Summary
Este estudio divulga la muestra de sangre de vena de la cola en ratones usando un sistema de tubo de aspiración con la lupa de lente. Nuestro método es fácil de practicar y podría utilizarse para tomar muestras de sangre de repetición en ratones.
Abstract
Toma de muestra de sangre es la base de las investigaciones experimentales en animales. Es de importancia para obtener muestras de sangre adecuadas para diversos fines de investigación. Las venas de la cola de los ratones son pequeñas, y a veces es difícil obtener el volumen de sangre requerido por los métodos convencionales de la puntura. Este estudio investiga la superioridad de la recolección de muestras repetidas de sangre de las venas de la cola de los ratones mediante el uso de un vacío sangre colección sistema y gafas lupa (grupo experimental) en comparación con métodos de muestreo de sangre convencional (Grupo convencional) , realizado por principiantes y expertos, respectivamente. Con la ayuda de una lupa de lente, una punta de la aguja de mariposa se inserta en la vena de la cola de cada ratón en el grupo experimental. Cuando la vena se ha penetrado con éxito, una muestra de sangre se recoge en el tubo vacío insertando el extremo de la goma de una aguja de mariposa en el tubo de colección de sangre vacío. El émbolo se utiliza para recoger la sangre sin la ayuda de la lupa de lente en el grupo convencional. Tasas de éxito de recogida de muestras de sangre por los principiantes y los expertos mostraron ser 70% vs 100% (p < 0,01) en el grupo experimental y 35% vs 85% (p < 0,01) en el grupo convencional. Tanto para principiantes como expertos, tiempos de punción necesarias para la obtención de muestra de sangre requerida fueron significativamente inferiores en el grupo experimental respecto al grupo convencional (2,40 ± 0.75 vs 2.90 ± 0,31, p < 0.05; 1.15 ± 0,37 vs 1.55 ± 0,76, p < 0.05). En conclusión, la técnica de muestreo de sangre presentado es factible y fácil de practicar y permite el muestreo frecuente de los volúmenes sanguíneo adecuado de los ratones no anestesiados.
Introduction
La muestra de sangre de animales en experimentos es una técnica de investigación básica. Hay algunas técnicas disponibles para la recogida de sangre de los ratones, incluyendo tijeras cola y punción del corazón, del plexo retro orbital, vena yugular, vena caudal y vena cava. Idealmente, se debe recoger sangre de una manera mínimamente invasiva, con mínimo impacto en la salud del animal. Sin embargo, las técnicas más comúnmente utilizadas a menudo causan estrés a los animales y pueden afectar los resultados de investigación1. Colección de la sangre desde el plexo retro orbital puede utilizarse para obtener suficiente volumen de sangre de ratones2. Sin embargo, puede resultar en daño tisular severo y no permite para la obtención de sangre repetidamente en intervalos de tiempo corto3.
La vena caudal es una excelente ubicación para recolección de sangre, que ocasiona lesión mínima en ratones. Sin embargo, las venas de la cola de los ratones son delgadas, y a veces es difícil obtener suficiente sangre a través de la técnica de punción convencional. En algunos casos, se requieren Punciones repetidas para obtener el volumen de sangre deseado. Anestesia se recomienda comúnmente para facilitar la muestra de sangre de las venas de la cola de los ratones. Por otra parte, pueden necesitarse un bisturí, navaja de borde recto o unas tijeras afiladas para eliminar los extremos de las colas para obtener la muestras de sangre requiere4. Hemos divulgado previamente colección acertada de la sangre de las venas de la cola de las ratas no anestesiado por el sistema de colección de muestra la sangre del vacío, que reduce el riesgo de contaminación de la sangre y evita la necesidad de repetidas punciones5. Este estudio divulga un método similar de la colección de sangre en los ratones no anestesiados.
Protocol
1. cría
- Utilizar ratones de Kunming 12 semanas de edad.
Nota: Hemos utilizado ratones (n = 40, 20 machos, 37 – 46 g, significan 42.38 ± 2,39 g) de la Universidad Experimental animales centro de Tongji médica. - Casa de los ratones en condiciones estándar con libre acceso a alimentos y agua potable. Manten dos ratones en una jaula2 cm 530 afeitar de madera ropa de cama.
- Mantener una temperatura ambiente entre 21 – 23 °C.
- Alimentar a ratones con una dieta normal de sal (0.3% NaCl) durante todo el estudio.
2. recogida de muestras de sangre
- Preparar el siguiente equipo: tubo de vacío (1 mL), aguja de la mariposa, lupa de lente y titular de restricción de plástico. Colocarlos sobre una superficie estéril (figura 1).
- Colocar un ratón en un soporte plástico de retención y lavar la cola con agua tibia (20 – 30 °C). Limpie la cola con bolas de algodón saturada en etanol de 70% para ampliar la vena. Seleccionar la vena de la cola derecha o izquierda para tomar muestras de sangre. Agarre la parte inferior de la cola suavemente y mantener la cola recta durante la toma de muestras de sangre.
- Recoger la sangre. Si al comparar métodos, recoger la sangre en dos grupos: el grupo "experimental" con el procedimiento que hemos desarrollado, presentado a continuación, y grupo "convencional" utilizando un método convencional, también se presentan a continuación.
- Colección experimental:
- Usar una lupa de lente para mejorar la visualización para punción de la vena de la cola. Inserte la punta de la aguja de 22 G mariposa una de las venas laterales de la cola en una posición aproximadamente la mitad de la distancia distal de la punta de la cola a un ángel aproximadamente 10°, hacia la base de la cola para muestras múltiples.
- Inserte el extremo de la goma de la aguja de la mariposa en el tubo de la colección de sangre vacío para recolección de sangre (figura 2).
Nota: Si la sangre deja de fluir hacia fuera durante la recolección de sangre, el ángulo de la aguja debe ajustarse rápidamente. Para evitar la coagulación de la sangre en la aguja, otra posición de punción debe ser seleccionado si sangre deje de fluir hacia fuera después de 15 s.
- Método convencional:
- Inserte la aguja conectada a una jeringa en una de las venas laterales aproximadamente un tercio de la distancia distal de la punta de la cola.
- Cuando aparece sangre en el centro, tire hacia atrás el émbolo lentamente para recoger la sangre (figura 3)7.
Nota: Para aclarar más lejos los efectos de la variable experiencia con muestras de sangre, un principiante y experto fueron elegidos para obtener muestras de sangre mediante métodos experimentales y convencionales simultáneamente.
- Colección experimental:
- Después de la recolección de sangre, retire la aguja y presione el punto de punción para detener el sangrado. A continuación, suelte el ratón desde el soporte de retención plástico y retomar el ratón de su jaula.
Nota: Se ha reportado que hasta al 10% del total de la sangre el volumen puede ser con seguridad tan cerca de 175 μl de sangre extraída de un animal sano en intervalos de 2 semanas8, recogió cada vez conforme a principios éticos. - Utilizar tubos con EDTA para obtener plasma o utilizar tubos sin anticoagulantes para recoger el suero. Invertir el tubo varias veces y ponerlos en hielo vertical suavemente.
- Centrifugar los tubos de colección de muestras de sangre en una centrífuga refrigerada a 1.000 x g durante 10 min separar el suero y plasma.
Nota: Colección de sangre exitosa se define como obtención de un volumen de 175 μl cada vez. Trató de no más de tres pinchazos y una colección de sangre se define como un volumen total de sangre de menos de 175 μl después la tercera punción. La duración del muestreo se define como el momento de la punción de la vena de la cola de retiro de la aguja después de la recolección de sangre. - Recoger la sangre dos veces a intervalos de 2 semanas8.
3. estadístico análisis
- Utilizar software estadístico disponible comercialmente para el análisis. Presentar datos como valor medio ± desviación estándar, utilizando p < 0.05 como el límite de significación estadística.
Representative Results
Cuerpo de masa, volúmenes de la colección de sangre y las duraciones de muestreo de los dos grupos
Se recolectaron muestras de sangre de 20 ratones (10 varones) dos veces a intervalos de 2 semanas en cada grupo. La masa corporal promedio de los ratones fue similar entre los grupos experimentales y convencionales para principiantes y expertos, respectivamente (42,40 g ± 1,42 g vs g 42,65 ± 1,14 g, p > 0.05; 42,55 g ± 2,91 g vs 43,20 g ± 2,69 g, p > 0.05). Volúmenes de sangre recogida y muestreo duraciones fueron similares entre los dos grupos de expertos (184.25 μl μl ± 11.95 vs 171.75 μl ± 25.61 μl, p > 0.05; min 1,85 ± de 0,68 min vs min 2,17 ± 0,80 min., p > 0.05). Sin embargo, mayores volúmenes de sangre recogida y duraciones más cortas de muestreo fueron consideradas en el grupo experimental respecto al grupo convencional en principiantes (172.00 μl μl ± 15.17 vs 148.50 μL ± 30.22 μL, p < 0.01; 3,11 min ± de 0,44 min vs min 4,08 ± de 0,61 min, p < 0.01). En comparación a los principiantes, expertos recogidos más altos volúmenes de sangre y mostraron menor muestreo veces usando métodos convencionales y experimentales (184.25 μl μl ± 11.95 vs 172.00 μl ± 15.17 μl, p < 0.01 171.75 μl μl ± 25.61 vs 148.50 μL ± 30.22 μL, p < 0.05; min 1,85 ± 0,68 min vs min 3,11 ± de 0,44 min, p < 0.01; 2.17 min ± 0,80 min vs min 4,08 ± de 0,61 min, p < 0.05) (tabla 1).
Las tasas de éxito y los tiempos de punción de los dos grupos
La comparación de las tasas de éxito entre los principiantes y los expertos fue 70% (14/20) vs 100% (20/20) (p < 0,01) en el grupo experimental y 35% (7/20) vs 85% (17/20) (p < 0,01) en el grupo convencional. También se observaron mayores tasas de éxito en el grupo experimental respecto al grupo convencional en principiantes [70% (14/20) frente al 35% (7/20), p < 0.05]. Tanto principiantes como expertos, el número de punciones fue significativamente menor en el grupo experimental respecto al grupo convencional (2,40 ± 0.75 vs 2.90 ± 0,31, p < 0.05; 1.15 ± 0,37 vs 1.55 ± 0,76, p < 0.05). En comparación a los principiantes, menores tiempos de punción para expertos se observaron utilizando métodos experimentales y convencionales. (1,15 ± 0,37 vs 2,40 ± 0,75, p < 0.01; 1.55 ± 0,76 vs 2.90 ± 0,31, p < 0.01) (Tabla 1).
Figura 1: equipo de. Se muestran tubos de colección de sangre vacío de 1 mL y una aguja 22 G de la mariposa (izquierda), una lupa de lente (medio) y un soporte plástico de retención (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: colección de sangre exitosa en el grupo experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: colección de sangre exitosa en el grupo convencional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grupo experimental | Grupo convencional | |||
| principiante | experto | principiante | experto | |
| Masa corporal (g) | 42.4±1.42 | 42.55±2.91 | 42.65±1.14 | 43.20±2.69 |
| Volumen de recogida de sangre (μL) | 172.00±15.17 | 184.25±11.95# | 148.50±30.22* | 171.75±25.61# |
| Duración del muestreo (min) | 3.11±0.44 | 1.85±0.68# | 4.08±0.61* | 2.17±0.80# |
| Tiempos de recogida de sangre | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Promedio del número de punciones | 2.40±0.75 | 1.15±0.37# | 2.90±0.31* | 1.55±0.76## * |
| Una punción de tiempo | 3 | 17 | 0 | 12 |
| Pinchar dos veces | 6 | 3 | 2 | 5 |
| Tres veces de la puntura | 5 | 0 | 5 | 0 |
| No se pudo | 6 | 0 | 13 | 3 |
| Tasa de éxito | 70% | 100%# | 35%* | 85%# |
Tabla 1: comparación de resultados entre los grupos experimentales y convencionales. * p < 0.05, ** p < 0.01, método experimental vs método convencional. #p < 0.05, ##p < 0,01, principiante y experto.
Discussion
El presente estudio describe un método de colección de sangre fácil de aprender en los ratones que es superior a las técnicas convencionales. En primer lugar, el método puede ser fácilmente dominado con una alta tasa de éxito. En segundo lugar, se basa en el principio de presión negativa del vacío y permite la continua dibujo de sangre con un riesgo reducido de exposición directa de sangre, que también reduce la posibilidad de contaminación y hemólisis9. En tercer lugar, este método es factible para muestreo frecuente de la sangre con volúmenes adecuados de los ratones durante un período corto de tiempo para los varios propósitos de la investigación. Por otra parte, el procedimiento inflige lesión mínima sólo en ratones, y recolección de sangre se puede realizar sin el uso de anestésicos; así, se puede evitar la influencia de la respuesta de estrés y anestésicos en muestras de sangre.
La vena de la cola es una ubicación superior para tomar muestras de sangre según el protocolo aprobado7. Sin embargo, no siempre es fácil obtener suficiente volumen de sangre de las venas de cola delgada con flujos de sangre. En este caso, la piel se corta generalmente abierta y vena es penetrada por una lanceta, o el extremo de la cola se elimina rápidamente por una navaja de afeitar.
Este protocolo tiene como objetivo mejorar la metodología de recolección de sangre de ratones utilizando el sistema de colección de sangre vacío, que requiere un tubo de colección de muestras de sangre, aguja de la mariposa y lupa de lente. Este sistema de muestreo de la sangre del vacío se utiliza generalmente para la recolección de muestras de sangre de pacientes en la práctica clínica diaria10. Con la ayuda de una lupa de lente, el punto perfecto de la punción de una vena de la cola es más fácil de localizar. Cuando la punta de una aguja se inserta en la vena de la cola, sangre fluirá automáticamente en el tubo de vacío debido a la presión negativa. Después de retirar la aguja de la vena de la cola, fluirá a la sangre que está bloqueada en el catéter en el tubo colector de vacío por el vacío.
Los siguientes consejos son importantes para la aplicación exitosa del método. En primer lugar, el peso de cada ratón debería ser 40 g o superior para disminuir la dificultad en la punción y obtener suficiente sangre. En segundo lugar, en el caso de colección de sangre fallido, experimentadores deben intentar retirar la aguja lentamente hasta que la sangre continúa fluyendo hacia fuera. En tercer lugar, es vital para extender la cola para evitar cualquier movimiento durante la muestra de sangre. Sosteniendo la aguja con suavidad puede ayudar a mantener la punta de la aguja en la vena como los movimientos de la cola de ratón. En cuarto lugar, si la sangre deja de fluir hacia fuera durante la recolección de sangre, el ángulo de la aguja debe ajustarse de manera oportuna. Para evitar la coagulación de la sangre en la aguja, otra posición de punción debe ser seleccionado si sangre deje de fluir hacia fuera después de 15 s. Por último, la cooperación de dos operadores se recomienda durante el uso de esta técnica para recoger la sangre de los ratones.
En Resumen, el método de recogida de la sangre del vacío adoptado para el uso en ratones es segura, factible y fácil de practicar. Este método permite frecuentes muestras de sangre con volúmenes de sangre adecuada de ratones no anestesiados.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la beca de la Fundación de Ciencias de la naturaleza de la provincia de Hubei, China [Grant No. 2018CFB761].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-pointed needle | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 20163151718 | 22G (0.7 mm x 25 mm) |
| Eyeglass magnifier | Vergroberung | 1.5x | |
| Normal salt diet for mice | Mice received a normal salt diet (0.3% NaCl) throughout the study. | ||
| Plastic holder | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 35-45 g rat hoder | |
| SPSS software for statistical analysis | SPSS Inc, Chicago; USA | Version 17.0. | |
| Syringe | Shandong wego Medical polymer products co. LTD., China | 20160911A | 1 mL (Matching needle size: 0.45×16RW LB) |
| Vacuum blood collection system | Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China | 20171222 | 1 mL (Φ12.4×L75) |
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