Summary
Denna studie rapporterar blodprovstagning från svans ven i möss med en vakuum extraktion rörledningssystemet med monokel förstoringsglas. Vår metod är lätt att öva och kunde användas för upprepade blodprov hos möss.
Abstract
Blod provtagning är grunden för experimentell forskning på djur. Det är viktigt att erhålla adekvat blodprov för olika forskningsändamål. Svans venerna i möss är små, och det är ibland svårt att få krävs blodvolymen genom konventionella punktering metoder. Denna studie undersöker överlägsenhet av upprepade blod provsamling från svans venerna i möss genom användning av ett vakuum blod insamling systemet och glasögon förstoringsglas (experimentgruppen) jämfört med konventionella blodprovstagning metoder (konventionella gruppen) , utförs av nybörjare och experter, respektive. Med hjälp av en monokel förstoringsglas infogas en fjäril nålspetsen i svansen venen i varje mus i den experimentella gruppen. När venen blir penetrerad framgångsrikt, samlas ett blodprov i vakuum samling röret genom införande av gummi slutet av en fjärilsnål i det vakuum bloduppsamlingsrör. Kolven används sedan för att samla blod utan hjälp av glasögon förstoringsglaset i gruppen konventionella. Andelen framgångsrika för blod provtagning av nybörjare och experter visade sig vara 70% vs. 100% (p < 0,01) i experimentgruppen och 35% jämfört med 85% (p < 0,01) i gruppen konventionella. För både nybörjare och experter var punktering gånger krävs för att få krävs blodprov betydligt lägre i den experimentella gruppen jämfört med konventionella gruppen (2.40 ± 0,75 vs. 2.90 ± 0,31, p < 0,05; 1,15 ± 0,37 vs. 1,55 ± 0,76, p < 0,05). Avslutningsvis presenteras blod provtagning tekniken är genomförbart och lätt att träna och gör frekvent provtagning av adekvat blod volymer från icke-sövd möss.
Introduction
Blodprovstagning från djur som är inblandade i experiment är en grundläggande forskning teknik. Det finns några tillgängliga metoder för blodinsamling av från möss, inklusive svans snips och punktera av hjärtat, retro-orbital plexus, halsvenen, caudal ven och vena cava. Helst bör blod samlas i ett minimalt invasivt sätt, med minimal inverkan på djurens hälsa. Men de vanligaste teknikerna ofta orsaka stress på djur och kan påverka forskning resultat1. Blodinsamling från retro-orbital plexus kan användas för att erhålla tillräckligt blodvolym från möss2. Men, det kan resultera i svår vävnadsskada och tillåter inte för att få blodet upprepade gånger i kort tid intervall3.
Den kaudala ven är en överlägsen plats för blodinsamling av, som orsakar minimal skada på möss. Dock svans venerna i möss är tunna, och det är ibland svårt att få tillräckligt med blod genom konventionella punktering teknik. I vissa fall krävs upprepade punkteringar för att få önskad blodvolym. Anestesi är också allmänt rekommenderas att underlätta blodprovstagning från svans venerna i möss. Dessutom kan en skalpell, rak kant rakblad eller vass sax behövas ta bort ändarna på svansar att erhålla den nödvändiga blod prov4. Vi har tidigare rapporterat framgångsrika blodinsamling från svans venerna i icke-nedsövd råttor i det vakuum blod prov insamlingssystemet, vilket minskade risken för blod föroreningar och undvika behovet av upprepade punkteringar5. Denna studie rapporterar liknande blod insamling metoder i icke-sövd möss.
Protocol
1. djurhållning
- Använd 12 veckor gammal Kunming möss.
Obs: Vi använde möss (n = 40, 20 män, 37 – 46 g, menar 42.38 ± 2.39 g) från den experimentella djur Center i Tongji Medical College. - Hus på möss under standart villkorar med fri tillgång till mat och dricksvatten. Hålla två möss i en 530 cm2 bur med trä rakning sängkläder.
- Upprätthålla en rumstemperatur mellan 21 – 23 °C.
- Mata möss med en normal salt kost (0,3% NaCl) under hela studien.
2. blod provsamling
- Förbered följande utrustning: vakuumrör (1 mL), fjärilsnål, monokel förstoringsglas och besöksförbud plasthållare. Placera dem på en steril yta (figur 1).
- Placera en mus i ett besöksförbud plasthållare och tvätta stjärten med varmt vatten (20 – 30 °C). Torka svansen med 70% etanol-mättade bomullstussar att expandera venen. Välj höger eller vänster svans venen för blodprovstagning. Förstå den nedre delen av svansen försiktigt och hålla svansen rakt under blod provsamling.
- Samla in blod. Om jämföra metoder, samla in blod i två grupper: ”experimental” gruppen med hjälp av proceduren som vi har utvecklat, presenteras nedan, och ”konventionella” gruppen med en konventionell metod, också presenteras nedan.
- Experimentell samling:
- Bära en monokel förstoringsglaset för att förbättra visning för punktering av venen som svans. Infoga 22 G fjäril nålens spets i en av laterala svans vener på en ställning cirka halva sträckan distalt från spetsen av svansen på en ängel ca 10°, mot basen av svansen för flera prover.
- Infoga gummi slutet av fjäril nålen i det vakuum bloduppsamlingsrör samla blod (figur 2).
Obs: Om blodet slutar flöda ut under blodinsamling, nål vinkeln snabbt justeras. För att undvika koagulation i nålen, en annan punktering position bör väljas om blodet slutar flöda ut efter 15 s.
- Konventionell metod:
- För in nålen ansluten till en spruta in i laterala venerna ungefär en tredjedel av avståndet distalt från spetsen av svansen.
- När blodet visas i navet, dra tillbaka kolven långsamt för att samla in blod (figur 3)7.
Obs: För att ytterligare belysa effekterna av varierande erfarenhet med blodinsamling, en nybörjare och expert valdes för att samla in blodprov med experimentella och konventionella metoder samtidigt.
- Experimentell samling:
- Efter blodinsamling, nålen och tryck på punktering poängen att stoppa blödning. Sedan släpper musknappen från besöksförbud plasthållare och återgå musen till sin bur.
Obs: Det har rapporterats att upp till 10% av totala blod volym kan säkert bort från ett friskt djur på 2 veckors intervall8, så ca 175 µL blod samlades varje gång i enlighet med etiska principer. - Använda rör med EDTA för att samla plasma och använda rören utan antikoagulantia för att samla serum. Försiktigt Invertera röret flera gånger och sätta dem på isen vertikalt.
- Centrifugera blodet provet samling rören i en kyld centrifug vid 1 000 x g i 10 min att separera plasma och serum.
Obs: Framgångsrik blodtappning definieras som att erhålla en volym av 175 µL varje gång. Högst tre punkteringar bör utföras, och en misslyckad blodinsamling definieras som en total blodvolym på mindre än 175 µL efter tredje punkteringen. Provtagning varaktighet definieras som tiden från svans ven punkteringen till borttagning av nålen efter blodtappning. - Samla in blod två gånger i intervaller om 2 veckor8.
3. statistisk analys
- Använda kommersiellt tillgängliga statistisk programvara för analys. Presentera data som medelvärde ± standardavvikelse, använder p < 0,05 som cutoff för statistisk signifikans.
Representative Results
Kroppsmassa, blod insamling volymer och provtagning varaktigheter för de två grupperna
Blodprover samlades från 20 möss (10 hanar) två gånger med 2 veckors intervall i varje grupp. Genomsnittlig kroppsmassa möss var likartad mellan de experimentella och konventionella grupperna för nybörjare och experter, respektive (42.40 g ± 1,42 g vs 42.65 g ± 1.14 g, p > 0,05; 42.55 g ± 2,91 g vs 43,20 g ± 2,69 g, p > 0,05). Insamlade blodet volymer och provtagning varaktigheter var liknande mellan de två grupperna i experter (184.25 µL ± 11.95 µL vs. 171.75 µL ± 25,61 µL, p > 0,05; 1,85 min ± 0,68 min vs. 2.17 min ± 0.80 min, p > 0,05). Dock sågs högre insamlade blodet volymer och kortare provtagning varaktigheter i experimentella gruppen jämfört med konventionella gruppen i nybörjare (172.00 µL ± 15.17 µL vs. 148.50 µL ± 30,22 µL, p < 0,01; 3.11 min ± 0,44 min vs. 4.08 min ± 0,61 min, p < 0,01). Jämfört med nybörjare, experter samlas in högre blod volymer och visade lägre provtagning tider med hjälp av experimentella och konventionella metoder (184.25 µL ± 11.95 µL vs. 172.00 µL ± 15.17 µL, p < 0,01; 171.75 µL ± 25,61 µL vs. 148.50 µL ± 30,22 µL, p < 0,05; 1,85 min ± 0,68 min vs 3.11 min ± 0,44 min, p < 0,01; 2.17 min ± 0.80 min vs. 4.08 min ± 0,61 min, p < 0,05) (tabell 1).
Framgångsrika och punktering gånger av de två grupperna
Jämförelse av framgång priser mellan nybörjare och experter var 70% (14/20) vs. 100% (20/20) (p < 0,01) i experimentgruppen och 35% (7/20) jämfört med 85% (17/20) (p < 0,01) i gruppen konventionella. Högre andelen framgångsrika sågs också i experimentella gruppen jämfört med konventionella gruppen i nybörjare [70% (14/20) respektive 35% (7/20), p < 0,05]. Både nybörjare och experter var antalet punkteringar signifikant lägre i de experimentella gruppen jämfört med konventionella gruppen (2.40 ± 0,75 vs. 2.90 ± 0,31, p < 0,05; 1,15 ± 0,37 vs. 1,55 ± 0,76, p < 0,05). Jämfört med nybörjare, observerades lägre punktering gånger för experter med experimentella och konventionella metoder. (1,15 ± 0,37 vs. 2.40 ± 0,75, p < 0,01, 1,55 ± 0,76 vs. 2.90 ± 0,31, p < 0,01) (Tabell 1).
Figur 1: utrustning. Visas är 1 mL vakuum blod insamling rör och en 22 G fjärilsnål (vänster), en monokel förstoringsglas (mitten) och en återhållande plasthållare (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: framgångsrik blodtappning i experimentgruppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: framgångsrik blodtappning i gruppen konventionella. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Experimentella gruppen | Konventionella gruppen | |||
| nybörjare | expert | nybörjare | expert | |
| Kroppsmassa (g) | 42.4±1.42 | 42.55±2.91 | 42.65±1.14 | 43.20±2.69 |
| Insamlade blodvolym (µL) | 172.00±15.17 | 184.25±11.95# | 148.50±30.22* | 171.75±25.61# |
| Provtagning varaktighet (min) | 3.11±0.44 | 1.85±0.68# | 4.08±0.61* | 2.17±0.80# |
| Blod insamling gånger | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Genomsnittligt antal punkteringar | 2.40±0.75 | 1.15±0.37# | 2.90±0.31* | 1.55±0.76## * |
| En tid punktering | 3 | 17 | 0 | 12 |
| Två gånger punktera | 6 | 3 | 2 | 5 |
| Tre gånger punktera | 5 | 0 | 5 | 0 |
| Misslyckades | 6 | 0 | 13 | 3 |
| Framgång | 70% | 100%# | 35%* | 85%# |
Tabell 1: jämförelse av resultat mellan grupperna experimentella och konventionell. * p < 0,05, ** p < 0,01, experimentell metod kontra konventionell metod. #p < 0,05, ##p < 0,01, nybörjare vs. expert.
Discussion
Föreliggande studie beskriver en lätt att lära blod insamlingsmetod hos möss som är överlägsen konventionella tekniker. Första kan metoden bemästras enkelt med en hög framgång. För det andra, det är baserat på principen om vakuum undertryck och möjliggör kontinuerlig ritning av blod med minskad risk för direkt blodexponering, vilket också minskar risken för kontaminering och hemolys9. För det tredje, denna metod är genomförbart för frekvent provtagning av blod med tillräckliga volymer från möss under en kort tidsperiod för olika forskningsändamål. Dessutom förfarandet tillfogar endast minimal skada på möss, och blodinsamling kan utföras utan användning av bedövningsmedel; Således, påverkan av stress respons och bedövningsmedel på blodprov kan undvikas.
Svans venen är en överlägsen plats för blodprovstagning enligt godkända protokoll7. Dock är det inte alltid lätt att få tillräcklig blodvolym från tunn svans vener med låga flöden. I detta fall, huden är vanligtvis uppskuren och ven blir penetrerad av en lansett, eller slutet av svansen avlägsnas snabbt genom en rakhyvel.
Detta protokoll syftar till att förbättra metodiken för blodinsamling från möss använder vakuum blod insamlingssystemet, som kräver en vakuum bloduppsamlingsrör för prov och fjärilsnål monokeln förstoringsglas. Detta vakuum blod provtagningssystem som vanligtvis används för insamling av blodprov från patienter i daglig klinisk praxis10. Med hjälp av en monokel förstoringsglas är den perfekta punktering en svans ven lättare att hitta. När spetsen av en nål sätts in i svansen venen, kommer automatiskt blodflödet i vakuum röret på grund av undertryck. Efter drar nålen från svans venen, kommer som blockeras i katetern blodflödet till samlande vakuumrör på grund av vakuum.
Följande tips är viktiga för framgångsrik tillämpning av metoden. Först varje mus kroppsvikt bör vara 40 g eller högre för att minska svårigheten i punktera och få tillräckligt med blod. Andra, när det gäller misslyckade blodinsamling, praktiker bör försök att dra ut injektionsnålen långsamt tills blodet fortsätter att strömma ut. För det tredje är det nödvändigt att förlänga svansen för att undvika någon rörelse vid blodprovstagning. Hålla nålen försiktigt kan hjälpa till att hålla kanylspetsen i venen så musen svans flyttas. Om blodet slutar flöda ut under blodinsamling, fjärde justeras nål vinkeln i tid. För att undvika koagulation i nålen, en annan punktering position bör väljas om blodet slutar flöda ut efter 15 s. Slutligen rekommenderas i samarbete med två operatörer medan du använder denna teknik för att samla blod från möss.
Kort sagt, är metoden antagna vakuum blod insamling för användning i möss säker, genomförbart och lätt att träna. Denna metod gör frekvent provtagning av blod med tillräcklig blod volymer från icke-sövd möss.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av naturen Science Foundation beviljandet av Hubei-provinsen, Kina [Grant No. 2018CFB761].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-pointed needle | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 20163151718 | 22G (0.7 mm x 25 mm) |
| Eyeglass magnifier | Vergroberung | 1.5x | |
| Normal salt diet for mice | Mice received a normal salt diet (0.3% NaCl) throughout the study. | ||
| Plastic holder | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 35-45 g rat hoder | |
| SPSS software for statistical analysis | SPSS Inc, Chicago; USA | Version 17.0. | |
| Syringe | Shandong wego Medical polymer products co. LTD., China | 20160911A | 1 mL (Matching needle size: 0.45×16RW LB) |
| Vacuum blood collection system | Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China | 20171222 | 1 mL (Φ12.4×L75) |
References
- Grouzmann, E., et al. Blood sampling methodology is crucial for precise measurement of plasma catecholamines concentrations in mice. European Journal of Physiology. 447 (2), 254-258 (2003).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: a comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Lab Animal. 44 (4), 352-358 (2010).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Lab Animal. 43 (3), 255-260 (2009).
- Hoff, J.
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Wollowitz, A., Bijur, P. E., Esses, D., John Gallagher, E. Use of butterfly needles to draw blood is independently associated with marked reduction in hemolysis compared to intravenous catheter. Academic Emergency Medicine. 20 (11), 1151-1155 (2013).
- Eder, J. M., Cutter, G. R. A new device for collecting cord blood. Obstetrics and Gynecology. 86 (5), 850-852 (1995).
