Summary
Vi præsenterer her, en protokol for fortløbende målrettede kvantificering og ikke-målrettet analyse af fluorholdige forbindelser i vand ved massespektrometri. Denne metode giver kvantitative niveauer af kendte fluorochemical forbindelser og identificerer ukendte kemikalier i beslægtede prøver med semi-kvantitative skøn over deres overflod.
Abstract
Historiske og nye per- og polyfluoroalkyl stoffer (PFASs) har vundet betydelig interesse fra de offentlige og offentlige institutioner fra lokalt til føderale niveauer. Den fortsatte udvikling af PFAS kemi er en udfordring til miljøovervågning, hvor igangværende udvikling af målrettede metoder nødvendigvis halter opdagelsen af nye kemiske forbindelser. Der er behov for, derfor har fremadrettede metoder, der kan opdage nye og uventede forbindelser, overvåge disse arter over tid og løse detaljer af deres kemiske struktur til at aktivere fremtidige arbejde i menneskers sundhed. Med henblik herpå, ikke-målrettet analyse af høj opløsning massespektrometri tilbyder en bred base påvisning tilgang, der kan kombineres med næsten alle stikprøveprogram forberedelse og giver betydelige muligheder for sammensatte identifikation efter detektering. Heri, vi beskriver en solid-fase ekstraktion (SPE) baseret prøve koncentration metode tunet til kortere kæde og mere hydrofile PFAS kemi, som per fluorholdige ether syrer og sulfonater, og beskrive analyse af prøver forberedt på denne måde i både målrettede og ikke-øremærket tilstande. Målrettede metoder til at give overlegen kvantificering når referencestandarder findes men er uløseligt begrænset til forventede forbindelser, når du udfører analyse. I modsætning hertil er kan en ikke-målrettet tilgang identificere tilstedeværelsen af uventede forbindelser og give nogle oplysninger om deres kemiske struktur. Oplysninger om kemiske funktioner kan bruges til at korrelere forbindelser på tværs af prøven steder og spore overflod og forekomsten over tid.
Introduction
Klasse af pr- og polyfluoroalkyl stoffer (PFASs) er persistente organiske miljøgifte med væsentligt folkesundhedsproblem. Særlige forbindelser perfluorooctanoic acid (PFOA) og perfluorooctanesulfonate (PFOS) har drikkevand sundhed rådgivende niveauer af EPA1,2 og deres store amerikanske produktion ophørte i 2000s3,4 . For at opnå en betydelig forståelse for egenskaberne for PFAS er materialer i tekstil og forbruger produkt fremstilling kugler, hundredvis, hvis ikke tusinder, af alternative PFAS kemi blevet udviklet for at udfylde produkt nicher, herunder erstatninger for den forældede forbindelser5,6,7,8. Der er en igangværende skal overvåge de miljømæssige niveauer af straight kæde perfluorinated carboxylsyrer og perfluoroktansulfonater sådan PFOS, PFOA og deres homologe serier, men nye kemiske forbindelser er ikke omfattet af etablerede metoder såsom EPA Metode 5379 og ofte manglende analysestandarder for traditionelle målrettet analyse. Hensigten med denne protokol er således to gange. Det giver en sti til den målrettede LC-MS/MS analyse af fluorochemical arter i vand hvor analysestandarder er tilgængelige og detaljer problemfri integration af en ikke-øremærket, høj opløsning massespektrometri-baseret tilgang til analyse af data der giver mulighed for påvisning af ukendt eller uventet forbindelser i de samme prøver.
Fast-fase ekstraktion (SPE) er en etableret teknik til at prøve oprydning og koncentration med programmer til mange analysander og prøve matricer10,11. For PFAS analyse, flere solid retentive faser herunder ikke-polære, functionalized polar og ionbytning kolonner har været anvendt i varierende omfang til underklasser af fluorholdige arter i en bred vifte af matricer9,12, 13,14,15,16. Fremskridt i SPE prøve analyse ved hjælp af on-line opsætninger høj grad øge gennemløbet af tilgangen og forbedre reproducerbarhed af prøven håndtering, men den grundlæggende proces forbliver konsistent17. Nogle indsats for at fjerne offline koncentrationen af SPE-selskabet ved hjælp af store volumen injektioner er også blevet gennemført, men disse kræver ændringer til kromatografien, der placerer dem uden for realm af casual analyse18,19 . Vores prøve analyse bruger et polymert svage anion exchange (voks) retentive fase at grundigt adskille sure PFAS materialer fra de traditionelle organiske forurenende stoffer samtidig opnå betydelige prøve koncentration faktorer. Denne voks fase er vigtig at fange de kortkædede perfluorinated syrer som perfluorobutane sulfonat (PFBS) eller perfluorinated ethere såsom hexafluoropropylene oxid dimer syre (HFPO-DA), som er mere polære end den længere kæde arv perfluorinated art20,21. Da der har været et betydeligt skift i retning af kortere fluorholdige kæder og ether integration i de seneste PFAS kemi5, kan denne fase mere grundig genoprettelse af roman forbindelser til MS analyse.
Målrettet LC-MS/MS kvantitering bruger godkendte standarder og stabil isotop mærket interne standarder giver en uovertruffen grad af specificitet og sensitivitet til kvantitativ analyse. Denne tilgang er ønskeligt i mange situationer, men det er upraktisk for alt for almindelige situationer i analyse. Målrettede strategier virker kun til arter, der er forventet i prøven, og hvilke metoder har tidligere været etableret. For nye og kommende forbindelser med denne tilgang er i stand til selv opdage arter, som kan være af interesse, uanset deres kemi eller koncentration, og lav opløsning massespektrometre er næsten i stand til at levere tilstrækkelige oplysninger til at gøre utvetydig kemiske tildelinger af ukendt forbindelser. Derfor opstået inden for ikke-målrettet analyse, udnytte kraften i høj opløsning moderne massespektrometre at analysere prøver uden en forudsatte hypotese og med tilbagevirkende kraft tildele kemikalier til påviselige funktioner i prøven. Denne tilgang har været udbredt inden for biologi22,23,24 og miljøvidenskab25,26,27 på mange klasser af kemikalier. Perfluorerede kemikalier er særligt ligetil at identificere i denne metode på grund af deres unikke masse spektrale mønstre, og hundredvis af forbindelser er blevet beskrevet i blot de sidste par år5,28.
Protokollen drøftet her er beregnet til at justere målrettede LC-MS/MS PFAS kvantitering med behovet for at identificere og semi-kvantitativt overvåge nye forbindelser af interesse. SPE fase udvælgelse og prøve forberedelse teknikker er beregnet til at sikre erobringen af mere hydrofile nye PFAS syrer fra vand og kan være mindre egnet til længere kæde polymere arter og ikke-ionisk. Yderligere, de data, der genereres af ikke-målrettet analyse er tætte og af høj dimensionalitet, som nødvendiggør brug af data analyse software. Disse softwarepakker er ofte leverandør specifikke og kræver ændring at operere mellem instrument platforme. Om muligt, analyse proces er blevet beskrevet i en generisk mode og open source/freeware alternativer der refereres til, men effektiviteten og nøjagtigheden af nogen software tilgang skal vurderes på et individuelt grundlag.
Protocol
1. indsamling af vandprøver
- Forberedelse af PFAS Standard bestande
- Forbered en PFAS standard blanding i methanol indeholdende alle målrettede forbindelser af interesse (f.eks., PFOA, PFOS, HFPO-DA) på 1 ng/µL. Dette er den oprindelige PFAS blanding. Kommercielt tilberedt blandinger er også tilgængelige (dvs. PFAC blanding A og Mix B).
- Forbered en standard blanding indeholdende matchede stabil isotop mærket (SIL) PFAS forbindelser (f.eks. 13C4- PFOA, 13C8- PFOS, 13C3- HFPO-DA) på 1 ng/µL. Dette er er PFAS blanding. Kommercielt tilberedt blandinger er også tilgængelige (dvs. MPAFC blanding A og Mix B).
Bemærk: Hvis en SIL version af den målrettede PFAS er tilgængelig, et surrogat med lignende struktur og kæde længde kan bruges (fx 13C2- PFHxA for HFPO-DA)
- Forberedelse af feltet tomt (FB), Spike tom (SB) prøver
- Fylde to, ren high density polypropylen (HDPE) eller polypropylen (PP) flasker med 1.000 mL laboratorium deioniseret (DI) vand, kendt for at være PFAS gratis.
Forsigtig: PFAS materialer ofte har udefineret toksicitet og/eller kræftfremkaldende virkning. Bør udvises forsigtighed at undgå oral eller hud udsættelse for standarder eller stamopløsninger. - Tilføje en mængde af PFAS standard blanding til en af flaskerne i en endelig koncentration svarer til de forventede prøve koncentrationer (f.eks. 100 ng/L). Dette er Spike tom (SB).
- Tilsættes 5 mL 35% salpetersyre konserveringsmiddel til Spike tom.
- Bære både SB prøve og unspiked felt blank til prøveudtagning placering som kontrol.
- Fylde to, ren high density polypropylen (HDPE) eller polypropylen (PP) flasker med 1.000 mL laboratorium deioniseret (DI) vand, kendt for at være PFAS gratis.
- Feltet prøveudtagning
Bemærk: Prøve collector bør bære nitrilhandsker og prøve fra strømmende systemer, hvor det er muligt. Tap prøver må til at flyde og reagensglasset før prøvetagning (2-3 min).- Indsamle 500-1.000 mL vand fra feltet placering i en ren HDPE eller PP flaske.
- Tilsættes 5 mL 35% salpetersyre konserveringsmiddel til prøven flasker og feltet være tomt.
Forsigtig: salpetersyre er ætsende og et stærkt oxidationsmiddel
2. prøven udvinding
Bemærk: PFAS er allestedsnærværende og vedvarende. Sikre, at alle opløsningsmidler er af den højeste kvalitet og er blevet analyseret for lavt niveau PFAS forurening. Grundigt skyl alle laboratorieudstyr bruges til at forberede standarder før forberede blindprøver og prøver.
- Prøven forbehandling
- Hæld hver prøve i en separat, forhånd renset 1 L HDPE dimitterede cylinder og registrere det nøjagtige volumen.
- Der tilsættes 10 mL methanol til tømte prøve flaske, cap det og ryst godt for at skylle adsorberet PFAS fra flaske interiør.
- Returnere den målte vandprøven til skylles flasken med methanol skyl.
- Standardkurven for kvantitering
- Udfylde otte, 1 L HDPE/PP flasker med PFAS-fri osmosevand.
- Vælg otte jævnt fordelte koncentrationer der dækker de ønskede kvantitering vifte. For eksempel: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750 og 1000 ng/L for en række 10-1.000 ng/L.
- Tilføje en mængde af indfødte PFAS mix til hver flaske til at give de endelige PFAS koncentrationer i 2.2.2 (f.eks. 100 µL PFAS Mix A til 1L DI vand = 100 ng/L).
- Intern standard tilsætning
Bemærk: Tilsætning af stabil isotop mærket intern standard (IS) er kun nødvendigt hvis kvantitative resultater er ønsket ud over ikke-målrettet analyse.- Tilføje er PFAS blandingen til hver prøve i en koncentration på tilnærmelse af midtpunktet af kalibreringskurven (f.eks. 250 µL af er PFAS mix = 250 ng/L)
- Filtrering
- Filtrer prøver gennem GF/A glas fiber filtre (47 mm, 1,6 µm porestørrelse) under blid vakuum ind en pre rengjort 1 L HDPE sugekolbe.
- Hvis partikler forbliver i flasken, skylles med yderligere deioniseret vand ind i filteret. Returnere filtreret vand til prøve flaske eller en ny container for faste fase udvinding.
- Faste fase ekstraktion (SPE)
Bemærk: Patron koncentration beskrevet her bruger en konstant strøm stempelpumpe. Alternative metoder til koncentration ved hjælp af et vakuum mangfoldige20 eller en on-line SPE-LC-MS17 opsætning er muligt men ikke diskuteres.- Betingelse en svag anion exchange (voks) patron med 25 mL methanol.
- Betingelse voks patronen med en yderligere 25 mL deioniseret vand.
- Position pumpe tegne slangen i filtreret prøve flasker og etiket SPE patroner med tilsvarende prøve navne.
- Pumpe 500 mL prøve vand gennem patron ved en konstant gennemstrømningshastighed på 10 mL/min. (500 mL i alt), udsmid gennemstrømnings-flydende affald.
Bemærk: Større eller mindre mængder kan være koncentreret afhængigt af forventede prøve koncentrationer. - Fjern blækpatronen fra stempelpumpe til eluering.
Bemærk: Hvis koncentrere sig yderligere prøver ved hjælp af den samme pumpe, stempelpumpe skal tømmes med 25 mL methanol før du installerer den næste patron for ækvilibrering. - Overføre SPE patron til et vakuum manifold og udstyre med eksterne glas reservoir.
- Skyl SPE patron med 4 mL 25 mm, pH 4,0 natrium acetat buffer under blid vakuum. Kassér gennemstrømningen. Vaske SPE patron med 4 mL neutral methanol.
Bemærk: Neutral vask brøkdel kan afhentes, hvis specifikke nonionisk polar analysander forventes. Ellers, kassere affald - Placere en 15 mL polypropylen centrifugeglasset under hver SPE patron til at indsamle elueringsvæsken. Elueres prøve med 4 mL af 0,1% ammoniumhydroxid i methanol.
- Fjerne eluering tube og reducere eluatet volumen til 500-1.000 µL af fordampning under tør nitrogen stream i et vandbad ved lidt forhøjet temperatur (40 ° C).
- Koncentreret prøve ekstrakter kan opbevares inden analyse ved stuetemperatur.
- Målrettet LC-MS/MS kvantitering
- Fortyndet 100 µL af prøven uddrag med 300 µL af 2 mM ammonium acetat buffer i en HPLC prøve hætteglas.
- Kalibrere og Blandingen henstår en HPLC og MS systemer ifølge producentens anvisninger.
Bemærk: Baggrunden PFAS er almindeligt opdaget på grund af brugen af fluorpolymer komponenter for de fleste LC systemer og i prøven hætteglas septa. Bekræfte, at de påviselige mængder i tomme ubetydelig før brug. Ændring af LC systemet skal erstatte Teflon komponenter er foreslået, hvor det er muligt. Brug af en analytisk "hold-up" kolonne støder op til LC blandeventil er også foreslået29. - Forberede en analytisk worklist bestående af standardkurven, prøver og en yderligere replikat af standardkurven at vurdere apparatskred på tværs af flugt. Et eksempel worklist er vist i tabel 1.
- Analysere prøverne ved hjælp af LC og MS metoder, der fastsættes for den målrettede forbindelser af interesse. Eksempel LC gradient er vist i tabel 2 og MS metodeparametre er vist i tabel 3 og tabel 4. Yderligere kan detaljeret diskussion findes i McCord et al.21.
- Generere en standardkurve fra de standard prøver ved hjælp af forholdet mellem toparealerne af analysand til den interne standard versus koncentrationen af analysanden. Generere en kvadratisk regression formel med 1 / x vægtning for koncentration forudsigelse9.
- Kvantificere målrettede analysander i hver prøve ved hjælp af rede standard kurver og forholdet mellem toparealerne (standard område / område) for hver måling.
- Hvis koncentrationen overstiger kalibreringsområdet, fortyndes den oprindelige prøve med Deioniseret vand tilsat passende er koncentration og Udpak igen at bringe koncentration i rækken egnede.
- Ikke-målrettet indsamling af LC-MS/MS data
- Fortyndet 100 µL af prøven uddrag med 300 µL af 2 mM ammonium acetat buffer i en HPLC prøve hætteglas.
- Kalibrere og Blandingen henstår en HPLC og høj opløsning MS ifølge producentens anvisninger.
- Forberede en analytisk worklist som 2.6.2.
- Ved hjælp af instrumentet software, indsamle LC-MS data med en bred scanning MS1 i data-afhængige tilstand at indsamle MS/MS. eksempel LC gradient i tabel 5. Yderligere diskussion af Apparatindstillingen kan findes i Strynar et al.30 og Newton et al.31.
Bemærk: For forbedret MS/MS kvalitet data-afhængige analyse kan gennemføres med en foretrukne ion listen af et undersæt af funktioner tilbage efter databehandling i 2.8.1-2.8.8.
- Ikke-målrettede databehandling
Bemærk: Dataanalyse kan udføres med en bred vifte af software og disse metoder afspejler ikke den eneste eller bedste metode til en vilkårlig datasæt. Hvor det er muligt, foretage en generisk beskrivelse, der kan udføres i alternative software. Behandling af den eksempel, der anvendes i dette manuskript blev udført ved hjælp af leverandør specifikke software (Software 1 og Software 2) som beskrevet i Newton et al.31.- Udføre molekylære funktion udvinding af kemiske egenskaber ved hjælp af en af flere open source software pakker32,33 eller sælger software til at identificere monoisotopic masserne, retentionstider og integreret toparealer af kemiske funktioner.
- Vælg i Software 1, Tilføj/Fjern eksempelfiler > Tilføj filer og vælge de rå data fra ikke-øremærket eksperimentet og derefter ramte OK.
- I Software 1 Vælg Batch rekursiv funktion udvinding > åben metode... at indlæse en preestablished metode, eller manuelt redigere softwareindstillinger. Profinder indstillinger for funktionen udvinding findes i tabel 6.
- I Software 1, efter funktionen udvinding, Vælg fil > Eksporter som CSV..., fil > Eksporter som CEF..., eller fil > Eksporter som PFA... til videreforarbejdning. CEF filer er antaget for den resterende del af beskrivelsen.
- I Software 2 (MPP) oprette et nyt eksperiment med Type uidentificeret og arbejdsgangstype Guiden Importer Data , og klik på OK.
- I MPP Vælg datafiler og Find de eksporterede Software 1 resultater (enten CEF eller PFA) til indfoersel; Klik næste indtil Justering Parameter indstillinger vises.
- LPF, angive de sammensatte justeringsværdier til 0,0 (justering blev allerede udført i funktionen udvinding af Software 1, trin 2.8.1.2) og klik derefter næste gennem trinene indtil Finish er tilgængelige.
- Filtrer identifikationer baseret på analytiske reproducerbarhed. Hvis der foreligger flere Kontraprøverne, der udtages, funktioner bør være til stede i > 80% af enkelte replikater og har en analytisk variationskoefficient (CV) < 30%
- På LPF Vælg eksperimentel Opsætning > eksperiment gruppering og tildele hver rå fil en gruppe, der svarer til dens oprindelse stikprøve (dvs., replikater fra samme kilde bør være i samme gruppe). Flere grupper kan oprettes svarende til indlejrede variabler (fx instrumental vs tekniske replikater).
- På LPF Vælg eksperimentel Opsætning > Opret fortolkning derefter vælge parameteren eksperiment (dvs. gruppere) og klik på næste , indtil Finish er tilgængelige. Dette vil oprette en kategori der fremtidige filtrering kan operere på.
- På LPF Vælg kvalitetskontrol > Filtrer efter frekvens. Sæt enhed liste til Alle enheder og fortolkning at prøve Group(non-averaged) oprettet i 2.8.2.2, så ramt næste.
- For inputparametre, indstille enhed fastholdelse på 80% af stikprøven i mindst én betingelse og derefter Klik på næste , indtil Finish er tilgængelige. Navn på listen frekvens filtreret funktioner
- På LPF Vælg kvalitetskontrol > Filter på prøve variation. Indstille listen enhed til frekvens filtreret funktioner fra 2.8.2.4 og fortolkning til Group(non-averaged), derefter ramte næste.
- Vælg alternativknappen for Rådata og interesse vifte af koefficienten for variationen < 30%. Klik på Næste > Udfør og gemme listen som CV filtreret funktioner.
- Fjern funktioner hvor ingen prøver har væsentligt højere (> 3 fold) overflod end tomt felt (FB) stikprøven.
- På LPF Vælg analyse > Fold ændring. Sæt enhed liste til CV filtreret funktioner og fortolkning at prøve gruppe derefter slå næste. Vælg indstillingen fold Skift til alle mod enkelt betingelse og vælg betingelse FB eller hvad gruppenavnet for den forarbejdede blindprøve var.
- På den følgende skærm, indstille Fold-Change cutoff til 3.0 og klikke sig igennem til slutningen af vejledningen. Gemme listen som FC filtreret liste.
- Udfører binær sammenligning af individuelle prøver af interesse mod en passende baggrund prøve (fx opstrøms vs neden for en punktkilde) til at bestemme fold-ændringer til individuelle kemiske egenskaber.
- På LPF Vælg analyse > Filter på vulkanen afbilde. Angiv listen enhed til FC filtreret liste og fortolkning til gruppen.
- Fold-ændring betingelse par vælge to prøver til sammenligning (f.eks. en parret opstrøms og nedstrøms prøve) og vælg test Mann-Whitney uparret.
- For foreløbig analyse, ikke vælge en værdi til flere test korrektion på følgende skærmbillede, klikke sig igennem til resultatet plottet.
- Vælg en fold-change cutoff 3.0 og en p-værdi cutoff til 0,1 på skærmbilledet resultater. Derefter Finish og eksportere listen som Prelim resultater.
- For hver funktion, der er tilbage efter filtrering, skal du generere forudsagte kemiske formula(s) fra den nøjagtige masse og sammensatte masse spektrum.
- Vælg i MPP, resultater fortolkning > IDBrowser id og enhed Prelim resultatlisten.
- Vælg identificere alle forbindelser ved hjælp af Molekylær formel generator (MFG) som identifikationsmetode, der i IDBrowser.
- I formlen generere indstillinger tilføje F til kolonnen elementer og angive maksimalt til 50, så vælg Afslut. Vælg Gem og vende tilbage til at vende tilbage til MPP efter formel generation.
- I MPP, højreklikke på den filtrerede og MFG matchede enhed liste og vælg Eksporter listen. Gem resultaterne.
- Undersøge monoisotopic massen af arter på funktionslisten over reducerede signifikant kemiske for dem, der indeholder masse defekter vejledende af fluorination; Se form og Fiehn34.
- Bemærk kemiske serien indeholder fælles polyfluorination motiver (CF2 af (m/z 49.9968), CF2O (m/z 65.9917), CH2CF2O (m/z 80.0074), osv.) ved hjælp af en masse defekt plot eller software algoritme; Se diskussion afdeling, Liu et al.17, Loos et al.35 og Dimzon et al.36.
- Søg forudsagte kemiske formler eller neutral masserne mod EPA kemi Dashboard-databasen og/eller andre databaser til at returnere eventuelle kemiske strukturer.
- Åbn værktøjet EPA Comptox kemikalier Dashboard Batch Search (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) og Indsæt liste over identifikatorer (enten formler eller masserne) i boksen id efter valg af id type (dvs., MS-klar Formel eller Monoisotopic masse).
- Vælg Download kemiske Data... og også vælge enhver fysisk/kemiske/toksikologi data ønskede for potentielle kampe fra dropdown.
- Ved hjælp af kemiske intuition og tilgængelige referencedata, fjerne usandsynligt kampe fra listen over potentielle kemiske struktur for hver formel baseret på gennemførlighed på grund af kemiske stabilitet, fysiske egenskaber såsom ionizability eller hydrophobicity, tilstedeværelsen fremstilling af kemikalier fra nærliggende kilder, osv. I mangel af supplerende data, kan spektrale feasibility blive placeret udelukkende ud fra litteratur prævalens; Se McEachran et al.37.
- Bekræfte strukturer ved hjælp af tilgængelige standarder og/eller målrettet høj opløsning MS/MS matching af fragmenter mod spektre fra databaser, i siliciummangan teoretiske spektre eller manuel datasikring.
- Udføre molekylære funktion udvinding af kemiske egenskaber ved hjælp af en af flere open source software pakker32,33 eller sælger software til at identificere monoisotopic masserne, retentionstider og integreret toparealer af kemiske funktioner.
Representative Results
Kvantitative LC-MS/MS resultater er i form af ion-kromatogrammer for samlede ion kromatogrammet (TIC) og de udpakkede ion kromatogrammer (EIC) af specifikke kemiske overgange for målte kemikalier (figur 1). Den integrerede topareal af en kemisk overgang er relateret til den sammensatte overflod og kan bruges til at beregne den nøjagtige koncentration ved hjælp af en kalibreringskurve, normaliseret til en intern standard (figur 2). Lav eller flad svar af individuelle analysander angiver at kalibreringsområdet er uden for det lineære område af den massespektrometer, eller at apparatet kræver tuning/kalibrering. Fattige præcision af flergangsbestemmelser angiver et problem med prøven injektion eller inkonsekvent kromatografi, der kræver ændring af LC parametre.
Ikke-målrettet analyse ved hjælp af en fuld MS1 scanning giver en TIC prøver (figur 3), som giver mulighed for ad hoc-generation af centrene for enkelte ioner (figur 4). Enhver given kromatografiske tidspunkt indeholder signaler for kemiske stoffer, og når du bruger en høj opløsning massespektrometer, den isotopiske fingeraftryk af sammensat. At identificere forbindelser fra MS1 scanningen udføres via programmering af en peak-picking algoritme ved hjælp af flere tilgange38,39,40. Peak picking udbytter kemiske egenskaber hos en målte nøjagtige masse samt chromatografiske retentionstid og ion og den chromatografiske topareal masse spektrum. Disse oplysninger gemmes normalt i en digital databaseformat for videre forarbejdning og filtrering, men den indlejrede og sammenkoblede karakter af data kan forstås begrebsmæssigt (figur 5).
Funktionslisten er filtreret for forbindelser møde en af flere kriterier for at blive udvalgt til yderligere undersøgelse. Den første og mest enkle filtrering af masse defekt (forskellen mellem den nøjagtige masse af en funktion og dens nominelle masse). PFAS forbindelser har negativ mass defekter (figur 6) på grund af deres overvægt af fluor atomer, og fluorholdige forbindelser er positive, men betydeligt mindre masse defekter end homologe organiske materialer31,34 . En anden metode filtrering skridt er at identificere homolog serie indeholdende gentaget enheder fælles for PFAS arter, såsom CF2 eller CF2O. at identificere disse kan gøres ved hjælp af Kendrick masse defekt observationsområder17,36, eller softwarepakker såsom Rasmussens nontarget pakke35 (figur 7).
Efter filtrering, tildeling af kemiske identitet på Huskeliste af stærkt varierende observeret og/eller forsøgsvis per / fluorholdige arter kan begynde. Nøjagtig massen giver et relativt lille liste over potentielle kemiske formler for matchende men er utilstrækkelig til identifikation uden tilsætning af spektrale matchende isotop mønstret af masse spektrum41. Fra høj opløsning MS1 data, er en eller flere formodede kemiske formler matchet mod den isotopiske fingeraftryk af den masse spektrum og scorede (figur 8). Formler til at matche kan genereres ab initio ved hjælp af en defineret pulje af atomer eller kan hentes fra en kombination af litteratur rapporteret forbindelser og indholdet af en eller flere databaser. OS EPA kemi Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/)-værterne en konstant opdateret liste over PFAS forbindelser identificeret af agenturet, samt viser kompileret fra andre organisationer såsom NORMAN netværk42.
Kemiske formler kan bekræftes yderligere, og nogle strukturelle oplysninger kan garnered fra MS/MS-spektre (figur 9). Kandidat strukturer er tilgængelige fra store kemiske databaser såsom EPA kemi dashboard, Pubchem, CAS registreringsdatabasen, osv. Forudsagte spektre kan genereres eller anskaffes ved hjælp af en række programmer, fragmentering og tildelt,43 eller MS/MS-spektre kan fortolkes manuelt.
Et eksempel data matrix er tilgængelige i de supplerende oplysninger, indeholdende en hel funktion matrix fra ti prøver (5 opstrøms, 5 nedstrøms) indsamlet opstrøms og nedstrøms for et fluorochemical punkt kilde. Hver række repræsenterer et kemisk funktion med tilhørende retentionstid, neutral masse, masse spektrum og rå overflod for hver prøve. (Supplerende tabel, Sheet 1). Indledende filtrering (Supplerende tabel, ark 2) for negativ mass defekten og Statistisk signifikans i en uparret t-test mellem opstrøms og nedstrøms reducerer antallet af "interessante" kemiske funktioner til ~ 120. Forudsagte kemiske formler hidrører fra Agilent IDBrowser og søgte mod EPA Comptox kemikalier Dashboard, som returneres muligt matcher (Supplerende tabel, ark 3). "Top-hittet" for hver kemisk formel er baseret på data kilder37 blev tildelt (Supplerende tabel, ark 4). Bemærk, at mere end halvdelen af de resterende egenskaber ikke har høj kvalitet kampe. Identificerede funktioner med ingen kampe kan være resultatet af i-source fragmentering/addukt dannelse, fattige formel tildeling eller identifikation af PFASs blev ikke fundet i kildedatabasen. Fortolkning af de rå spektre for at validere tildelinger er uden for rammerne af dette manuskript, men mere information kan findes i works citeret15,30,31,44, 45.
| ID | Eksempel navnet | Prøvetypen | Std Konc | Hætteglas | LC metode | MS metoden |
| 1 | DB_001 | Tom | 1:A, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 2 | DB_002 | Tom | 1:A, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 3 | DB_003 | Tom | 1:A, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 4 | DB_004 | Tom | 1:A, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 5 | DB_005 | Tom | 1:A, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 6 | FB | Tom | 1:A, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 7 | 10 std | Standard | 10 | 1:A, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 8 | 25 std | Standard | 25 | 1:A, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 9 | 50 std | Standard | 50 | 1:A, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 10 | 100 std | Standard | 100 | 1:A, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 11 | 250 std | Standard | 250 | 1:A, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 12 | 500 std | Standard | 500 | 1:A, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 13 | 750 std | Standard | 750 | 1:B, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 14 | 1000 std | Standard | 1000 | 1:B, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 15 | DB_006 | Tom | 1:B, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 16 | SB_DUP1 | Analysand | 1:B, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 17 | SB_DUP2 | Analysand | 1:B, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 18 | SW Site 03 | Analysand | 1:B, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 19 | SW Site 16 | Analysand | 1:B, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 20 | SW Site 30 | Analysand | 1:B, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 21 | DB_007 | Analysand | 1:C, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 22 | SW Site 19 | Analysand | 1:C, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 23 | SW Site 48 | Analysand | 1:C, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 24 | SW Site 49 | Analysand | 1:C, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 25 | SW Site 05 | Analysand | 1:C, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 26 | SW Site 47 | Tom | 1:C, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 27 | DB_008 | Analysand | 1:C, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 28 | SW Site 19_DUP | Analysand | 1:C, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 29 | SW hjemmeside 20 | Analysand | 1:D, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 30 | SW Site 21 | Analysand | 1:D, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 31 | SW Site 46 | Analysand | 1:D, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 32 | SW Site 47 | Analysand | 1:D, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 33 | DB_009 | Tom | 1:D, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 28 | SW Site 32 | Analysand | 1:D, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 29 | SW Site 50 | Analysand | 1:D, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 30 | SW Site 25 | Analysand | 1:D, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 31 | SW Site 21_DUP | Analysand | 1:E, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 32 | SW Site 52 | Analysand | 1:E, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 33 | DB_010 | Tom | 1:E, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 34 | FB | Tom | 1:A, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 35 | 10 std | Standard | 10 | 1:A, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 36 | 25 std | Standard | 25 | 1:A, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 37 | 50 std | Standard | 50 | 1:A, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 38 | 100 std | Standard | 100 | 1:A, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 39 | 250 std | Standard | 250 | 1:A, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 40 | 500 std | Standard | 500 | 1:A, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 41 | 750 std | Standard | 750 | 1:B, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 42 | 1000 std | Standard | 1000 | 1:B, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 43 | DB_011 | Tom | 1:B, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 44 | DB_012 | Tom | 1:E, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min. køre | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
Tabel 1: Eksempel worklist til målrettet analyse og kvantitering af PFAS ved hjælp af LC-MS/MS
| Tid (min) 0 |
% A (2.5 mM ammoniumacetat i 5% MeOH) 90 |
% B (2.5 mM ammoniumacetat i 95% MeOH) 10 |
| 5 | 15 | 85 |
| 5.1 | 0 | 100 |
| 7 | 0 | 100 |
| 7.1 | 90 | 10 |
| 9 | 90 | 10 |
Tabel 2: Eksempel gradient til LC adskillelse i målrettet analyse
| Capilary spænding (kv) | 1,97 |
| Kegle spænding (V) | 15 |
| Emhætte spænding (V) | 3 |
| RF linse (V) | 0,3 |
| Kilde Temp | 150 |
| Desolvation Temp | 40 |
| Desolvation gasflow (L/hr) | 300 |
| Kegle gasflow (L/hr) | 2 |
Tabel 3: Ionisering kilde parametre til målrettet analyse
| CMP | Forløber | Produkt | Hviletid | Kegle spænding (V) | Kollisionen energi (eV) |
| PFBA | 212.80 | 168.75 | 0,01 | 15 | 10 |
| 13C 4-PFBA ER | 216.80 | 171.75 | 0,01 | 15 | 10 |
| PFPeA | 262.85 | 218.75 | 0,01 | 15 | 9 |
| PFBS ° 1 | 298.70 | 79.90 | 0,01 | 40 | 30 |
| PFBS ° 2 | 298.70 | 98.80 | 0,01 | 40 | 28 |
| PFHxA ° 1 | 312.70 | 118.70 | 0,01 | 13 | 21 |
| PFHxA ° 2 | 312.70 | 268.70 | 0,01 | 13 | 10 |
| 13C 2-PFHxA er | 314.75 | 269.75 | 0,01 | 13 | 9 |
| HFPO-DA 1° | 329.16 | 168.90 | 0,01 | 10 | 12 |
| HFPO-DA 2° | 329.16 | 284.90 | 0,01 | 10 | 6 |
| HFPO-DA ER 1° | 332.16 | 168.90 | 0,01 | 10 | 12 |
| HFPO-DA ER 2° | 332.16 | 286.90 | 0,01 | 10 | 6 |
| PFHpA ° 1 | 362.65 | 168.65 | 0,01 | 14 | 17 |
| PFHpA ° 2 | 362.65 | 318.70 | 0,01 | 14 | 10 |
| PFHxS ° 1 | 398.65 | 79.90 | 0,01 | 50 | 38 |
| PFHxS ° 2 | 398.65 | 98.80 | 0,01 | 50 | 32 |
| 13C 4-PFHxS er | 402.65 | 83.90 | 0,01 | 50 | 38 |
| PFOA ° 1 | 412.60 | 168.70 | 0,01 | 15 | 18 |
| PFOA ° 2 | 412.60 | 368.65 | 0,01 | 15 | 11 |
| 13C 4-PFOA ER | 416.75 | 371.70 | 0,01 | 15 | 11 |
| PFNA ° 1 | 462.60 | 218.75 | 0,01 | 15 | 17 |
| PFNA ° 2 | 462.60 | 418.60 | 0,01 | 15 | 11 |
| PFNA ER | 467.60 | 422.60 | 0,01 | 15 | 11 |
| PFOS ° 1 | 498.65 | 79.90 | 0,01 | 60 | 48 |
| PFOS ° 2 | 498.65 | 98.80 | 0,01 | 60 | 38 |
| 13C 4-PFOS ER | 502.60 | 79.70 | 0,01 | 60 | 48 |
| PFDA ° 1 | 512.60 | 218.75 | 0,01 | 16 | 18 |
| PFDA ° 2 | 512.60 | 468.55 | 0,01 | 16 | 12 |
| 13C 2 - ER PFDA | 514.60 | 469.55 | 0,01 | 16 | 12 |
Tabel 4: Eksempel overgangen tabel og MS/MS parametre for indholdet af PFAC-MXA, sammen med HFPO-DA
| Tid (min) |
% A (2.5 mM ammoniumacetat i 5% MeOH) |
% B (2.5 mM ammoniumacetat i 95% MeOH) |
| 0 | 90 | 10 |
| 0,5 | 90 | 10 |
| 3 | 50 | 50 |
| 3.5 | 50 | 50 |
| 5.5 | 40 | 60 |
| 6 | 40 | 60 |
| 7 | 0 | 100 |
| 11 | 0 | 100 |
Tabel 5: Eksempel gradient til LC adskillelse i ikke-målrettet analyse
| Profinder Parameter | Indstillingsværdien |
| Udvinding Peak højde Filter | 800 tæller |
| Tilladte Ion(s) | -H / + H |
| Funktionen udvinding isotop Model | Fælles organiske molekyler |
| Tilladte gebyr stater | 2 - Jan |
| Sammensatte Ion Count tærskel | To eller flere ioner |
| Justering RT Tolerance | 0.40 min + 0,0% |
| Justering masse Tolerance | 20.00 ppm + 2.0mDa |
| Efterbehandling Absolute højde Filter | > = 10000 tæller i en prøve |
| Efterbehandling MFE Score Filter | > = 75 i en prøve |
| Peak Integration algoritme | Agile 2 |
| Peak Integration højde Filter | > = 5000 tæller |
| Find af Ion Absolute højde Filter | > = 7500 tæller i en prøve |
| Find af Ion Score Filter | > = 50.00 i en prøve |
Tabel 6: Molekylære funktion udvinding og tilpasning indstillinger for Profinder software. Alle unoterede værdier beholdt standardindstillingerne for databehandling.
| Ion overflod tærskel | Funktionen tærskler | Replikere tærskel (n = 5) | Løbe tid | Funktioner | Pass Repliker tærskel | Pass CV tærskel | Funktioner til 90% af TIC |
| 1 x S/N | 2000 | Ingen | 8.15 | 987 | 505 | 421 | 91 |
| 2 x S/N | 5000 | Ingen | 5.02 | 707 | 357 | 313 | 93 |
| 3 x S/N | 10000 | Ingen | 2.3 | 308 | 249 | 230 | 93 |
| 1 x S/N | 2000 | 100% | 3.3 | 603 | 339 | 297 | 92 |
| 2 x S/N | 35000 | 100% | 1,58 | 310 | 248 | 229 | 93 |
| 3 x S/N | 10000 | 100% | 1.45 | 202 | 190 | 182 | 92 |
Tabel 7: Sammenligning af prøven behandlingstid og kemiske funktion identifikationer for forskellige indslag udvinding tærskler.
Figur 1 : Total ion kromatogrammet og udpakkede ion kromatogrammer for en delmængde af perfluorinated ether standarder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant kalibreringskurverne for forbindelser viser faldende kvalitet af analytiske kurve konstruktion. Længst til venstre panel angiver en høj kvalitet kalibrering; Midterste panel angiver et stof med dårlig præcision på tværs af forberedelse dubletter, især ved de højere koncentrationer; Højre Panel viser en kurve med dårlig præcision og en lav lineær dynamikområde, resulterer i fladt svar i den høje ende af kalibreringsopløsningerne, og ingen påviselige signal i den lavere ende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Overlejret samlede ion kromatogrammer (TIC) for overfladevand ekstrakter indsamlede opstrøms og nedstrøms for et fluorochemical produktionssted. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Udpakkede ion kromatogrammer (EIC) for alle identificeret kemiske egenskaber fra en overfladevand prøve, der indeholder flere fluorochemical klasser. Hver kemiske spor er en anden farve til differentiering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Grundlæggende diagram af rå og forudsagt oplysninger for kemiske funktioner identificeret som hexafluoropropylene oxid dimer syre (HFPO-DA). Kemiske egenskaber er samlet fra software udvinding af rå data fra MS målinger og indeholder kromatografiske (fx retentionstiden (RT)) og masse massespektrometri oplysninger. Forudsagte formel, strukturer og kemiske identitet er genereret ud fra rå måledata for hver funktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Masse defekt plot for kemiske funktioner i en fremstillingsvirksomhed mundingen (rød, venstre) og reference overfladevand (blå, højre). Fluorholdige forbindelser falder nær og under den stiplede nul linje. Bemærk den vedvarende PFOA/PFOS serie i baggrunden overfladevand prøven (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Masse vs masse defekt plot for uidentificerede kemiske egenskaber fra en overflade vandprøve med homolog serie identificeret og mærket af det nontarget R pakke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Masse spektrum af en ukendt kemisk funktioner med forudsagte isotopiske intensiteter af tre mulige kemiske formel med den samme monoisotopic Massachusetts Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : Opsplitning spektrum af en perfluorinated ether sammensatte med kommenteret fragment toppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10 : Grafisk repræsentation af filtrering tærskler. Fra venstre mod højre, ion overflod tærskel for kemiske funktion massespektre, har overflod tærskel for udpakkede kromatografiske funktioner, og Repliker tærskel for funktionen afsløring frekvens i en tredobbelt injektion eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Prøven håndtering og forberedelse
Optagelse af reference/spike standarder er af afgørende betydning for enhver målrettet analyse, da de giver en bagstopper for at kontrollere analytiske validitet. Manglende QC prøver forhindrer enhver vurdering af nøjagtigheden af resultaterne; den allestedsnærværende karakter af fluorochemicals betyder, at chancen for forurening af feltprøver, behandling af materialer eller LC-MS system er ikke ualmindeligt og skal regnskabsføres. Yderligere, det giver mulighed for validering af protokollen uanset variation i den daglige prøve behandling, som mange af skridt kan være meget varierende, især SPE-selskabet og prøve koncentration trin. Udvinding af både ældre og nye perfluorinated kemikalier kan være stærkt påvirket af valget af stationær fase for koncentration, og komponenter af kilde prøver, som pH og saltholdighed46. Indflydelse af prøven betingelser bør overvejes, hvis bestemte kategorier af pefluorinated kemikalier er af interesse. Alternative stikprøveprogrammer forberedelse for vand ekstrakter kan anvendes, hvis opsætningen laboratorium er tilgængelige og downstream dataanalyse forbliver lignende.
Målrettet dataanalyse
Forbindelser med tilgængelige standarder og matchede, stabile isotop mærket interne standarder, er de primære bekymring for dataanalyse instrumental og bestemmelse af metode detektionsgrænser og egnet rapportering intervaller kan bestemmes på en laboratorium ved laboratoriet grundlag ved hjælp af standard metoder, såsom signal-støj-forholdet fra laveste-niveau-standard spikes47. I mangel af matchede interne standarder kan opstå fejl fra forkerte matrixeffekter og præcis back-forudsigelse af spidse prøver kan anvendes til at vurdere nøjagtigheden af målingerne. Når mangler standarder for at forberede en kurve, et kvantitativt skøn med en ukendt kan gøres ved at behandle det ens til en nøje afstemt standard sammensatte, men fejl i estimatet er på rækkefølgen af 10 + fold med begrænset evne til at kvantificere usikkerheden, se McCord, Newton og Strynar21. I disse tilfælde tendens data kan stadig være indsamlet, men koncentrationen skøn er i sagens natur upålidelige.
Ikke-øremærket dataanalyse
Peak picking indstillinger har en betydelig indvirkning på antallet af kemiske funktioner identificeret, men kvaliteten af funktion udvælgelse er også stærkt påvirket. Beslutninger af interesse i peak plukning er 1) intensiteten af individuelle masserne skal medtages i spectra, ion overflod tærskel 2) intensiteten af uddraget Kromatogrammets toppe betragtes funktioner, funktion overflod tærskel 3) funktion opdagelse frekvens, Repliker tærsklen og 4) analytisk variation, CV tærskel (figur 10).
Indstilling urealistisk lave tærskler for peak picking resultater i en eksponentiel stigning i prøven tid at løse yderligere funktioner i stadig lav overflod (tabel 7). Ion-overflod tærskel filtre masse spektrale beskrivere hvor nok af de enkelte isotop mængder ikke kan passere grænsen. Dette vælger ideelt kun for funktioner med kvalitet MS spektre, sikre de rigtige kemiske funktioner i stedet for instrumental støj, og giver mulighed for formel forudsigelse i downstream behandling. En passende tærskel er baseret på instrumentale støj, helst mindst 3 x støj tærsklen for MS1 scanner. Funktionen overflod tærskel filtre kemiske egenskaber baseret på intensitet eller område af funktionen kromatografiske udvundet. Dette trin giver mulighed for afvisning af lav overflod toppe, der er typisk af dårlig kromatografiske kvalitet, har høje afvigelser eller resultatet af andre fattige software udvinding. En passende tærskel skal fastlægges pr. eksperiment, og matrix baseret på et acceptabelt niveau af dårlig funktion generation (fx funktioner under tærsklen udviser uacceptabelt dårlige kromatografi). Analytiske QC kan yderligere bruges til at afvise funktioner på kromatografisk baseret på inkonsekvent identifikation i analytisk og/eller forberedende flergangsbestemmelser (Repliker tærskel) eller baseret på dårlig reproducerbarhed på tværs af flergangsbestemmelser (CV tærskel). Relevante niveauer afhænger af kvaliteten af peak integration software bruges og de kemiske enheder under undersøgelsen. Vandopløselige perfluorerede forbindelser og let optimeret integration protokoller, funktioner bør identificeres i 80 + % af analytiske replikater og CVs forventes at falde til under 30%, som beskrevet i afsnittet metoder.
Toppene opdaget fra ikke-målrettet analyse give ikke kvantitative skøn over koncentrationer af materialer registreres. Yderligere, sande ubekendte identitet kan være svært at bekræfte fordi Roman forbindelser er fraværende fra offentligt tilgængelige databaser. Roman Strukturbestemmelse kræver omfattende analyse med flere metoder og kræver ekspertise i både massespektrometri og kemi. Normalisere toparealer kemiske funktioner kan dog yde semi-kvantitative skøn over koncentrationer af ubekendte fra kendte arter21. Hvis konsekvent prøveudtagning og forberedelsestrin er ansat, kan trend tidsoplysninger for individuelle arter oprettes for at overvåge persistens af et kemisk stof ind i fremtiden som svar til en individuel art skal være konsekvent spærring store variationer i matrix21.
Den primære fordel ved denne metode er udvidelsesmuligheder prøve behandling tillade både målrettet og disse analyse. Mens målrettet analyse giver tilsvarende eller superior kvantitative oplysninger, mangler det meget bredde af analyse ønsket når der beskæftiger sig med nye materialer, samt deres forhold til matrix materialer. Anvende en målrettet metode, eller endda en mistænkt screening metode baseret udelukkende på kendte materialer og begrænset databaser er helt blind for tidligere ubemærket arter, selvom de kan have betydelige sundhedsmæssige virkninger. Som software forbedrer og databaser bliver mere robust, fortsat nøjagtigheden af ukendt identifikation vil stige med en ledsagende fald i den tid investeringer og ekspertise nødvendigt at analysere det flerdimensionelle data genereret af dette tilgang. Data, der genereres i øjeblikket er dog af betydelig fremtidig værdi fordi data bank giver mulighed for post-hoc analyse med nyudviklede software og giver mulighed for sammenligning på tværs af tid selvom identiteten af en registreret stof er i øjeblikket ukendt.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
US Environmental Protection Agency, gennem dens kontor for forskning og udvikling, finansieret og forvaltet den forskning, der er beskrevet her. Dette dokument har gennemgået af US Environmental Protection Agency, Office for forskning og udvikling, og godkendt til offentliggørelse. Synspunkterne i denne artikel, er dem af forfatterne og nødvendigvis repræsenterer ikke synspunkter eller politikker af US Environmental Protection Agency. Denne forskning blev delvist understøttet af en udnævnelse til Postdoctoral forskningsprogrammet på den nationale eksponering Research Laboratory administreres af Oak Ridge Institut for videnskab og uddannelse gennem tværinstitutionelle aftale DW89992431601 mellem de US Department of Energy og US Environmental Protection Agency.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acqity ultra-high performance liquid chromatography system | Waters Corporation | Modified with PFCs analysis kit (176001744); equivalent UPLC system is acceptible if PFAS background is checked and confirmed to be low | |
| Ammonium acetate | Fluka | 17836 | Mass spectrometry grade >99% pure |
| Ammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Balance | Mettler | AB204S | |
| BEH C18 reverse phase UPLC column, 2.1×50 mm, 1.7 μm | Waters Corporation | 186002350 | |
| Dual piston syringe pump | Waters Corporation | SPC10-C | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | ARK2183 | |
| Glass Microfiber Filters | Whatman | 1820-070 | |
| High density polyethelye sample bottle | Nalgene | 2189-0032 | |
| High Resolution Mass Spectrometer | Various | Mass Spectrometer should be capable of providing accurate mass to <10ppm and collecting MS/MS data. Agilent 6530 qTOF and Thermo Fisher Orbitrap Fusion were used in this work | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| Nitric Acid (35% w/w) | Thermo Fisher Scientific | SVCN-5-1 | Can be prepared in house using concentrated nitric acid and reagent water |
| Polypropylene Buchner funnel | ACE Glass | 12557-09 | |
| Polypropylene cenitrfuge tube and cap | BD Falcon | 352096 | |
| Polypropylene Vacuum Flask (1 L) | Nalgene | DS4101-1000 | |
| Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer | Waters Corporation | Equivalent triple-quadrupole or better system can be used instead, should provide high sensitivity and stability for targeted analysis | |
| Reagent Water | Any source determined to be PFAS free | ||
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| TurboVap nitrogen evaporator | Caliper Life Sciences | 103198 | Equivalent systems or rotary vacuum evaporator may be used instead |
| Weak anion exchange SPE cartridge (Oasis WAX Plus) | Waters Corporation | 186003519 | |
| Standard Solutions | |||
| 2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoxy)propanoic acid (HFPO-DA) | Wellington | HFPO-DA | |
| Additional targeted compound standards of interest | to be determined based on preliminary analysis and standard availability | ||
| Mass labeled HFPO-DA | Wellington | M2HFPO-DA | |
| Native PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | PFAC-MXA | or PFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest |
| Stable Isotope Labeled PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | MPFAC-MXA | or MPFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest as appropriate for Native PFASs |
| Software | |||
| Mass Profiler Professional | Agilent | Or open source software packages | |
| Profinder | Agilent | Or open source software packages |
References
- Provisional Health Advisories for Perfluorooctanoic Acid (PFOA) and Perfluorooctane Sulfonate (PFOS). United States Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (2009).
- Lifetime Health Advisories and Health Effects Support Documents for Perfluorooctanoic Acid and Perfluorooctane Sulfonate. United States Environmental Protection Agency. , Washington DC. 33250-33251 (2016).
- Fact Sheet: 2010/2015 PFOA Stewardship Program. , Available from: https://www.epa.gov/assessing-and-managing-chemicals-under-tsca/fact-sheet-20102015-pfoa-stewardship-program (2006).
- EPA and 3M Announce phase out of PFOS. Environmental Protection Agency. , Available from: https://yosemite.epa.gov/opa/admpress.nsf/0/33aa946e6cb11f35852568e1005246b4 (2000).
- Wang, Z., Cousins, I. T., Scheringer, M., Hungerbühler, K. Fluorinated alternatives to long-chain perfluoroalkyl carboxylic acids (PFCAs), perfluoroalkane sulfonic acids (PFSAs) and their potential precursors. Environment International. 60, 242 (2013).
- Scheringer, M., et al. Helsingør Statement on poly- and perfluorinated alkyl substances (PFASs). Chemosphere. 114, 337-339 (2014).
- Wang, Z., DeWitt, J. C., Higgins, C. P., Cousins, I. T. A Never-Ending Story of Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFASs). Environmental Science & Technology. 51 (5), 2508-2518 (2017).
- Xiao, F., Golovko, S. A., Golovko, M. Y. Identification of novel non-ionic, cationic, zwitterionic, and anionic polyfluoroalkyl substances using UPLC-TOF-MSE high-resolution parent ion search. Analytica Chimica Acta. 988, 41-49 (2017).
- Shoemaker, J., Grimmett, P., Boutin, B. Method 537. Determination of selected perfluorinated alkyl acids in drinking water by solid phase extraction and liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). US Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (2009).
- Poole, C. F., Gunatilleka, A. D., Sethuraman, R. Contributions of theory to method development in solid-phase extraction. Journal of Chromatography A. 885 (1), 17-39 (2000).
- Ahrens, L. Polyfluoroalkyl compounds in the aquatic environment: a review of their occurrence and fate. Journal of Environmental Monitoring. 13 (1), 20-31 (2011).
- Higgins, C. P., Field, J. A., Criddle, C. S., Luthy, R. G. Quantitative Determination of Perfluorochemicals in Sediments and Domestic Sludge. Environmental Science & Technology. 39 (11), 3946-3956 (2005).
- Szostek, B., Prickett, K. B., Buck, R. C. Determination of fluorotelomer alcohols by liquid chromatography/tandem mass spectrometry in water. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 20 (19), 2837-2844 (2006).
- Alzaga, R., Bayona, J. M. Determination of perfluorocarboxylic acids in aqueous matrices by ion-pair solid-phase microextraction-in-port derivatization-gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1042 (1-2), 155-162 (2004).
- Schaider, L. A., et al. Fluorinated Compounds in U.S. Fast Food Packaging. Environmental Science & Technology Letters. 4 (3), 105-111 (2017).
- Lindstrom, A. B., Strynar, M. J., Libelo, E. L. Polyfluorinated Compounds: Past, Present, and Future. Environmental Science & Technology. 45 (19), 7954 (2011).
- Liu, Y., Pereira, A. D. S., Martin, J. W. Discovery of C5-C17 Poly-and Perfluoroalkyl Substances in Water by In-Line SPE-HPLC-Orbitrap with In-Source Fragmentation Flagging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4260 (2015).
- Backe, W. J., Day, T. C., Field, J. A. Zwitterionic, Cationic, and Anionic Fluorinated Chemicals in Aqueous Film Forming Foam Formulations and Groundwater from U.S. Military Bases by Nonaqueous Large-Volume Injection HPLC-MS/MS. Environmental Science & Technology. 47 (10), 5226-5234 (2013).
- Mazzoni, M., Rusconi, M., Valsecchi, S., Martins, C. P. B., Polesello, S. An on-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of perfluoroalkyl acids in drinking and surface waters. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2015, 942016 (2015).
- Li, F., et al. Method development for analysis of short- and long-chain perfluorinated acids in solid matrices. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 91 (12), 1117-1134 (2011).
- McCord, J., Newton, S., Strynar, M. Validation of quantitative measurements and semi-quantitative estimates of emerging perfluoroethercarboxylic acids (PFECAs) and hexfluoroprolyene oxide acids (HFPOAs). J Chromatoqr A. , (2018).
- Wang, Y., Liu, S., Hu, Y., Li, P., Wan, J. -B. Current state of the art of mass spectrometry-based metabolomics studies - a review focusing on wide coverage, high throughput and easy identification. RSC Advances. 5 (96), 78728-78737 (2015).
- Cajka, T., Fiehn, O. Toward Merging Untargeted and Targeted Methods in Mass Spectrometry-Based Metabolomics and Lipidomics. Analytical Chemistry. 88 (1), 524-545 (2016).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: The case for high resolution and high mass accuracy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Sobus, J. R., et al. Integrating tools for non-targeted analysis research and chemical safety evaluations at the US EPA. Journal of Exposure Science & Environmental Epidemiology. , (2017).
- Bletsou, A. A., Jeon, J., Hollender, J., Archontaki, E., Thomaidis, N. S. Targeted and non-targeted liquid chromatography-mass spectrometric workflows for identification of transformation products of emerging pollutants in the aquatic environment. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 66, 32-44 (2015).
- Viant, M. R., Sommer, U. Mass spectrometry based environmental metabolomics: a primer and review. Metabolomics. 9 (1), 144-158 (2013).
- Xiao, F. Emerging poly- and perfluoroalkyl substances in the aquatic environment: A review of current literature. Water Research. 124, 482-495 (2017).
- Nakayama, S. F., Strynar, M. J., Reiner, J. L., Delinsky, A. D., Lindstrom, A. B. Determination of perfluorinated compounds in the Upper Mississippi River Basin. Environmental Science & Technology. 44 (11), 4103 (2010).
- Strynar, M., et al. Identification of novel perfluoroalkyl ether carboxylic acids (PFECAs) and sulfonic acids (PFESAs) in natural waters using accurate mass time-of-flight mass spectrometry (TOFMS). Environmental Science & Technology. 49 (19), 11622 (2015).
- Newton, S., et al. Novel Polyfluorinated Compounds Identified Using High Resolution Mass Spectrometry Downstream of Manufacturing Facilities near Decatur, Alabama. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1544-1552 (2017).
- Forsberg, E. M., et al. Data processing, multi-omic pathway mapping, and metabolite activity analysis using XCMS Online. Nature Protocols. 13, 633 (2018).
- Sturm, M., et al. OpenMS - An open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9 (1), 163 (2008).
- Kind, T., Fiehn, O. Seven Golden Rules for heuristic filtering of molecular formulas obtained by accurate mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 8, 105-105 (2007).
- Loos, M., Singer, H. Nontargeted homologue series extraction from hyphenated high resolution mass spectrometry data. Journal of Cheminformatics. 9, 12 (2017).
- Dimzon, I. K., et al. High Resolution Mass Spectrometry of Polyfluorinated Polyether-Based Formulation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27, 309 (2016).
- McEachran, A. D., Sobus, J. R., Williams, A. J. Identifying known unknowns using the US EPA's CompTox Chemistry Dashboard. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1729-1735 (2017).
- French, W. R., et al. Wavelet-Based Peak Detection and a New Charge Inference Procedure for MS/MS Implemented in ProteoWizard's msConvert. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1299-1307 (2015).
- Tautenhahn, R., Böttcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9, 504 (2008).
- Rafiei, A., Sleno, L. Comparison of peak-picking workflows for untargeted liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry metabolomics data analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (1), 119-127 (2015).
- Kind, T., Fiehn, O. Metabolomic database annotations via query of elemental compositions: Mass accuracy is insufficient even at less than 1 ppm. BMC Bioinformatics. 7, 234-234 (2006).
- Brack, W., Dulio, V., Slobodnik, J. The NORMAN Network and its activities on emerging environmental substances with a focus on effect-directed analysis of complex environmental contamination. Environmental Sciences Europe. 24 (1), 29 (2012).
- Blaženović, I., et al. Comprehensive comparison of in silico MS/MS fragmentation tools of the CASMI contest: database boosting is needed to achieve 93% accuracy. Journal of Cheminformatics. 9, 32 (2017).
- Rager, J. E., et al. Linking high resolution mass spectrometry data with exposure and toxicity forecasts to advance high-throughput environmental monitoring. Environment International. 88, Supplement C 269-280 (2016).
- Munoz, G., et al. Environmental Occurrence of Perfluoroalkyl Acids and Novel Fluorotelomer Surfactants in the Freshwater Fish Catostomus commersonii and Sediments Following Firefighting Foam Deployment at the Lac-Mégantic Railway Accident. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1231-1240 (2017).
- Brumovský, M., Bečanová, J., Karásková, P., Nizzetto, L. Retention performance of three widely used SPE sorbents for the extraction of perfluoroalkyl substances from seawater. Chemosphere. 193, 259-269 (2018).
- Definition, Definition and Procedure for the Determination of the Method Detection Limit (Revision 2). Environmental Protection Agency. , Federal Regester (2016).
