Summary
Deze studie meldt bloedmonsters van staart ader in muizen met behulp van een systeem van de buisjes opzuigen met lenzenvloeistof vergrootglas. Onze methode is makkelijk om te oefenen en kan worden gebruikt voor herhalen bloedmonsters in muizen.
Abstract
Bloed monster collectie is de basis van experimentele dierlijke onderzoek. Het is van belang voor het verkrijgen van voldoende bloedmonsters voor verschillende onderzoeksdoeleinden. De aders van de staart van muizen zijn klein, en het is soms moeilijk te verkrijgen van de vereiste bloed volume door conventionele punctie methoden. Deze studie onderzoekt de superioriteit van herhaalde bloed monster collectie uit staart aderen van muizen door gebruik te maken van een vacuüm bloed collectie systeem en lenzenvloeistof Vergrootglas (experimentele groep) in vergelijking met conventionele bloedmonsters methoden (conventionele groep) , uitgevoerd door beginners als experts, respectievelijk. Met de hulp van een vergrootglas lenzenvloeistof, wordt een vlinder naald tip ingevoegd in de ader van de staart van elke muis in de experimentele groep. Als de ader met succes doorgedrongen is, is een bloedmonster verzameld in de buis vacuüm collectie door invoeging van het einde van de rubber van een vlinder naald in de buis vacuüm bloed collectie. De plunjer wordt vervolgens gebruikt voor het verzamelen van bloed zonder de hulp van de lenzenvloeistof vergrootglas in de conventionele groep. Slagingspercentages van bloed monster collectie door de beginners als experts werden aangetoond dat 70% versus 100% (p < 0,01) in de experimentele groep en 35% versus 85% (p < 0,01) in de conventionele groep. Voor zowel beginners als experts waren punctie tijden vereist voor het verkrijgen van de vereiste bloedmonster beduidend lager in de experimentele groep in vergelijking met de conventionele groep (2,40 ± 0.75 vs. 2.90 ± 0.31, p < 0.05; 1,15 ± 0.37 vs. 1.55 ± 0.76, p < 0,05). Kortom, de gepresenteerde bloed bemonstering techniek is haalbaar en gemakkelijk om te oefenen en frequente bemonstering van voldoende bloed volumes van niet-verdoofd muizen in staat stelt.
Introduction
Bloedmonsters van dieren die betrokken zijn bij experimenten is een fundamenteel onderzoek techniek. Er zijn enkele beschikbare technieken voor bloedinzameling van muizen, inclusief staart knipsels en prikken van het hart, retro-orbitaal plexus halsslagader, caudal ader en vena cava. Idealiter moet bloed worden verzameld in een minimaal invasieve manier, met minimale impact op de gezondheid van het dier. Echter, de meest gebruikte technieken vaak stress bij dieren toebrengen en gevolgen kunnen hebben voor onderzoek resultaten1. De inzameling van het bloed van de retro-orbitaal plexus kan worden gebruikt om genoeg bloed volume van muizen2. Echter, het kan leiden tot ernstige weefselschade en staat niet toe voor het verkrijgen van bloed herhaaldelijk in korte tijd intervallen3.
De caudal ader is een superieure locatie voor bloedinzameling, die minimale schade op muizen toebrengt. Echter de staart aderen van muizen zijn dun, en het is soms moeilijk te verkrijgen van voldoende bloed door de conventionele punctie techniek. In sommige gevallen, herhaalde lekke banden dienen te verkrijgen van het gewenste bloed volume. Anesthesie wordt ook vaak aanbevolen om bloedmonsters uit de aderen van de staart van muizen. Bovendien, een scalpel, richtliniaal scheermes of scherpe schaar kan nodig zijn om de uiteinden van de staarten te verkrijgen van de vereiste bloed monsters4verwijderen. Eerder hebben we succesvol bloedinzameling uit de aderen van de staart van niet-verdoofd ratten gemeld door het vacuüm bloed monster collectie systeem, dat verminderd het risico van besmetting van het bloed en de behoefte aan herhaalde lekke banden5vermeden. Deze studie meldt een soortgelijke bloed collectie methode in muizen niet-verdoofd.
Protocol
1. veehouderij
- Gebruik 12 week oud Kunming muizen.
Opmerking: We gebruikten muizen (n = 40, 20 mannen, 37-46 g, betekenen 42.38 ± 2.39 g) uit de experimentele dieren Center van Tongji Medical College. - Het huis van de muizen onder standaardomstandigheden met gratis toegang tot voedsel en drinkwater. Houd twee muizen in een kooi2 530 cm met hout scheren beddengoed.
- Handhaven van een kamertemperatuur tussen 21-23 °C.
- Feed van muizen met een normale zout dieet (0,3% NaCl) tijdens de studie.
2. bloed monster collectie
- Voorbereiding van de volgende apparatuur: vacuümbuis (1 mL), vlinder naald, lenzenvloeistof Vergrootglas en kunststof beteugeling houder. Plaats ze op een steriele ondergrond (Figuur 1).
- Plaats van een muis in een kunststof beteugeling houder en zijn staart met warm water (20-30 °C) wassen. Veeg de staart met 70% ethanol-verzadigd katoenen ballen uit te breiden van de ader. Selecteer de ader van de linker- of staart voor bloedmonsters. Pak het onderste gedeelte van de staart voorzichtig en houden de staart direct tijdens bloed monster collectie.
- Het verzamelen van het bloed. Als het vergelijken van methoden, verzamelen van bloed in twee groepen: de "experimentele" groep met behulp van de procedure die we hebben ontwikkeld, hieronder, en de "conventionele" groep met behulp van een conventionele methode, ook hieronder.
- Experimentele collectie:
- Draag een vergrootglas lenzenvloeistof ter verbetering van het bekijken voor het aanprikken van de ader van de staart. Breng de 22 G vlinder naald tip in een van de aders van de laterale staart op een positie ongeveer de helft de afstand distally van het puntje van de staart bij een engel ongeveer 10°, op weg naar de onderkant van de staart voor meerdere monsters.
- Steek het uiteinde van de rubber van de vlinder naald in de buis vacuüm bloed-collectie voor het verzamelen van bloed (Figuur 2).
Opmerking: Als het bloed stopt stroomt uit tijdens de bloedinzameling, de hoek van de naald moet worden snel aangepast. Om te voorkomen dat de bloedstolling in de naald, een andere punctie positie moet worden geselecteerd als bloed stroomt stopt uit na 15 s.
- Conventionele methode:
- Plaats de naald verbonden met een spuit in één van de laterale aderen ongeveer een derde van de afstand distally van het puntje van de staart.
- Wanneer bloed in de hub verschijnt, trek terug de zuiger langzaam voor het verzamelen van bloed (Figuur 3)7.
Opmerking: Als u wilt verder toelichten de gevolgen van uiteenlopende ervaringen met bloedinzameling, een beginner en expert werden gekozen bloedmonsters met behulp van experimentele en conventionele methoden gelijktijdig te verzamelen.
- Experimentele collectie:
- Na de bloedinzameling, verwijder de naald en druk op het punt van de punctie om te stoppen met bloeden. Vervolgens laat de muisknop los van de kunststof beteugeling houder en de muis terug naar haar kooi.
Opmerking: Er werd gemeld dat tot 10% van de totale bloed volume kan veilig worden verwijderd uit een gezond dier op 2 week intervallen8, dus ongeveer 175 µL bloed was verzameld over elke keer overeenkomstig ethische beginselen. - Buizen met EDTA gebruiken voor het verzamelen van plasma en buizen zonder anticoagulantia gebruiken voor het verzamelen van serum. Voorzichtig omkeren de buis meerdere malen en leg ze op het ijs verticaal.
- Centrifugeer het bloed monster collectie buizen in een gekoelde centrifuge bij 1.000 x g gedurende 10 minuten om te scheiden van plasma en serum.
Opmerking: Succesvolle bloedinzameling wordt gedefinieerd als het verkrijgen van een volume van 175 µL telkens. Niet meer dan drie lekke banden moeten worden geprobeerd, en een mislukte bloedinzameling is gedefinieerd als een totale bloed volume van minder dan 175 µL na de derde lekke band. De duur van de bemonstering wordt gedefinieerd als de tijd van de staart ader punctie om verwijdering van de naald na bloed-collectie. - Het verzamelen van bloed tweemaal met tussenpozen van 2 weken8.
3. statistische analyse
- Gebruik commercieel beschikbare statistische software voor analyse. Gegevens presenteren als gemiddelde ± standaardafwijking, met behulp van p < 0.05 als de cutoff voor statistische significantie.
Representative Results
Body mass, bloed collectie volumes en bemonstering duur van de twee groepen
Bloedmonsters werden verzameld uit 20 muizen (10 mannen) tweemaal tussenpozen van 2 weken in elke groep. Het gemiddelde lichaamsgewicht van muizen was vergelijkbaar tussen de experimentele en conventionele groepen voor beginners en experts, respectievelijk (42.40 g ± 1.42 g vs. 42.65 g ± 1.14 g, p > 0,05; 42.55 g ± 2,91 g vs 43.20 g ± 2,69 g, p > 0,05). Verzamelde bloed volumes en bemonstering duur waren vergelijkbaar tussen de twee groepen deskundigen (184.25 µL ± 11,95 µL vs. 171.75 µL ± 25.61 µL, p > 0,05; 1.85 min ± 0.68 min vs. 2,17 min ± 0.80 min, p > 0,05). Hogere volumes van het verzamelde bloed en kortere looptijden van de bemonstering werden echter gezien in de experimentele groep in vergelijking met de conventionele groep in beginners (172.00 µL ± 15.17 µL vs. 148.50 µL ± 30.22 µL, p < 0,01; 3.11 min ± 0.44 min vs. 4.08 min ± 0.61 min, p < 0,01). In vergelijking met beginners, deskundigen verzameld van hogere volumes van bloed en lagere bemonstering tijden met behulp van experimentele en conventionele methoden (184.25 µL ± 11,95 µL vs. 172.00 µL ± 15.17 µL, p < 0,01 171.75 µL ± 25.61 µL vs. 148.50 µL ± 30.22 µL, p < 0.05; 1.85 min ± 0.68 toonde min vs. 3.11 min ± 0.44 min, p < 0,01; 2,17 min ± 0.80 min vs. 4.08 min ± 0.61 min, p < 0.05) (tabel 1).
Slagingspercentages en punctie tijden van de twee groepen
De vergelijking van slagingspercentages tussen beginners als experts was 70% (14/20) versus 100% (20/20) (p < 0,01) in de experimentele groep en 35% (7/20) versus 85% (17/20) (p < 0,01) in de conventionele groep. Hogere slagingspercentages werden ook waargenomen in de experimentele groep in vergelijking met de conventionele groep in beginners [70% (14/20) versus 35% (7/20), p < 0.05]. In zowel beginners als experts was het aantal lekke banden beduidend lager in de experimentele groep in vergelijking met de conventionele groep (2,40 ± 0.75 vs. 2.90 ± 0.31, p < 0.05; 1,15 ± 0.37 vs. 1.55 ± 0.76, p < 0,05). Vergeleken met de beginners, werden lagere punctie tijden voor deskundigen waargenomen met behulp van experimentele en conventionele methoden. (1,15 ± 0.37 vs. 2,40 ± 0.75, p < 0,01; 1.55 ± 0.76 vs. 2.90 ± 0.31, p < 0.01) (Tabel 1).
Figuur 1: apparatuur. Getoond worden 1 mL vacuüm bloed collectie buizen en een 22 G vlinder naald (links), een lenzenvloeistof Vergrootglas (midden) en een kunststof beteugeling houder (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: succesvolle bloedinzameling in de experimentele groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: succesvolle bloedinzameling in de conventionele groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Experimentele groep | Conventionele groep | |||
| beginner | expert | beginner | expert | |
| Lichaamsgewicht (g) | 42.4±1.42 | 42.55±2.91 | 42.65±1.14 | 43.20±2.69 |
| Verzamelde bloed volume (µL) | 172.00±15.17 | 184.25±11.95# | 148.50±30.22* | 171.75±25.61# |
| Bemonstering duur (min) | 3.11±0.44 | 1.85±0.68# | 4.08±0.61* | 2.17±0.80# |
| Bloed collectie keer | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Gemiddeld aantal lekke banden | 2.40±0.75 | 1.15±0.37# | 2.90±0.31* | 1.55±0.76## * |
| Een punctie van de tijd | 3 | 17 | 0 | 12 |
| Twee keer perforaties | 6 | 3 | 2 | 5 |
| Driemaal perforaties | 5 | 0 | 5 | 0 |
| Mislukt | 6 | 0 | 13 | 3 |
| Slagingspercentage | 70% | 100%# | 35%* | 85%# |
Tabel 1: vergelijking van de resultaten tussen de experimentele en conventionele groepen. * p < 0,05, ** p < 0,01, experimentele methode versus conventionele methode. #p < 0,05, ##p < 0,01, beginner vs. deskundige.
Discussion
De huidige studie beschrijft een easy-to-learn bloed collectie methode in muizen die is superieur aan de conventionele technieken. Ten eerste, de methode gemakkelijk kan worden beheerst met een hoog slagingspercentage. Ten tweede, het is gebaseerd op het beginsel van de vacuüm negatieve druk en zorgt voor continue tekening van bloed met een verminderd risico van blootstelling aan direct bloed, dat ook de kans op besmetting en hemolyse9 vermindert. Ten derde, is deze methode haalbaar voor frequente bemonstering van bloed met voldoende volumes van muizen gedurende een korte periode van tijd voor verschillende onderzoeksdoeleinden. Bovendien, de procedure toebrengt alleen minimale schade op muizen en bloedinzameling kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van verdoving; Dus, kan de invloed van de stress-respons en de verdoving op bloedmonsters worden vermeden.
De ader van de staart is een superieure locatie voor bloedmonsters volgens het goedgekeurde protocol7. Het is echter niet altijd gemakkelijk te verkrijgen van voldoende bloed volume uit dunne staart aderen met lage bloed stromen. In dit geval, de huid is meestal opengesneden en ader is gepenetreerd door een lancet of het einde van de staart is snel verwijderd door een scheermes.
Dit protocol is gericht op het verbeteren van de methodologie van bloedinzameling van muizen met behulp van het systeem voor het verzamelen van vacuüm bloed, waarvoor een vacuüm bloed collectie monsterbuisje, vlinder naald en lenzenvloeistof vergrootglas. Dit vacuüm bloed bemonsteringssysteem wordt meestal gebruikt voor het verzamelen van bloedmonsters van patiënten in de dagelijkse klinische praktijk10. Met de hulp van een vergrootglas lenzenvloeistof is het punt van de perfecte punctie van een ader van de staart gemakkelijker te vinden. Wanneer het uiteinde van een naald wordt ingevoegd in de ader van de staart, zullen automatisch bloed vloeien in de vacuüm buis als gevolg van negatieve druk. Na de terugtrekking van de naald uit de staart ader, zullen het bloed dat wordt geblokkeerd in de katheter vloeien in de verzamelen vacuüm buis als gevolg van het vacuüm.
De volgende tips zijn belangrijk voor succesvolle toepassing van de methode. Ten eerste moet het lichaamsgewicht voor elke muis 40 g of hogere moeilijkheid in prikken en het verkrijgen van voldoende bloed afnemen. Ten tweede, in het geval van mislukte bloedinzameling, onderzoekers moeten proberen te trekken van de naald langzaam totdat het bloed blijft stromen. Ten derde is het essentieel om uit te breiden van de staart om te voorkomen dat elke beweging tijdens bloedmonsters. Houd de naald voorzichtig kan helpen om de naald-tip in de ader als de bewegingen van de muis staart. Ten vierde, als bloed stroomt stopt uit tijdens de bloedinzameling, de hoek van de naald moet worden aangepast in een tijdige wijze. Om te voorkomen dat de bloedstolling in de naald, een andere punctie positie moet worden geselecteerd als bloed stroomt stopt uit na 15 s. Ten slotte verdient de samenwerking van twee exploitanten tijdens het gebruik van deze techniek voor het verzamelen van bloed van muizen.
Kortom, is de aangenomen vacuüm bloed collectie methode voor gebruik in muizen veilig, haalbaar en makkelijk om te oefenen. Deze methode kan regelmatige bemonstering van bloed met voldoende bloed volumes van niet-verdoofd muizen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de natuur Science Foundation subsidie van de provincie Hubei, China [Grant No. 2018CFB761].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-pointed needle | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 20163151718 | 22G (0.7 mm x 25 mm) |
| Eyeglass magnifier | Vergroberung | 1.5x | |
| Normal salt diet for mice | Mice received a normal salt diet (0.3% NaCl) throughout the study. | ||
| Plastic holder | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 35-45 g rat hoder | |
| SPSS software for statistical analysis | SPSS Inc, Chicago; USA | Version 17.0. | |
| Syringe | Shandong wego Medical polymer products co. LTD., China | 20160911A | 1 mL (Matching needle size: 0.45×16RW LB) |
| Vacuum blood collection system | Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China | 20171222 | 1 mL (Φ12.4×L75) |
References
- Grouzmann, E., et al. Blood sampling methodology is crucial for precise measurement of plasma catecholamines concentrations in mice. European Journal of Physiology. 447 (2), 254-258 (2003).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: a comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Lab Animal. 44 (4), 352-358 (2010).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Lab Animal. 43 (3), 255-260 (2009).
- Hoff, J. Methods of blood collection in the mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Wollowitz, A., Bijur, P. E., Esses, D., John Gallagher, E. Use of butterfly needles to draw blood is independently associated with marked reduction in hemolysis compared to intravenous catheter. Academic Emergency Medicine. 20 (11), 1151-1155 (2013).
- Eder, J. M., Cutter, G. R. A new device for collecting cord blood. Obstetrics and Gynecology. 86 (5), 850-852 (1995).
