sygdom. Protokollen af denne undersøgelse kan anvendes til at skabe en encephalitis-lignende patologiske model af DENV infektion.

Nogle undersøgelser har beskrevet induktion af intracerebral blødning induceret af DENV infektion i hjernen22,23. Vi tidligere viste induktion af BBB afbrydelse i DENV-inficerede mus9. Selv om DENV ikke er anerkendt som en neurotropic virus, DENV kan producere en effektiv infektion i neuronal celler in vivo og in vitro8,11. Dopamin D2 receptor (D2R) er spekuleret på at være en neuronal receptor for DENV infektion, og farmakologisk målretning D2R effektivt reducerer DENV infektion i neuronal celler in vivo og in vitro, samt DENV-induceret meningokok sygdomme11, 24. Mulige terapeutiske strategier mod akut viral encephalitis er vigtige at udvikle, så alvorlige dengue tilfælde med neurologiske komplikationer kan behandles. For sin fremtidige anvendelse, denne protokol af en sygdomsmodel ved hjælp af DENV infektion i hjernen kan blive en in vivo platform til at screene ikke kun de virale og Host faktorer forbundet med Neuro patogenese, men også mulige antiviral og anti-encephalitiske lægemidler. Med hensyn til forekomsten af variant neurologiske lidelser forårsaget af DENV infektion25 ved denne etablerede protokol, forskellen mellem de variable typer og/eller stammer af DENV for at forårsage neurologiske dysfunktion er nødvendig for validering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra ministeriet for videnskab og teknologi (MOST107-2321-B-038-001) og den murene finansiering 106tmu-CIT-01-2, Taipei, Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) Gibco 11875-085 Diluting virus
0.3 mL Insulin Syringe  BD Ultra-Fine­II 328838 Intracerebral and intraperitoneal injection
Microbalance METTLER TOLEDO's LabX AL104 Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046) The Centers for Disease Control of Taiwan - Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse BioLASCO Taiwan Co., Ltd - Our murine model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055 (2016).
  2. Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17, (3), e88-e100 (2017).
  3. Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12, (9), 906-919 (2013).
  4. Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
  5. Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23 (2011).
  6. de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230, (1), 237-242 (2012).
  7. Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18, (5), 374-387 (2012).
  8. Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72, (1), 823-829 (1998).
  9. Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670 (2016).
  10. Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000 (2016).
  11. Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7, (1), 6910 (2017).
  12. Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104, (5), 961-968 (2018).
  13. Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12, (8), e0006715 (2018).
  14. Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
  15. Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7, (1), 91 (2017).
  16. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. 199-215 (2016).
  17. Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
  18. Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89, (2), 1254-1266 (2015).
  19. Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195, (5), 665-674 (2007).
  20. Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379, (6), 557-566 (2018).
  21. Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80, (2), 87-93 (2008).
  22. Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240 (2012).
  23. Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72, (4), 429-433 (2009).
  24. Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211, (3), 394-404 (2015).
  25. Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6, (1), 116 (2017).
En murine model af dengue virus-induceret akut viral encephalitis-lignende sygdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shen, T. J., Jhan, M. K., Kao, J. C., Ho, M. R., Tsai, T. T., Tseng, P. C., Wang, Y. T., Lin, C. F. A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease. J. Vis. Exp. (146), e59132, doi:10.3791/59132 (2019).More

Shen, T. J., Jhan, M. K., Kao, J. C., Ho, M. R., Tsai, T. T., Tseng, P. C., Wang, Y. T., Lin, C. F. A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease. J. Vis. Exp. (146), e59132, doi:10.3791/59132 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter