Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En murine modell av Dengue virus-indusert akutt viral encefalitt-lignende sykdom

doi: 10.3791/59132 Published: April 28, 2019

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å skape en immunkompetente ICR (Institute of Cancer Research) murine modell av sentralnervesystemet infeksjon for å vise utviklingen av nevropati. Overvåking av akutte virus encephalitic lidelser med identiske sykdoms resultater kan utføres for å vise Dengue virus induserte nevropati i vivo.

Abstract

Dengue virus (DENV), en arthropod-borne virus overføres av mygg, kan føre til alvorlig sykdom kjent som Dengue hemoragisk feber, som er preget av dødelige komplikasjoner på grunn av plasma lekkasje, ascites, pleural effusjon, åndedretts nød, alvorlig blødning, og organ verdifall. Noen få tilfeller av DENV infeksjon presentere nevrologiske manifestasjoner; studier har imidlertid ikke utforsket DENV-indusert neuropathogenesis videre. I denne studien presenterer vi en protokoll for å bruke en immunkompetente outbred ICR (Institute of Cancer Research) musen for å undersøke induksjon av sentralnervesystemet (CNS) infeksjon med DENV, etterfulgt av progresjon av akutte viral encefalitt-lignende Sykdom.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DENV, en arthropod-båret virus av hvilken familien, inneholder en positiv-Sense RNA Genova som koder tre viral strukturelle proteiner (kapsid, premembrane og konvolutt) og syv viral nonstructural PROTEINER (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B og NS5). De fire serotypene av DENV (DENV1-4), som infisere ca 390 000 000 mennesker årlig, føre til en global byrde, selv om regjeringene har rettet betydelig innsats mot mygg vektor og sykdom kontroll1. For tiden, beskyttende vaksiner og terapeutiske antivirale medikamenter er under utvikling og krever ytterligere langsiktig validering2. I klinisk praksis, selv om en Dengue pasient med CNS-infeksjon er sjelden, må den undersøkes ytterligere for å forstå mangfoldet av Dengue sykdomsutvikling3. Videre etterforskning og validering er nødvendig; spesielt, verdenshelseorganisasjon (WHO) har inkludert involvering av CNS verdifall, slik som kognitiv svekkelse, kramper, encefalopati, og encefalitt, i klassifiseringen av alvorlig Dengue3,4. Konstruere dyremodeller av DENV infeksjon er uunnværlig for å utforske neuropathogenesis av DENV infeksjon.

For å generere CNS infeksjon av DENV, flere studier har utført ulike ruter av DENV infeksjon, inkludert (1) intracerebrale inoculation av C57BL/6 mus som fikk 4 x 103 plakk-forming enheter (PFU) av nonadapted DENV35, 6, (2) intraperitoneal INOCULATION av BALB/c mus som fikk 7 x 104 PFU av in vitro neuroadapted DENV47, (3) intracerebrale inoculation av sveitsiske mus som fikk 1 x 105 PFU av in vivo neuroadapted DENV18, og (4) intracerebrale og intraperitoneal co-inoculation av ICR patte mus som fikk 1 x 106 PFU av nonadapted DENV29. Ifølge resultatene av disse studiene5,6, 7,8,9, DENV infeksjon i mus resultere i viral replikering i hjernen, fører til akutt viral encefalitt-lignende syndromer, atferdsendringer ledsaget av lem lammelse og postural ustabilitet, CNS nevrotoksisitet og betennelser, generelt og lokaliserte plasma lekkasje gjennom blod-hjerne barriere (BBB), og dødelighet. Alle resultatene fra disse studiene5,6,7,8,9 har vist evne til DENV å infisere CNS og induksjon av akutt viral encefalitt-lignende sykdom etter infeksjon.

Basert på våre nåværende funn9,10,11,12,13,14,15, har vi laget en murine modell av DENV infeksjon som en in vivo plattform for å undersøke terapeutisk effekt av målrettede agenter/faktorer mot viral replikering, samt nevrotoksisitet. Her rapporterer vi protokollen benyttet for å skape en immunkompetente outbred ICR mus for å studere CNS infeksjon og for å overvåke utviklingen av nevropatier med ulike alvorlighetsgradene forårsaket av DENV. Resultatene viser den betydelige utviklingen av encefalitt sykdom i DENV-infiserte mus på en tidsavhengig måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Eksperimentelle protokoller av dyre studien ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruker komité av National Defense Medical Center (IACUC nummer: 16-261), ifølge retningslinjer fastsatt av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan.

1. infeksjon prosedyre

  1. Forbered nonadapted DENV2 (stamme PL046) aksjer9 (opprinnelig innhentet fra Centers for sykdom Control i Taiwan, alt fra 2,5 x 107 til 1 x 109 PFU/ml).
  2. Fortynne viruset lager til 1 x 106 PFU med Roswell Park Memorial INSTITUTE (RPMI) 1640 medium til et total volum på 40 μL.
  3. Fyll en 0,3 mL sprøyte utstyrt med en 30 G nål med 10 μL (2,5 x 105 PFU) av fortynnet virus, og fyll en annen 0,3 ml sprøyte utstyrt med en 30 g nål med 30 μl (7,5 x 105 PFU) av utvannet virus.
  4. Hold den 7 dager gamle ICR patte musen og gjennomføre følgende trinn.
    1. For intracerebrale injeksjon, Hold musen i en liggende posisjon ved å trykke på auricle mellom pekefingeren og tommelen, og intracerebrally injisere 10 μL av utvannet virus i lambda-området, punktet i skjæringspunktet mellom sagittal og lambdoid Sutur 16i den.
    2. Etter intracerebrale injeksjon, Hold musen i en liggende posisjon ved hjelp av pekefingeren og tommelen og intraperitonealt injisere 30 μL av utvannet virus forsiktig inn i murine abdomenl.
      Merk: for å unngå kannibalisme, er 75% alkohol brukt til å skape et midlertidig tap av morens olfactory sensasjon. I tillegg dekker kull med sin mors krakk og urin er foreslått.
  5. Legg patte musene tilbake i burene sine og vent i 5 minutter for å sjekke deres sikkerhet poststimulation med avidity av mus, inkludert gåing og morsmelk suger.
    Merk: Oftest, mus demonstrere normal aktivitet poststimulation og det synes ikke å være noen skadelige effekter etter teknisk utfordring. Under dette eksperimentet ble dyrene vedlikeholdes av institusjonelle Animal Care og User Committee av National Defense Medical Center, Taiwan.
  6. Evaluere den daglige fremgangen til musene når det gjelder kroppsvekt (ved å bruke en mikrogram balanse), akutt viral encefalitt sykdom (av sykdoms scoring som beskrevet i avsnitt 2), og overlevelsesraten9,10,11 ,12,13,14,15.

2. sykdom scoring

  1. Overvåk karakteren av akutte virale encefalitt-lignende sykdommer. Tildel en poengsum på 0 til sunne mus; 1 til mus med mindre sykdom symptomer, inkludert vekttap, redusert mobilitet, og en Ringeren kropps orientering; 2 til mus som viser limbiske anfall; 3 til mus utstillingen limbiske svakhet, inkludert å flytte med vanskeligheter og fremre lem eller bakre lem svakhet; 4 for lammelse; 5 for døden.
    Merk: Når poengsummen når 3, sykdommen symptomene anses å være i utvikling raskt.
  2. Plot scoring av sykdommen, i henhold til trinn 2,1, for hver dag som en kurve-basert figur ved hjelp av gjennomsnittlig ± SD av de daglige test score i hver gruppe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alvorlig Dengue-assosiert nevrologiske komplikasjoner har blitt rapportert hos pasienter for Dengue patogenesen4. Selv om disse tilfellene er sjeldne i klinikken, kan skape en immunkompetente murine modell av DENV infeksjon brukes ikke bare for å studere immunopathogenesis, men også for å utforske CNS infeksjon, nevroinflammasjon, nevrotoksisitet, og akutt viral encefalitt-lignende sykdom. I denne studien, i henhold tilvår nåværende modell9,10,11,12,13,14,15, 7 dag gamle ICR patte mus var inokulert samtidig med DENV2 gjennom en intracerebrale microinjection (2,5 x 105 PFU) og en intraperitoneal injeksjon (7,5 x 105 PFU) (figur 1). Følgende infeksjon, utførte vi en rekke analyser for å vise tilstedeværelsen av dsRNA replikering, viral protein uttrykk, og virus Release i DENV-infiserte hjernen9,10,11,12 ,13,14,15. Disse eksperimentene viste at en vellykket in vivo-modell av DENV-smitte, replikering og frigivelse er etablert.

For å evaluere induksjon av akutte virale encefalitt-lignende sykdommer9,10,11,12,13,14,15, overvåket vi endringene i kroppsvekt i DENV-infiserte mus. Sammenlignet med kroppsvekt endringer i mock gruppen (der musene ble inokulert med RPMI medium bare), figur 2 viser en økning i mock gruppen, men en betydelig (P < 0,01) nedgang i kroppsvekt i infiserte mus. Ifølge symptomene på encefalitt-lignende sykdommer, inkludert Ringeren holdning, limbiske anfall, limbiske svakhet, lammelse og død, som manifestert i DENV-infiserte mus, Figur 3 viser en betydelig (P < 0,05) økning i klinisk poengsum i DENV-infiserte mus. Overlevelses analysen i Figur 4 viser en tidsavhengig reduksjon i overlevelsesraten (P < 0,001) av de DENV-infiserte musene. Dataene indikerer etablering av en smittsom modell av DENV i CNS, som viser progresjon av akutte viral encefalitt-lignende sykdommer.

Figure 1
Figur 1: eksperimentell design for Dengue virus (DENV) infeksjon i patte mus. Syv dag gamle ICR patte mus ble inokulert med DENV2 PL046 av samtidige intrakraniell og intraperitoneal injeksjoner. Vi målte endringer i kroppsvekt, sykdoms score og dødelighet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: kroppsvekten i patte mus under Dengue virus (DENV) infeksjon. I DENV2-infiserte ICR patte mus (n = 12), ble endringer i kroppsvekt målt per dag. Etter en Wilcoxon signert-Rank test, verdiene er presentert som gjennomsnittet ± SD. * *p < 0,01. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: den encephalitic sykdommen scorer i patte mus under Dengue virus (DENV) infeksjon. Etter DENV2 infeksjon i ICR patte mus (n = 12), tid-kinetisk endringer i kliniske score for Ringeren holdning (score 1), limbiske anfall (score 2), limbiske svakhet (score 3), lammelse (score 4), og død (score 5) ble målt. Etter en Wilcoxon signert-Rank test, verdiene er presentert som gjennomsnittet ± SD. *p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: overlevelsesraten i patte mus under Dengue virus (DENV) infeksjon. Time-Kinetic endringer i overlevelse ble målt i DENV2-infiserte ICR patte mus (n = 12). Etter en log-Rank test, verdiene er presentert som gjennomsnittet ± SD. * * *p < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DENV infeksjon har blitt påvist i CNS av alvorlig Dengue pasienter3,17, antyder muligheten for manifestasjon av akutte viral encefalitt oppstod under Dengue patogenesen. Her rapporterer vi en in vivo murine modell av DENV infeksjon for å studere involvering av CNS dysfunksjon i alvorlig Dengue, spesielt med fokus på DENV-indusert akutt viral encefalitt-lignende sykdommer. Sammenlignet med tidligere modeller, spesielt for en-rute infeksjon (intravenøs bare, intraperitoneal bare, eller intracerebrale bare), en ekstremt høy titer (1 x 108 PFU) av DENV benyttes i immunkompetente mus. Men i immunsupprimerte mus, en relativt lav, men variant titer (1 x 105 til 1 x 108 PFU) av DENV kan utføres18,19,20. I denne studien brukte vi to-rute infeksjon for å indusere samtidige CNS og systemisk infeksjon med en lav titer (intrakraniell: 2,5 x 105 PFU; intraperitoneal: 7,5 x 105 PFU) av DENV i immunkompetente ICR patte mus. Progresjon av encefalitt-lignende sykdom erfullstendig reproduserbar9,10,11,12,13,14,15 . Den mulige begrensningen av denne studien er derfor reduseres ved hjelp av en samtidig intrakraniell og intraperitoneal injeksjon. Selv om det er kunstig-men i samsvar med tidligere verker av andre5,6,7,8 og US9,10,11, 12,13,14,15-DENV er aktivt kopiert i den eksperimentelle murine hjernen9,10,11, 12 flere , 13 på alle , 14 priser og priser , 15, og de mulige virkningene av viral faktorer og vert svar på nevroinflammasjon, så vel som nevrotoksisitet, er derfor av interesse.

For neuropathogenesis, stimulering av neuronal celle apoptose utløses av DENV infeksjon samt CNS betennelse, slik som mikrogliaaggregater celle aktivering etterfulgt av proinflammatoriske cytokin tumor nekrose faktor-α (TNF-α) produksjon8, 12,15. Direkte nevrotoksisitet forårsaket av DENV infeksjon og indirekte nevroinflammasjon initiert av verten immunresponser er spekulert å være involvert i Dengue encefalitt. Akutt viral encefalitt er forårsaket av virus-indusert CNS betennelse i hjernen3,21. Vanlige kliniske symptomer er høy feber, hodepine, stiv nakke og rygg, oppkast og forvirring, mens alvorlige tilfeller også utvikler beslag, lammelse og koma21. Ved å overvåke endringene i score med Ringeren holdning, limbiske anfall, limbiske svakhet, lammelse og død, utviklingen av disse sykdommene viser progresjon av akutt viral encefalitt-lignende sykdom i DENV-infiserte mus9, 10 andre , 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14 priser og priser , 15. generelt, de DENV-infiserte mus med en poengsum på 3 (i henhold til sykdommen scoring metoden presentert i protokollen) raskt kommet til lammelse og død. De patogene mekanismene som forårsaker disse sykdommene krever ytterligere etterforskning; Men, det er spekulert i at neuronal dysfunksjon etterfulgt av nevropati induksjon er involvert21. Målretting viral replikering, samt TNF-α-mediert sentralnervesystemet betennelse10,11,12,13,14, i det minste delvis, gir terapeutiske effekter mot progresjon av Dengue-assosiert akutt viral encefalitt-lignende sykdom. Protokollen av denne studien kan brukes for å skape en encefalitt-lignende patologisk modell av DENV infeksjon.

Noen studier har beskrevet induksjon av intracerebrale blødning indusert av DENV infeksjon i hjernen22,23. Vi har tidligere vist induksjon av BBB forstyrrelser i DENV-infiserte mus9. Selv om DENV ikke gjenkjennes som et neurotropisk virus, kan DENV produsere en effektiv infeksjon i neuronal celler in vivo og in vitro8,11. Dopamin D2 reseptoren (D2R) er spekulert å være en neuronal reseptor for DENV infeksjon, og farmakologisk målretting D2R effektivt reduserer DENV infeksjon i neuronal celler in vivo og in vitro, samt DENV-indusert encephalitic sykdommer11, 24. Mulige terapeutiske strategier mot akutt viral encefalitt er viktig å utvikle slik at alvorlige Dengue tilfeller med nevrologiske komplikasjoner kan behandles. For dens fremtid søknad, denne protokollen av en sykdommen modell benytter DENV infeksjon inne hjernen kanskje bli en inne vivo plattform å skjermen ikke alene men også det viral og vert faktorene forbundet med neuropathogenesis bortsett fra likeledes mulig antiviral og anti-encephalitic medikamenter. Når det gjelder forekomsten av variant nevrologiske lidelser forårsaket av DENV infeksjon25 av denne etablerte protokollen, forskjellen mellom de variable typer og/eller stammer av DENV for å forårsake nevrologisk dysfunksjon er nødvendig for validering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST107-2321-B-038-001) og intramural finansiering 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) Gibco 11875-085 Diluting virus
0.3 mL Insulin Syringe  BD Ultra-Fine­II 328838 Intracerebral and intraperitoneal injection
Microbalance METTLER TOLEDO's LabX AL104 Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046) The Centers for Disease Control of Taiwan - Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse BioLASCO Taiwan Co., Ltd - Our murine model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055 (2016).
  2. Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17, (3), e88-e100 (2017).
  3. Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12, (9), 906-919 (2013).
  4. Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
  5. Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23 (2011).
  6. de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230, (1), 237-242 (2012).
  7. Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18, (5), 374-387 (2012).
  8. Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72, (1), 823-829 (1998).
  9. Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670 (2016).
  10. Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000 (2016).
  11. Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7, (1), 6910 (2017).
  12. Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104, (5), 961-968 (2018).
  13. Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12, (8), e0006715 (2018).
  14. Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
  15. Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7, (1), 91 (2017).
  16. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. 199-215 (2016).
  17. Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
  18. Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89, (2), 1254-1266 (2015).
  19. Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195, (5), 665-674 (2007).
  20. Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379, (6), 557-566 (2018).
  21. Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80, (2), 87-93 (2008).
  22. Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240 (2012).
  23. Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72, (4), 429-433 (2009).
  24. Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211, (3), 394-404 (2015).
  25. Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6, (1), 116 (2017).
En murine modell av Dengue virus-indusert akutt viral encefalitt-lignende sykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shen, T. J., Jhan, M. K., Kao, J. C., Ho, M. R., Tsai, T. T., Tseng, P. C., Wang, Y. T., Lin, C. F. A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease. J. Vis. Exp. (146), e59132, doi:10.3791/59132 (2019).More

Shen, T. J., Jhan, M. K., Kao, J. C., Ho, M. R., Tsai, T. T., Tseng, P. C., Wang, Y. T., Lin, C. F. A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease. J. Vis. Exp. (146), e59132, doi:10.3791/59132 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter