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Immunology and Infection

Un modelo murino de enfermedad similar a la encefalitis vírica aguda inducida por el virus del dengue

doi: 10.3791/59132 Published: April 28, 2019

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para crear un modelo murino irevolucionario inmunocompetente (Instituto de Investigación del Cáncer) de infección del sistema nervioso central para mostrar el desarrollo de la neuropatía. El control de trastornos encefalíticos víricos agudos por puntuaciones idénticas de enfermedad podría realizarse para mostrar in vivo la neuropatía inducida por el virus del dengue.

Abstract

El virus del dengue (DENV), un virus transmitido por artrópodos transmitido por mosquitos, puede causar la enfermedad grave conocida como fiebre hemorrágica por dengue, que se caracteriza por complicaciones letales debido a fugas plasmáticas, ascitis, derrame pleural, dificultad respiratoria, sangrado grave y deterioro de los órganos. Algunos casos de infección por DENV presentan manifestaciones neurológicas; sin embargo, los estudios no han explorado más la neuropatógenosis inducida por DENV. En este estudio, presentamos un protocolo para utilizar un ratón ICR (Instituto de Investigación del Cáncer) inmunocompetente para investigar la inducción de la infección del sistema nervioso central (SNC) con DENV, seguido de la progresión de la encefalitis vírica aguda Enfermedad.

Introduction

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DENV, un virus transmitido por artrópodos de la familia Flaviviridae, contiene un genoma de ARN de sentido positivo que codifica tres proteínas estructurales virales (cápside, premembrana y envolvente) y siete proteínas no estructurales virales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , y NS5). Los cuatro serotipos del DENV (DENV1-4), que infectan a aproximadamente 390 millones de personas al año, causan una carga mundial a pesar de que los gobiernos han dirigido esfuerzos sustanciales hacia el control de vectores de mosquitos y enfermedades1. Actualmente, las vacunas protectoras y los antivirales terapéuticos están en desarrollo y requieren una mayor validación a largo plazo2. En la práctica clínica, aunque un paciente con dengue con infección por el SNC es poco frecuente, es necesario explorarlo más a fondo para comprender la diversidad del desarrollo de la enfermedad del dengue3. Se necesitan más investigaciones y validación; en particular, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha incluido la participación del deterioro del SNC, como deterioro cognitivo, convulsiones, encefalopatía y encefalitis, en la clasificación del dengue grave3,4. La construcción de modelos animales de infección por DENV es indispensable para explorar la neuropatógenosis de la infección por DENV.

Para generar la infección por El SNC por DENV, varios estudios han ejecutado diferentes vías de infección por DENV, incluyendo (1) inoculación intracerebral de ratones C57BL/6 que recibieron 4 x 103 unidades formadoras de placas (PFU) de DENV35noadaptados, 6, (2) inoculación intraperitoneal de ratones BALB/c que recibieron 7 x 104 PFU de DENV47,(3) inoculación intracerebral de ratones suizos que recibieron 1 x 105 PFU de IN vivo neuroadaptado DENV18y (4) co-inoculación intracerebral e intraperitoneal de ratones chupadores ICR que recibieron 1 x 106 PFU de DENV29no adaptados. Según los resultados de estos estudios5,6,7,8,9, la infección POR DENV en ratones resulta en replicación viral en el cerebro, dando lugar a síndromes similares a la encefalitis, cambios de comportamiento acompañados de parálisis de las extremidades e inestabilidad postural, neurotoxicidad e inflamación del SNC, fuga de plasma general y localizado a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y letalidad. Todos los resultados de estos estudios5,6,7,8,9 han demostrado la capacidad de DENV para infectar el SNC y la inducción de la encefalitis vírica aguda enfermedad tras la infección.

Sobre la base de nuestros hallazgos actuales9,10,11,12,13,14,15, hemos creado un modelo murino de infección DENV como un in vivo para examinar la eficacia terapéutica de los agentes/factores dirigidos contra la replicación viral, así como la neurotoxicidad. Aquí, informamos del protocolo utilizado para crear un ratón ICR de raza superior inmunocompetente para estudiar la infección por el SNC y para monitorear el desarrollo de neuropatías con diferentes gravedades causadas por DENV. Los resultados muestran la progresión significativa de la enfermedad similar a la encefalitis en ratones infectados por el DENV de una manera dependiente del tiempo.

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Protocol

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Los protocolos experimentales de estudio en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y Usuarios del Centro Médico de Defensa Nacional (número IACUC: 16-261), de acuerdo con las directrices establecidas por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán.

1. Procedimiento de infección

  1. Preparar las existencias no adaptadas de DENV2 (strain PL046)9 (obtenido originalmente de los Centros para el Control de Enfermedades en Taiwán, que van desde 2.5 x 107 a 1 x 109 PFU/mL).
  2. Diluir el stock de virus a 1 x 106 PFU con Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio a un volumen total de 40 L.
  3. Llene una jeringa de 0,3 ml equipada con una aguja de 30 G con 10 ml (2,5 x 105 PFU) de virus diluido y llene otra jeringa de 0,3 ml equipada con una aguja de 30 G con 30 ml (7,5 x 105 PFU) de virus diluido.
  4. Sostenga el ratón de la madreito ICR de 7 días de edad y realice los siguientes pasos.
    1. Para la inyección intracerebral, sostenga el ratón en una posición propensa presionando la aurícula entre el dedo índice y el pulgar, e inyecte por vía intracerebral 10 l de virus diluido en el área lambda, el punto en la intersección de la sutura sagital y lambdoid 16.
    2. Después de la inyección intracerebral, sostenga el ratón en posición supina utilizando el dedo índice y el pulgar e inyecte por vía intraperitoneal 30 l de virus diluido suavemente en el abdomen murino.
      NOTA: Para evitar el canibalismo, 75% de alcohol se utiliza para crear una pérdida temporal de la sensación olfativa de la madre. Además, se sugiere cubrir las camadas con las heces y la orina de su madre.
  5. Poner los ratones lactantes de nuevo en sus jaulas y esperar 5 minutos para comprobar su seguridad postestimulación con la avidez de ratones, incluyendo caminar y chupar leche madre.
    NOTA: Muy a menudo, los ratones demuestran actividad normal después de la estimulación y no parece haber efectos nocivos después del desafío técnico. Durante este experimento, los animales fueron mantenidos por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y Usuarios del Centro Médico de Defensa Nacional, Taiwán.
  6. Evaluar el progreso diario de los ratones en términos de peso corporal (mediante el uso de un equilibrio de microgramos), enfermedad similar a la encefalitis vírica aguda (por puntuación de la enfermedad como se describe en la sección 2), y tasa de supervivencia9,10,11 ,12,13,14,15.

2. Puntuación de enfermedades

  1. Controlar el grado de enfermedades similares a la encefalitis viral aguda. Asigne una puntuación de 0 a ratones sanos; 1 a ratones con síntomas de enfermedad menores, incluyendo pérdida de peso, movilidad reducida y una orientación corporal jorobado; 2 a ratones que presentan convulsiones límbicas; 3 a ratones la exhibición de debilidad límbica, incluyendo moverse con dificultad y la debilidad de la extremidad anterior o posterior; 4 para la parálisis; 5 por la muerte.
    NOTA: Una vez que la puntuación alcanza 3, se considera que los síntomas de la enfermedad evolucionan rápidamente.
  2. Trazar la puntuación de la enfermedad, de acuerdo con el paso 2.1, para cada día como una figura basada en curvas utilizando la media de SD de las puntuaciones diarias de las pruebas en cada grupo.

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Representative Results

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Se han notificado complicaciones neurológicas graves asociadasal dengue en pacientes por dengue patógeno 4. Aunque estos casos son raros en la clínica, la creación de un modelo murino inmunocompetente de infección por DENV se puede utilizar no sólo para estudiar la inmunopatógeno, sino también para explorar la infección por el SNC, neuroinflamación, neurotoxicidad y viral agudo enfermedad similar a la encefalitis. En este estudio, según nuestro modelo actual9,10,11,12,13,14,15, 7 días de edad ICR ratones chupadores fueron inoculados simultáneamente con DENV2 a través de una microinyección intracerebral (2,5 x 105 PFU) y una inyección intraperitoneal (7,5 x 105 PFU) (Figura1). Después de la infección, realizamos numerosos análisis para mostrar la presencia de replicación dsRNA, expresión de proteína viral y liberación de virus en el cerebro infectado por DENV9,10,11,12 ,13,14,15. Estos experimentos demostraron que se ha establecido un modelo in vivo exitoso de infección, replicación y liberación de DENV.

Para evaluar la inducción de enfermedades agudas similares a la encefalitis viral9,10,11,12,13,14,15, monitoreamos los cambios en peso corporal en ratones infectados por DENV. En comparación con los cambios de peso corporal en el grupo simulado (donde los ratones fueron inoculados con el medio RPMI solamente), la Figura 2 muestra un aumento en el grupo ficticio, pero una disminución significativa (P < 0.01) en el peso corporal en los ratones infectados. Según los síntomas de enfermedades similares a la encefalitis, incluyendo postura de corazonada, convulsiones límbicas, debilidad límbica, parálisis y muerte, como se manifiesta en ratones infectados por DENV, la Figura 3 muestra un aumento significativo (P < 0.05) clínica en ratones infectados por el DENV. El ensayo de supervivencia de la Figura 4 muestra una reducción dependiente del tiempo en la tasa de supervivencia (P < 0,001) de los ratones infectados por el DENV. Los datos indican el establecimiento de un modelo infeccioso de DENV en el SNC, que muestra la progresión de enfermedades agudas similares a la encefalitis vírica.

Figure 1
Figura 1: Diseño experimental para la infección por el virus del dengue (DENV) en ratones chupadores. Siete ratones chupadores ICR de un día de edad fueron inoculados con DENV2 PL046 por inyecciones intracraneales e intraperitoneales simultáneas. Medimos los cambios en el peso corporal, la puntuación de la enfermedad y la mortalidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: El peso corporal de los ratones chupadores durante la infección por el virus del dengue (DENV). En los ratones chupadores ICR infectados por DENV2 (n.o 12), se midieron los cambios en el peso corporal por día. Después de una prueba de rango firmado de Wilcoxon, los valores se presentan como la media de SD. **p < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Puntuación de la enfermedad encefalítica en ratones chupadores durante la infección por el virus del dengue (DENV). Tras la infección por DENV2 en ratones chupadores de ICR (n a 12), se midieron los cambios cinéticos en las puntuaciones clínicas de la postura del rechipóculo (puntuación 1), la convulsión límbica (puntuación 2), la debilidad límbica (puntuación 3), la parálisis (puntuación 4) y la muerte (puntuación 5). Después de una prueba de rango firmado de Wilcoxon, los valores se presentan como la media de SD. *p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La tasa de supervivencia en ratones chupadores durante la infección por el virus del dengue (DENV). Se midieron los cambios cinéticos de tiempo en las tasas de supervivencia en ratones chupadores ICR infectados por EL NV2 ( n.o 12). Después de una prueba de rango de registro, los valores se presentan como la media de SD. ***p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Se ha detectado una infección por DENV en el SNC de pacientes con dengue grave3,17, lo que sugiere la posibilidad de que la manifestación de encefalitis vírica aguda se haya producido durante la patogénesis del dengue. Aquí, informamos de un modelo in vivo murino de infección por DENV para estudiar la participación de la disfunción del SNC en el dengue grave, particularmente con un enfoque en enfermedades similares a la encefalitis vírica aguda inducidapor por DENV. En comparación con los modelos anteriores, especialmente para la infección unidireccional (solo intravenosa, solo intraperitoneal o intracerebral solamente), se utiliza un título extremadamente alto (1 x 108 PFU) de DENV en ratones inmunocompetentes. Sin embargo, en ratones inmunocomprometidos, un titer relativamente bajo pero variante (1 x 105 a 1 x 108 PFU) de DENV se puede realizar18,19,20. En este estudio, utilizamos la infección de dos vías para inducir el SNC concurrente y la infección sistémica con un título bajo (intracraneal: 2,5 x 105 PFU; intraperitoneal: 7,5 x 105 PFU) de DENV en ratones inmunocompetentes para amamantamiento ICR. La progresión de la enfermedad similar ala encefalitis es completamente reproducible 9,10,11,12,13,14,15 . La posible limitación de este estudio se mitiga, por lo tanto, mediante el uso de una inyección intracraneal e intraperitoneal concurrente. Aunque es artificial-sin embargo, consistente con obras anteriores de otros5,6,7,8 y nosotros9,10,11, 12,13,14,15-DENV se replica activamente en el cerebro murino experimental9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15, y los posibles efectos de los factores virales y las respuestas del huésped en la neuroinflamación, así como la neurotoxicidad, son, por lo tanto, de interés.

Para la neuropatógénesis, la estimulación de la apoptosis de las células neuronales se desencadena por la infección por DENV, así como la inflamación del SNC, como la activación de células microgliales seguidas de la producción proinflamatoria del factor de necrosis tumoral de citoquinas (TNF-)8, 12,15. Se especula que la neurotoxicidad directa causada por la infección por DENV y la neuroinflamación indirecta iniciada por las respuestas inmunitarias del huésped están implicadas en la encefalitis por dengue. La encefalitis vírica aguda es causada por la inflamación del SNC inducida por el virus del cerebro3,21. Los síntomas clínicos comunes son fiebre alta, dolor de cabeza, rigidez en el cuello y la espalda, vómitos y confusión, mientras que los casos graves también presentan convulsiones, parálisis y coma21. Al monitorear los cambios en las puntuaciones con postura jocosa, convulsiones límbicas, debilidad límbica, parálisis y muerte, el desarrollo de estas enfermedades muestra la progresión de la enfermedad aguda similar a la encefalitis viral en ratones infectados por el DENV9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. Por lo general, los ratones infectados por el DENV con una puntuación de 3 (según el método de puntuación de la enfermedad presentado en el protocolo) progresaron rápidamente hasta la parálisis y la muerte. Los mecanismos patógenos que causan estas enfermedades requieren una investigación más profunda; sin embargo, se especula que la disfunción neuronal seguida de la inducción de la neuropatía está involucrada21. La replicación viral dirigida, así como la inflamación del SNC mediada por TNF10,11,12,13,14, al menos en parte, confiere efectos terapéuticos contra la progresión de la enfermedad similar a la encefalitis vírica aguda asociada al dengue. El protocolo de este estudio podría utilizarse para crear un modelo patológico similar a la encefalitis de infección por DENV.

Algunos estudios han descrito la inducción de hemorragia intracerebral inducida por la infección por DENV en el cerebro22,23. Anteriormente mostramos la inducción de la interrupción de BBB en ratones infectados por DENV9. Aunque DENV no está reconocido como un virus neurotrópico, DENV puede producir una infección efectiva en las células neuronales in vivo e in vitro8,11. Receptor de dopamina D2 (D2R) se especula que es un receptor neuronal para la infección DENV, y la orientación farmacológica D2R reduce eficazmente la infección de DENV en las células neuronales in vivo e in vitro, así como las enfermedades encefalíticas inducidas por DENV11, 24. Las posibles estrategias terapéuticas contra la encefalitis viral aguda son importantes para desarrollar los casos graves de dengue con complicaciones neurológicas. Para su futura aplicación, este protocolo de un modelo de enfermedad utilizando la infección DENV en el cerebro puede convertirse en una plataforma in vivo para examinar no sólo los factores virales y de acogida asociados con la neuropatogénesis, sino también posibles antivirales y fármacos anti-encéfalos. En cuanto a la incidencia de trastornos neurológicos variante causados por la infección DENV25 por este protocolo establecido, la diferencia entre los tipos de variables y / o cepas de DENV para causar disfunción neurológica es necesaria para la validación.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST107-2321-B-038-001) y la financiación intramuros 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Taiwán.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) Gibco 11875-085 Diluting virus
0.3 mL Insulin Syringe  BD Ultra-Fine­II 328838 Intracerebral and intraperitoneal injection
Microbalance METTLER TOLEDO's LabX AL104 Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046) The Centers for Disease Control of Taiwan - Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse BioLASCO Taiwan Co., Ltd - Our murine model

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Shen, T. J., Jhan, M. K., Kao, J. C., Ho, M. R., Tsai, T. T., Tseng, P. C., Wang, Y. T., Lin, C. F. A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease. J. Vis. Exp. (146), e59132, doi:10.3791/59132 (2019).More

Shen, T. J., Jhan, M. K., Kao, J. C., Ho, M. R., Tsai, T. T., Tseng, P. C., Wang, Y. T., Lin, C. F. A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease. J. Vis. Exp. (146), e59132, doi:10.3791/59132 (2019).

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