Summary
Este estudo relata de amostra de sangue da veia da cauda em ratos, utilizando um sistema de tubo de aspiração com lupa do eyeglass. Nosso método é fácil de praticar e poderia ser usado para amostragem de sangue de repetição em camundongos.
Abstract
Coleta de amostra de sangue é a base da pesquisa experimental animal. É de importância para obter amostras de sangue adequada para diversos fins de pesquisa. As veias de cauda de ratos são pequenas, e às vezes é difícil obter o volume de sangue exigido pelos métodos convencionais de punção. Este estudo investiga a superioridade da coleta de amostra de sangue das veias de cauda de ratos através do uso de um sangue vácuo coleção sistema e óculos lupa (grupo experimental) em comparação com métodos de amostragem de sangue convencional (grupo convencional) , interpretada por iniciantes e especialistas, respectivamente. Com a ajuda de uma lupa de óculos, uma ponta de agulha borboleta é inserida na veia da cauda de cada rato no grupo experimental. Quando a veia é penetrada com sucesso, uma amostra de sangue é coletada no tubo de vácuo coleção pela inserção da extremidade de borracha de uma agulha tipo borboleta no tubo de coleta de sangue do vácuo. O êmbolo é usado para coletar sangue sem a ajuda da lupa do eyeglass no grupo convencional. Taxas de sucesso de coleta de amostra de sangue pelos iniciantes e especialistas foram mostradas para ser 70% vs. 100% (p < 0,01) no grupo experimental e 35% versus 85% (p < 0,01) no grupo convencional. Para novatos e especialistas, punção tempos necessários para a obtenção de amostra de sangue necessária foram significativamente menores no grupo experimental comparado ao grupo convencional (2,40 ± 0,75 vs 2,90 ± 0,31, p < 0,05; 1,15 ± 0,37 vs 1,55 ± 0.76, p < 0,05). Em conclusão, a técnica de amostragem de sangue apresentado é viável e fácil de prática e permite a amostragem frequente dos volumes de sangue adequada dos ratos não anestesiados.
Introduction
Colheita de sangue de animais envolvidos em experiências é uma técnica de pesquisa básica. Existem algumas técnicas disponíveis para coleta de sangue de ratos, incluindo cortes de cauda e perfurando do coração, do plexo retrô-orbital, veia jugular, veia caudal e veia cava. Idealmente, o sangue deve ser colhida de forma minimamente invasiva, com o mínimo de impacto sobre a saúde do animal. No entanto, as técnicas mais comumente usadas frequentemente infligem o stress sobre os animais e podem afetar os resultados de pesquisa1. Coleta de sangue do plexo retrô-orbital pode ser usada para obter volume suficiente sangue de ratos2. No entanto, isso pode resultar em dano tecidual grave e não permite a obtenção de sangue repetidamente em intervalos de tempo curto3.
A veia caudal é uma excelente localização para coleta de sangue, que provoca lesão mínima sobre ratos. No entanto, as veias de cauda de ratos são finas, e às vezes é difícil obter sangue suficiente através da técnica de punção convencional. Em alguns casos, punções repetidas são necessárias para obter o volume de sangue desejada. Anestesia é também comumente recomendada para facilitar a recolha de amostras de sangue das veias cauda dos ratos. Além disso, um bisturi, lâmina de borda reta ou tesoura afiada pode ser necessária para remover as pontas das caudas para obter o sangue necessário amostras4. Informamos anteriormente coleta de sangue bem sucedida das veias cauda dos ratos não anestesiados pelo sistema de coleta de amostra de sangue do vácuo, que reduziu o risco de contaminação do sangue e evitar a necessidade de punções repetidas5. Este estudo relata um método similar de coleta de sangue em ratos não anestesiados.
Protocol
1. produção animal
- Use ratos de Kunming 12 semanas de idade.
Nota: Usamos ratos (n = 40, 20 machos, 37-46 g, quer dizer 42.38 ± 2,39 g) o centro de animais experimentais de Tongji Medical College. - Abrigar os ratos sob condições normais, com livre acesso à comida e água potável. Mantém o fundamento dois ratos em uma gaiola de2 cm 530 com corte de madeira.
- Manter uma temperatura entre 21 a 23 °C.
- Alimentar os ratos com uma dieta normal de sal (0,3% NaCl) ao longo do estudo.
2. coleta de amostra de sangue
- Preparar os seguintes equipamentos: tubo de vácuo (1 mL), agulha da borboleta, lupa óculos e suporte plástico de restrição. Coloque-os sobre uma superfície estéril (Figura 1).
- Coloque um rato em um suporte plástico de restrição e lavar sua cauda com água morna (20 – 30 °C). Limpe o rabo com bolas de algodão saturada com etanol 70% para expandir a veia. Selecione a veia da cauda direita ou esquerda para amostragem de sangue. Segure a parte inferior da cauda suavemente e manter a cauda em linha reta durante a coleta de amostra de sangue.
- Colete o sangue. Se comparar métodos, coletar sangue em dois grupos: o grupo "experimental", usando o procedimento que desenvolvemos, apresentados a seguir, e grupo "convencional", usando um método convencional, também apresentado abaixo.
- Coleção experimental:
- Use uma lupa óculos para melhorar a visualização para punção da veia da cauda. Inserir a ponta da agulha 22g borboleta em uma das veias cauda lateral em uma posição de aproximadamente metade da distância distal da ponta da cauda, um anjo aproximadamente 10°, se movendo em direção à base da cauda para várias amostras.
- Insira a extremidade de borracha da agulha borboleta num tubo de colheita do sangue do vácuo para coletar sangue (Figura 2).
Nota: Se o sangue parar de fluir para fora durante a coleta de sangue, o ângulo da agulha deve ser rapidamente ajustado. Para evitar a coagulação do sangue na agulha, outra posição de punção deve ser seleccionada se o sangue parar de fluir para fora após 15 s.
- Método convencional:
- Insira a agulha conectada a uma seringa em uma das veias laterais aproximadamente um terço da distância distal da ponta da cauda.
- Quando o sangue aparece no centro, puxe o êmbolo lentamente para coletar sangue (Figura 3)7.
Nota: Para elucidar ainda mais os efeitos da variação experiência com coleta de sangue, um principiante e o especialista foram escolhidos para coletar amostras de sangue usando métodos experimentais e convencionais simultaneamente.
- Coleção experimental:
- Após a coleta de sangue, retirar a agulha e pressione o ponto de punção para parar o sangramento. Em seguida, solte o mouse do suporte plástico para restrição e retornar o mouse para sua gaiola.
Nota: Tem sido relatado que acima de 10% do sangue total volume pode ser seguramente removido de um animal saudável em intervalos de 2 semana8, então cerca de 175 µ l de sangue foi coletado cada vez em conformidade com os princípios éticos. - Use tubos com EDTA para coleta de plasma e usar tubos sem anticoagulantes para coletar soro. Delicadamente, inverta o tubo várias vezes e colocá-los no gelo verticalmente.
- Centrifuga os tubos de colheita de amostra de sangue numa centrifugadora refrigerada a 1.000 x g durante 10 minutos separar o plasma e soro.
Nota: Coleta de sangue bem sucedida é definida como obter um volume de 175 µ l de cada vez. Não mais que três furos devem ser tentados, e uma coleção de sangue falha é definida como um volume de sangue total de menos de 175 µ l após a terceira punção. A duração da amostragem é definida como o tempo de punção de veia da cauda para remoção da agulha após a coleta de sangue. - Colete sangue duas vezes em intervalos de 2 semanas8.
3. análise estatística
- Use o software estatístico comercialmente disponível para análise. Apresentar dados como valor médio ± desvio-padrão, utilizando p < 0,05 como o corte de significância estatística.
Representative Results
Massa, volumes de coleção de sangue e durações de amostragem dos dois grupos
Amostras de sangue foram coletadas de 20 ratos (10 machos) duas vezes em intervalos de 2 semanas em cada grupo. A massa média dos ratos foi similar entre os grupos experimentais e convencionais para iniciantes e especialistas, respectivamente (42,40 g ± 1,42 g vs 42,65 g ± 1,14 g, p > 0,05; g 42,55 ± 2,91 g vs 43,20 g ± 2,69 g, p > 0,05). Volumes de sangue coletado e durações de amostragem foram semelhantes entre os dois grupos de especialistas (184.25 µ l µ l de ± 11,95 vs 171.75 µ l ± 25,61 µ l, p > 0,05; min 1,85 ± 0,68 min vs 2,17 min ± 0,80 min, p > 0,05). No entanto, maior volume de sangue coletado e durações mais curtas de amostragem foram vistas no grupo experimental comparado ao grupo convencional na iniciantes (172.00 µ l µ l de ± 15.17 vs 148.50 µ l ± 30.22 µ l, p < 0,01; min 3,11 ± 0,44 min vs ± 4,08 min min 0,61, p < 0,01). Comparado aos iniciantes, especialistas recolhidos maiores volumes de sangue e mostraram baixa amostragem vezes usando métodos experimentais e convencionais (184.25 µ l µ l de ± 11,95 vs 172.00 µ l µ l ± 15.17, p < 0,01; 171.75 µ l µ l de ± 25,61 vs 148.50 µ l ± 30.22 µ l, p < 0,05; min 1,85 ± 0,68 min vs min 3,11 ± 0,44 min, p < 0,01; 2.17 min ± 0,80 min vs ± 4,08 min min 0,61, p < 0,05) (tabela 1).
Taxas de sucesso e punção de tempos dos dois grupos
A comparação das taxas de sucesso entre iniciantes e especialistas era de 70% (14/20) vs 100% (20/20) (p < 0,01) no grupo experimental e 35% (7/20) vs 85% (17/20) (p < 0,01) no grupo convencional. Maiores taxas de sucesso também foram vistas no grupo experimental comparado ao grupo convencional em iniciantes [70% (14/20) vs 35% (7/20), p < 0.05]. Em ambos os novatos e especialistas, o número de punções foi significativamente menor no grupo experimental comparado ao grupo convencional (2,40 ± 0,75 vs 2,90 ± 0,31, p < 0,05; 1,15 ± 0,37 vs 1,55 ± 0.76, p < 0,05). Comparado aos iniciantes, tempos de punção inferiores para peritos foram observados usando métodos experimentais e convencionais. (1,15 ± 0,37 vs 2,40 ± 0,75, p < 0,01; 1,55 ± 0,76 vs 2,90 ± 0,31, p < 0,01) (Tabela 1).
Figura 1: equipamento. Mostrados são tubos de colheita de sangue do vácuo de 1 mL e uma agulha tipo borboleta 22g (à esquerda), uma lupa óculos (médio) e um suporte plástico de restrição (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: coleta de sangue de sucesso no grupo experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: coleta de sangue de sucesso no grupo convencional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Grupo experimental | Grupo convencional | |||
| iniciante | especialista em | iniciante | especialista em | |
| Massa corporal (g) | 42.4±1.42 | 42.55±2.91 | 42.65±1.14 | 43.20±2.69 |
| Volume de sangue coletado (µ l) | 172.00±15.17 | 184.25±11.95# | 148.50±30.22* | 171.75±25.61# |
| Duração da amostragem (min) | 3.11±0.44 | 1.85±0.68# | 4.08±0.61* | 2.17±0.80# |
| Tempos de coleta de sangue | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Número médio de perfurações | 2.40±0.75 | 1.15±0.37# | 2.90±0.31* | 1.55±0.76# # * |
| Uma punção de tempo | 3 | 17 | 0 | 12 |
| Duas vezes da punctura | 6 | 3 | 2 | 5 |
| Três vezes da punctura | 5 | 0 | 5 | 0 |
| Falhou | 6 | 0 | 13 | 3 |
| Taxa de sucesso | 70% | 100%# | 35%* | 85%# |
Tabela 1: comparação dos resultados entre os grupos experimentais e convencionais. * p < 0.05, * * p < 0,01, método experimental vs método convencional. #p < 0,05, 0,01 < ##p, iniciante vs especialista.
Discussion
O presente estudo descreve um método de coleta de sangue fácil de aprender em ratos que é superior às técnicas convencionais. Primeiro, o método pode ser dominado facilmente com uma elevada taxa de sucesso. Em segundo lugar, é baseado no princípio da pressão negativa do vácuo e permite desenho contínuo de sangue com um risco reduzido de exposição direta de sangue, que também reduz a chance de contaminação e a hemólise9. Em terceiro lugar, esse método é viável para amostragem frequente de sangue com volumes adequados de ratos durante um curto período de tempo para vários fins de pesquisa. Além disso, o procedimento inflige apenas mínima lesão em ratos, e coleta de sangue pode ser realizada sem o uso de anestésicos; assim, a influência da resposta ao estresse e anestésicos em amostras de sangue pode ser evitada.
A veia da cauda é uma excelente localização para amostragem de sangue, de acordo com o protocolo aprovado7. No entanto, não sempre é fácil obter volume suficiente de sangue das veias de cauda fina com fluxos de sangue baixa. Neste caso, a pele é geralmente cortada aberta e veia é penetrada por uma lanceta, ou o fim da cauda é removido rapidamente por uma navalha.
Este protocolo visa melhorar a metodologia de coleta de sangue de ratos utilizando o sistema de coleta de sangue do vácuo, que requer um tubo de coleta de amostra de sangue do vácuo, agulha da borboleta e lupa do eyeglass. Este sistema de recolha de sangue do vácuo é geralmente usado para coletar amostras de sangue dos pacientes em diária prática clínica10. Com a ajuda de uma lupa de óculos, o ponto perfeito de punção de uma veia da cauda é mais fácil de localizar. Quando a ponta de uma agulha é inserida a veia da cauda, sangue fluirá automaticamente dentro do tubo de vácuo devido a pressão negativa. Depois de retirar a agulha da veia da cauda, o sangue é bloqueado o cateter vai fluir no tubo de vácuo de coleta devido o vácuo.
As dicas a seguir são importantes para a aplicação bem sucedida do método. Primeiro, o peso corporal de cada rato deve ser 40 g ou superior para diminuir a dificuldade de punção e obtenção de sangue suficiente. Em segundo lugar, no caso de coleta de sangue falha, experimentadores devem tentar retirar a agulha lentamente até o sangue continua a fluir para fora. Em terceiro lugar, é vital para estender a cauda para evitar qualquer movimento durante a colheita de sangue. Segurando a agulha suavemente pode ajudar a manter a ponta da agulha na veia, como os movimentos de cauda de rato. Em quarto lugar, se o sangue parar de fluir para fora durante a coleta de sangue, o ângulo da agulha deve ser ajustado em tempo hábil. Para evitar a coagulação do sangue na agulha, outra posição de punção deve ser seleccionada se o sangue parar de fluir para fora após 15 s. Finalmente, recomenda-se a cooperação de dois operadores, ao usar esta técnica para coletar sangue de ratos.
Em suma, o método de coleta de sangue do vácuo adotado para uso em camundongos é segura, viável e fácil de prática. Esse método permite a amostragem frequente de sangue com volumes de sangue adequada dos ratos não anestesiados.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela concessão natureza Science Foundation da província de Hubei, China [Grant No. 2018CFB761].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-pointed needle | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 20163151718 | 22G (0.7 mm x 25 mm) |
| Eyeglass magnifier | Vergroberung | 1.5x | |
| Normal salt diet for mice | Mice received a normal salt diet (0.3% NaCl) throughout the study. | ||
| Plastic holder | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 35-45 g rat hoder | |
| SPSS software for statistical analysis | SPSS Inc, Chicago; USA | Version 17.0. | |
| Syringe | Shandong wego Medical polymer products co. LTD., China | 20160911A | 1 mL (Matching needle size: 0.45×16RW LB) |
| Vacuum blood collection system | Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China | 20171222 | 1 mL (Φ12.4×L75) |
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