Summary
Klinisk oversettelse av exosome-avledet biomarkører for syke og ondartede celler er hindret av mangelen på raske og nøyaktige kvantifisering metoder. Denne rapporten beskriver bruken av mørke felt bilder med lav forstørrelse for å kvantifisere spesifikke exosome under typer i små mengder serum eller plasmaprøver.
Abstract
Infiserte eller ondartede celler ofte skiller ut mer exosomes, fører til forhøyede nivåer av sykdom-assosiert exosomes i sirkulasjon. Disse exosomes har potensiale til å tjene som biomarkører for sykdoms diagnose og til å overvåke sykdomsprogresjon og behandlingsrespons. Men de fleste exosome analyse prosedyrer krever exosome isolasjon og rensing trinn, som vanligvis er tidkrevende og arbeidskrevende, og dermed av begrenset nytte i kliniske miljøer. Denne rapporten beskriver en rask prosedyre for å analysere spesifikke biomarkører på ytre membran av exosomes uten å kreve separate isolasjon og rensing trinn. I denne metoden blir exosomes fanget på overflaten av et lysbilde av exosome-spesifikke antistoffer og deretter hybridisert med nanopartikkel-bøyd antistoff sonder spesifikke for en sykdom. Etter hybridisering, overflod av målet exosome befolkningen bestemmes ved å analysere lav forstørrelse mørk-feltet mikroskop (LMDFM) bilder av bundet nanopartikler. Denne tilnærmingen kan lett vedtatt for forskning og klinisk bruk for å analysere membran-assosiert exosome biomarkører knyttet til sykdom.
Introduction
Exosomes frigis fra de fleste celletyper og spiller en nøkkelrolle i celle-til-celle-kommunikasjon, inkludert patofysiologiske prosesser knyttet til ulike sykdommer, siden de kan være hjem til bestemte vev eller celletyper, og inneholder en rekke nukleinsyre syrer , proteiner og lipider som reflekterer deres Opprinnelses celle og kan utøve regulatoriske effekter på deres mottaker celler1,2,3,4. Exosomes utskilles ofte på forhøyede nivåer i sykdomstilstander, kan samhandle med både tilstøtende og fjerne celler, og finnes ved relativt høy konsentrasjon i sirkulasjonen, så vel som de fleste andre kroppsvæsker, inkludert spytt, urin, bukspyttkjertel og galle juice, og lunges tømming Fluid5,6,7,8,9,10,11. Denne overflod og stabilitet av exosomes i menneskekroppen væsker, kombinert med deres informasjon-rik natur, gjør dem ideelle biomarkører for sykdoms diagnose og behandling overvåking.
Dette inkluderer tumor-avledet exosomes (TDEs), som inneholder tumor spesifikke eller selektive faktorer, som kan tjene som sykdom biomarkører, inkludert tumor-assosiert mutant alleler. TDEs kan delta i remodeling av tumor mikromiljøet å lette tumor utvikling og metastasering, og regulere anti-tumor responser12. Økt TDE sekresjon er en vanlig fenotype av de fleste kreftformer og flere funksjoner av tumor mikromiljøet, inkludert hypoksi, syrlig pH, og betennelser, er kjent for å fremme exosome sekresjon. Overraskende, gitt antall celler som skiller exosomes, en økning i totalt exosome nivå kan, selv, fungere som en kreft biomarkør. For eksempel, en fersk studie fant at den totale EV konsentrasjon i galle juice diskriminerer ondartet og nonmalignant i felles galle duct stenose pasienter med 100% nøyaktighet7. Lignende resultater har blitt funnet med studier ved hjelp av andre kroppsvæsker, inkludert plasma. Imidlertid, på grunn av det muligheter for motiv å motiv variasjon, og annet forvirrende faktorene, høyst studier etterforske exosomes idet sykdommen biomarkører ha fokusere opp på oppdagelsen av biomarkør det er selektivt forbundet med TDEs istedet for sum exosome Tall.
Å oversette exosome biomarkører til klinisk praksis er imidlertid fortsatt utfordrende siden de fleste rapporterte exosome-analysen krever tidkrevende og arbeidskrevende isolasjons prosedyrer 13. Foreløpig populære exosome isolasjon metoder inkluderer ultracentrifugation, tetthet graderinger, størrelse-ekskludering, co-nedbør, affinitet fangst, og mikrovæskebasert isolasjon tilnærminger. Ultracentrifugation er "gull standard" metoden, og er mest brukt for exosome isolasjoner, men denne prosedyren er tidkrevende og resulterer i exosome Kader og exosome membran Clustering, og produserer exosome prøver som er forurenset med proteiner, lipoproteiner og andre faktorer som kan påvirke påfølgende analyser14. De fleste exosome isolasjons metoder, inkludert ultracentrifugation, kan ikke skille exosomes (30 – 150 NM) fra mikro-blemmer (100 – 1000 NM) og apoptotisk organer (100 – 5000 NM), som oppstår gjennom ulike mekanismer og har ulike funksjoner, på grunn av størrelsen overlapping mellom disse gruppene, og mangfoldet av exosome populasjoner15. Nye tilnærminger er nødvendig for å forbedre følsomheten og reproduserbarhet av exosome analyser ved å forbedre exosome utvinning samtidig redusere exosome Kader og forurensning, selv om eventuelle analyser basert på slike metoder må også optimaliseres for å gjengi dem egnet for oversetting til programmer i kliniske miljøer.
Flere nyere studier har foreslått å ansette integrerte plattformer for å fange og analysere exosomes direkte fra kroppsvæsker. Disse metodene benytter mikrovæskebasert, electrokinetic, affinitet fangst, og diverse andre metoder for exosome isolasjon, og elektrokjemi, overflate Plasmon resonans, og andre metoder for å oppdage fanget exosomes. Det er ikke klart hvor gjennomførbart mange av disse tilnærmingene vil være i kliniske innstillinger, på grunn av deres kompleksitet, regning, lav gjennomstrømming eller andre problemer.
Vi har utviklet en rask og rimelig analysen som kan brukes til sensitive og spesifikke kvantifisering av total exosomes og spesifikke exosome under typer, inkludert sykdom-assosiert exosomes, som TDEs, som krever bare en liten mengde prøve og som bruker en strømlinjeformet arbeidsflyt som passer for kliniske miljøer. I denne analysen er et lysbilde belagt med antistoffer som binder enten en exosome-spesifikk eller sykdom-spesifikk markør uttrykt på exosome overflate for å direkte fange mål exosomes tilstede i små volum plasma eller serumprøver brukt på brønner på Lysbildet. Fanget exosomes deretter hybridisert med en antistoff-bøyd nanopartikkel som anerkjenner biomarkør av interesse på disse exosomes, som kan være enten en generell exosome markør eller en faktor spesifikk for en exosome under type av interesse. Bilder av disse prøve brønnene blir deretter tatt opp ved hjelp av et mørkt felt mikroskop (DFM) og analysert for å måle lyset spredt fra nanopartikler bundet til exosomes av interesse fanget i hver prøve brønn6,16,17. Spesielt, Imaging en hel prøve godt av lav forstørrelse DFM (LMDFM) unngår et utvalg bias oppstått med høy forstørrelse DFM analyser når brukerne må direkte velge hvilke felt for å fange for påfølgende bildeanalyse. LMDFM bildeanalyse er gjenstand for lysspredning gjenstander fra overflaten uregelmessigheter, inkludert riper og prøve rusk, men denne bakgrunnen kan reduseres ved hjelp av en enkel støy-reduksjon algoritme vi utviklet for å kjøre på NIH bildeanalyse program, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Denne algoritmen bruker først en inn data kontur terskel som brukes til å finne grensene for prøve brønnen for å definere området for bildet for senere analyse. Regionen som er definert av denne kontur regionen, deles deretter til et separat signal som finnes i de røde, blå og grønne kanalene i bildet, og den blå kanalen trekkes fra den røde kanalen for å fjerne signalet som oppstår fra overflate artefakter og ujevn belysning fra nanorod Signal.
Denne artikkelen beskriver hvordan du bruker denne analysen til å raskt kvantifisere enten total eller spesifikke exosome nivåer i plasma eller serumprøver.
Protocol
1. utarbeidelse av nanopartikkel sonder
Merk: denne analysen benytter Funksjonalisert Gold Nanoroder (AuNRs; 25 NM diameter x 71 NM lengde) som er covalently bøyd med neutravidin polymerer (AV) og har en overflate Plasmon resonans peak som produserer en rød (641 NM peak) spredning signal på DFM Belysning.
- Vask 40 μL av AuNR-AV (2,56 x 1011 partikler) tre ganger med 200 μL PBS (pH 7,0) ved sentrifugering og aspirasjon (8 500 x g ved 4 ° c i 10 minutter), etterfulgt av et endelig sentrifugering og aspirasjon trinn hvoretter AuNR-av pellet er suspendert 40 i μL PBS.
- Bland denne AuNR-AV-fjæringen med 10 μL biotinylated antistoff (0,5 mg/mL) spesifikt for et antigen på overflaten av den exosome under typen av interesse og 150 μL av PBS, og bland deretter ved 4 ° c for 2 t ved hjelp av en mikser for å tillate neutravidin-biotin binding for å nå ferdigstillelse.
- Vask den resulterende antistoff-bøyd AuNRs (AuNR-IgG) tre ganger ved sentrifugering og aspirasjon (6 500 x g ved 4 ° c i 10 minutter), og deretter suspendere dem i 200 μL PBS og oppbevar dem ved 4 ° c til bruk.
Merk: steril teknikk og korte lagringstider må brukes for å unngå forurensning og forringelse av AuNR-IgG. Det er best å bruke antistoff-bøyd AuNRs innen 24 timer etter Bøyning.
2. utarbeidelse av EV fange lysbilder
- Fortynne utvalgte exosome fangst antistoffer til 0,025 mg/mL i PBS og tilsett 1 μL/brønn av denne fortynning på et multi-brønn protein A/G, og deretter ruge dette lysbildet ved 37 ° c i 1 time i et fuktet kammer for å muliggjøre binding av antistoffer mot protein A/G-immobilisert på lysbildet.
- Aspirer brønner for å fjerne ubundne antistoffer, og vask brønner tre ganger ved tilsetning og aspirasjon av 1 μL/brønn av PBS, og Last deretter inn hver brønn med 1 μL blokkerings buffer (se tabell over materialer) og ruge for 2 timer ved 37 ° c i et fuktet kammer til b låse eventuelle gjenværende protein bindende nettsteder.
- Aspirer brønner for å fjerne blokkerende buffer, vask brønner tre ganger ved tilsetning og aspirasjon av 1 μL/brønn av PBS, og umiddelbart bruke de blokkerte lysbildene for exosome fangst og analyse.
3. standard kurve forberedelse
- For å nøyaktig kvantifisere den absolutte eller relative overflod av en bestemt exosome under type, må brukeren generere en standard kurve med en ren exosome befolkning som jevnt uttrykker den exosome overflaten biomarkør av interesse. Denne studien analyserer overflod av exosomes uttrykker en metastasering-assosiert membran protein, Ephrin a2 reseptor, som har et rapportert forhold til kreft i bukspyttkjertelen Stadium og prognose6,18.
Merk: den menneskelige bukspyttkjertelen kreftcelle linje PANC-1 og dens exosomes er kjent for å uttrykke dette proteinet og isolerte exosomes fra denne cellelinjen ble brukt til å generere en standard kurve for å kvantifisere antall exosomes som uttrykker dette proteinet i komplekse exosome Prøver. - Kultur celler for 48 timer ved 37 ° c i serum-fri kultur Media å tillate exosome akkumulering i Media, deretter isolere cellekultur supernatanter av sentrifugering av suspensjon kulturer eller direkte aspirasjon av kultur medier fra tilhenger cellekulturer.
- Sentrifuger de innsamlede mediene på 2000 x g i 30 min for å fjerne rusk og gjenopprette supernatanten.
- Filtrer den avklart kultur supernatanten gjennom en 0,45 μm lav protein bindende Filterenhet av passende kapasitet (f. eks en 250 mL polyetersulfon vakuum filtrerings enhet).
- Konsentrer den resulterende Filtrer ved å sentrifugering ved 3200 x g ved hjelp av en 100 000 nominell molekylvekt filter system til et 250 μL slutt volum. Samle inn beholdt volumet fra dette filteret, og vask deretter filteret med 200 μL PBS, og Kombiner dette vaske volumet med det innsamlede exosome prøvevolumet.
- Sentrifuger denne prøven på 21 000 x g for 45 minutter og nøye gjenopprette supernatanten, ta vare ikke å samle noen igangsatte materiale.
- Sentrifuger den gjenopprettede supernatanten ved 100 000 x g i 3 timer for å utløse exosomes. Aspirer bort supernatanten og samle exosome pellet i 100 til μL PBS.
- Oppbevar de resulterende exosome suspensjoner ved 4 ° c hvis brukt innen 24 timer eller ved-80 ° c for langtidslagring.
Merk: ikke utsett exosome prøver for å gjenta fryse-tine sykluser. - Kvantifisere en alikvot av exosome suspensjon etter blanding av direkte måling av exosome tall (for eksempel ved nanopartikkel sporing analyse eller tunable motstandsdyktige puls sensing eller ved å måle protein konsentrasjonen av exosome lysater av mikro-bicinchoninic Acid analysen, eller en tilsvarende metode, som et middel til å omtrentlige exosome kvantitet)16,19.
- Generer et sett med serielle fortynninger av exosome suspensjon for å tillate sammenligning av nanopartikkel signal til innspill exosome nummer eller proteininnhold.
- Overfør 1 μL av hver exosome standard til hver av replikere brønnene på analyse platen.
Merk: standard kurver kan brukes til å beregne stigningstallet for korrelasjons linjen mellom nanopartikkel signal og exosome konsentrasjon til (1) evaluere analyse ytelse og (2) bestemme den relative konsentrasjonen av mål exosomes i eksperimentelle prøver.
4. behandling av humane plasma-eller serumprøver
- Samle plasma-eller serumprøver av standard metoder og oppbevar ved-80 ° c til det er nødvendig for exosome analyse. Tine raskt prøver i et vannbad med romtemperatur. Gjentatte ganger bland tint prøvene ved inversjon å fremme homogen suspensjon.
Merk: resultater fra serum og plasmaprøver kan ikke være tilsvarende, siden det er en betydelig frigivelse av exosomes under blodpropp reaksjonen. - Sentrifuger plasma eller serumprøver på 500 x g i 15 min for å utløse protein aggregater og annet rusk. Overfør en alikvot av plasma-eller serum prøven til et friskt rør og Legg til PBS for å generere en 1:1-fortynning. Bland den fortynnede prøven ved milde virvlingen eller inversjon, etter behov. Overføring 1 μL av hver plasma eller serum suspensjon til hver av sine replikere brønner på analysen plate.
5. Exosome fangst og deteksjon
- Last inn brønner på et blokkert EV-fangst med 1 μL/brønn av exosome prøve, med 8 replikerer per prøve, og ruge lysbildet over natten ved 4 ° c i et fuktet kammer. Aspirer alle prøve brønner og legg deretter til 1 μL/brønn av PBS for å vaske brønner og fjerne ubundne exosomes og andre forurensninger fra den lastede exosome prøven.
- Last prøve brønner med 1 μL/brønn av en tidligere klargjort AuNR-IgG-suspensjon (se pkt. 1 ovenfor) og ruge for 2 timer ved 37 ° c i et fuktet kammer. Aspirer den nanopartikkel løsningen og vaske raset i PBS supplert med 0,01% mellom-20 (PBST) i 10 min ved hjelp av en mikser, deretter aspirer og vask alle prøve brønner med deionisert vann i 10 min ved hjelp av en roterende mikser, og luft-tørr for påfølgende LMDFM bilder.
Merk: mellom analyse koeffisienter (CVs) vurderes fra åtte replikerer av samme prøve. Prøver som viser CVs > 20% anses som ikke-informativt og bør gjentas, hvis det er tilstrekkelig prøve.
6. DFM image fange
- Ta bilder for exosome kvantifisering under konsistent belysning ved hjelp av et digitalt kamera festet til et mikroskop utstyrt med en mørk-feltet kondensator (1,2 < NA < 1,4) og en 4X objektiv ansette en 1/220 s eksponeringstid.
- Åpne bilde opptaksprogramvaren.
Merk: vi bruker NIS-Elements programvare for mikroskop avbildning (se tabell over materialer) for protokollen som er beskrevet nedenfor, men det er mulig å bruke en annenprogramvare som kan matche parameterne for bildeopptak. NIS-Elements Viewer Imaging programvare er et gratis frittstående program for å vise bildefiler og datasett som inneholder analyse, visualisering og arkivering verktøy. Parametrene nedenfor er også for et mikroskop med autofokus og en automatisert scene som tillater flere bilder å bli automatisk fanget og sydd inn i et enkelt bilde. - Plasser lysbildet opp-ned på scenen i mikroskopet, Juster plasseringen av lysbildet, og Påfør en liten dråpe nedsenking olje på baksiden av lysbildet, der kondensator linsen kontakter lysbildet.
- Klikk på Live -knappen i programvaregrensesnittet, og Juster eksponeringstiden mot en høy konsentrasjons standard godt for å sikre at bildet ikke er mettet.
- Åpne vinduet Skann stort bilde fra Hent -fanen, og angi programvaregrensesnitt parametrene på følgende måte: makro bilde Optical conf = gjeldende; Mål: 2:10x, skanning optisk conf = strøm, mål: 2:10x; Søm overlapper = 20%; Søm via = optimal bane.
- Velg Opprett stort bilde, Lukk aktiv lukker under scenen bevegelse, Vent før hver fangst: 20 MS, Focus manuelt ved start, og bruke trinnvis fokus hvert 20 felt. Disse innstillingene vil bli lagret med de skannede bildene.
- Flytt mikroskopet for å definere venstre øvre høyre grenser for mål skanne feltet. Juster fokus for å oppnå et klart bilde på skjermen og Juster kondensator innstillingene og miljø belysningen etter behov for å minimere eventuelle uregelmessigheter i det fokuserte bildet.
- Navngi bilde utdatafilen i programvaren. Klikk på Skann -knappen og la mikroskopet skanne og opprette og lagre et sydd bilde av hele lysbildet.
- Åpne det lagrede bildet med bildet fange programvare du bruker og lagre det på 1/8 skala for senere analyse på DSM plugin i ImageJ.
7. DFM bildeanalyse
- Last ned programmet ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Installer DSM algoritme plugin til ImageJ ved hjelp av instruksjonene som er oppført på https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.
- Åpne ImageJ programvare, og angi deretter følgende inndataparametere i DSM-algoritmen: Contour terskel (CT) = 253,020, type = rød, Center scale (S) = 0,8, lav (lt)/High (HT) kvantifisering Limit = 0/62.
- Åpne det lagrede bildet fra Seksjon 6,8 med ImageJ. Velg DSM Scan -knappen fra kategorien plugins , og deretter definere antall kolonner og rader i henhold til det åpnede bildet. Programmet kan gjenkjenne oppdage områder og analyser scatter intensiteten av nanopartikkel i henhold til områder automatisk. Angi følgende inndataparametere i DSM Skann -vinduet: endre størrelse på prosent = 25, spot diameter (i piksler) = 190 – 200, diameter område = 32, Øknings diameter (i piksler) = 8, DSM-konfigurasjon-lav Limit = 0, høy grense = 62, tilstøtende avstand = 100, subtrahere bias = 0.
Merk: resultatene av Scatter intensiteten i nanopartikkel gjenspeiler antallet bundne exosomes på lysbildet.
Representative Results
Multi-Well protein A/G belagt lysbilder (figur 1a) ble funksjonalisert med anti-EphA2 antistoff og deretter brukes til å spesielt fange EphA2-positive exosomes fra serumprøver av pasienter med og uten kreft i bukspyttkjertelen (1 μL/brønn) og inkubert med gull nanoroder bøyd med et anti-CD9 antistoff (figur 1B). DFM bilder av lys spredt fra disse nanopartikler ble analysert ved hjelp av DSM plugin i ImageJ programvare for å kvantifisere den bundne EphA-2 positive exosomes i hver brønn. DSM-algoritmen definerer automatisk grensen for en prøve brønn, filtrerer støyen fra artefakter, beregner det spredte signalet fra hver brønn, og sender ut denne informasjonen (figur 2). DSM-algoritmen attenuates sterkt lysspredning gjenstander fra riper eller rusk til stede i prøven og forbedrer følsomheten og reproduserbarhet for nanopartikkel deteksjon og kan automatisk behandle en batch av lysbilde bilder for høy gjennomstrømming Bruke. Denne algoritmen bruker ImageJ kommandoer og parametere input av brukeren til å trekke bilde bakgrunn, beregne spredning signalet fra hver brønn, og utgang en data og bildefil (Figur 3). Områder av interesse er definert av høy intensitet brønn grenser i fangst bildet ved hjelp av kontur terskel funksjon av ImageJ makro programmet. Bildeanalyser bruker en forhåndsdefinert kontur terskel og bilde parametre for å beregne intensiteten av nanopartikkel spredning for hver brønn.
Som rapportert i vårt tidligere arbeid (utfyllende informasjon om Liang et al.6), exosomes ISOLERT fra PANC-1 cellekulturer preget av overføring elektron mikroskopi og Western Blot utstilt størrelsesområdet, morfologi, og protein markør uttrykk i samsvar med en høy renhet exosome prøven. Den PANC-1 exosomes, utarbeidet med samme prosedyre som vår tidligere arbeid, ble brukt her for å validere våre nPES analysen for exosome kvantifisering. Denne analysen brukte et anti-EphA2 antistoff for å fange opp en stor populasjon av exosomes fra den totale exosome populasjonen og et antistoff mot den generelle exosome protein CD9 for å oppdage fanget exosomes. Resultater oppnådd ved bruk av serielt fortynnede PANC-1 exosome prøver, med protein konsentrasjoner fra 0,24 til 1,2 μg/μL, viste god reproduserbarhet i replikere brønner (figur 4a) og en sterk lineær korrelasjon mellom scatter responsen og exosome proteinkonsentrasjon (figur 4b).
For å demonstrere den potensielle anvendelsen av denne metoden, serumprøver fra pasienter med og uten kreft i bukspyttkjertelen ble analysert for å oppdage overflod av serum exosomes uttrykke kreft-assosiert biomarkør EphA2, ved hjelp av et anti-EphA2 antistoff til direkte fangst mål exosomes fra serum og nanopartikler bøyd med et anti-CD9 antistoff for å oppdage bundne exosomes. Denne analysen viste at serum prøvene fra kreft pasientene i bukspyttkjertelen hadde signifikant høyere nivåer av EphA2 + exosomes (figur 5) enn deres kontroll.
Figur 1: Exosome kvantifisering ordning. (A) skjematisk av multi-Well protein A/G lysbilder (192 brønner) som brukes i denne analysen. (B) mål exosomes er direkte tatt fra prøver, inkludert serum og plasma, av overflate immobilisering på fangst antistoff (f. eks anti-EphA2 antistoff) bundet til raset, og deretter inkubert med gull nanoroder bøyd med en deteksjon antistoff (f. eks anti-CD9 antistoff) før analyse av DFM bildeanalyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Exosome kvantifisering ved å bruke DSM-algoritmen til LMDFM-bilder. Lav forstørrelse bilder behandles med DSM-algoritmen for å eliminere bakgrunns signal og signal gjenstander som kan oppstå fra riper, miksing hulrom, rusk, og ujevn prøvebelysning for å tillate robust deteksjon av gull nanorod signal, som samsvarer med exosome konsentrasjon. Dette tallet har blitt tilpasset med tillatelse fra Sun, D. et al. støy reduksjons metode for kvantifisere Nanopartikkel lysspredning i lav forstørrelse Dark-feltet mikroskop langt felt bilder. Analytisk kjemi. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk av DSM algoritme kommandoer og utganger. Angitt fremgangsmåte bruk innfødt kommandoene fra ImageJ og alle input parameterene er valgt alt etter kravene av eksperimenter via grafisk bruker grenseflate. Dette tallet har blitt tilpasset med tillatelse fra Sun, D. et al. støy reduksjons metode for kvantifisere Nanopartikkel lysspredning i lav forstørrelse Dark-feltet mikroskop langt felt bilder. Analytisk kjemi. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative NPES LMDFM-bilder og DSM-utdata. (A) LMDFM bilde av en nPES analysen analysere en konsentrasjon GRADERING av PANC-1 exosomes og (B) den lineære korrelasjon av det optiske signalet og exosome konsentrasjon fra dette lysbildet (venstre til høyre: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 μg/μL henholdsvis for hver kolonne). Data presenteres som Mean ± SE, n = 6, med en Pearson korrelasjonskoeffisient R2 = 0,99 og koeffisient av variasjon for den reproduserer av hver konsentrasjon < 0,2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: LMDFM signal av EphA2+ exosomes forskjellig i serum fra pasienter med og uten kreft i bukspyttkjertelen. Serum prøver analysert av nPES ved hjelp av et anti-EphA2 fangst antistoff (kreft assosiert) og et anti-CD9 deteksjon antistoff (generell exosome markør) viste en signifikant forskjell i konsentrasjonen av EphA2 + exosomes i serumprøver av pasienter med og uten kreft i bukspyttkjertelen (N = 7/Group). Resultatene er presentert som gjennomsnittet ± SE. * *p = 0,002 av mann-Whitney U-test (tosidig). Dette tallet er endret fra [Sun, D. et al. støy reduksjons metode for kvantifisere Nanopartikkel lysspredning i lav forstørrelse Dark-feltet mikroskop langt felt bilder. Analytisk kjemi. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Exosomes oppstår fra regulert invaginations av den ytre endosome membran som produserer multivesicular organer, en spesialisert undergruppe av endosomes som inneholder et stort antall intraluminal blemmer som gjennomgår fusjon med plasma membranen å løslate modne exosomes inn i ekstracellulære plass. På grunn av denne kognitiv veien kan exosomes bære membran bundne faktorer forbundet med membran fraksjoner som utgjør eller smelter med endosome membranen, samt flere forskjellige typer cytosolic komponenter, og dermed inneholde Last av proteiner, DNA og ulike RNA undergrupper (mRNAs, microRNAs, lange ikke-koding RNAs) som kan reflektere fenotype av deres celle opprinnelse20. Siden exosomes utskilles av de fleste om ikke alle celletyper, kan vise økt sekresjon fra syke eller ondartede celler, og akkumuleres i de fleste kroppsvæsker, exosomes er gjenstand for omfattende og systematisk etterforskning som en lovende minimal invasive midler til å oppdage spesifikke sykdomstilstander og overvåke deres svar på behandling21.
Exosome isolering, som er nødvendig for de fleste nåværende Exosome analysene, er en langvarig og arbeidsintensiv prosedyre som begrenser den kliniske oversettelsen av Exosome biomarkører med potensiell medisinsk relevans. Mange vanlige isolasjons metoder (ultracentrifugation, størrelses ekskludering, nedbør osv.) er ofte ikke tilstrekkelig til å skille exosomes (30 – 100 NM) fra mikro-blemmer (100 – 1000 NM) og apoptotisk organer (100 – 5000 NM) på grunn av overlappinger i deres størrelses områder eller fysiske egenskaper eller kan skade exosome integritet15. Nye tilnærminger er under utvikling som kan tillate raskere exosome analyser, men det er ikke klart hvor gjennomførbart det kan være å implementere mange av disse plattformene i kliniske innstillinger på grunn.
I denne rapporten presenterer vi en ny tilnærming som gjør at nanopartikkel høy gjennomstrømming exosome kvantifisering bruker lav forstørrelse mørkt felt mikroskop bilder. Denne metoden krever ikke exosome rensing, dyrt dedikert utstyr, eller romanen teknisk ekspertise og bør dermed være mottagelig for rask oversettelse i de fleste forskning og kliniske innstillinger. Vår analysen kan brukes til presist kvantifisere konsentrasjonen av et mål exosome befolkning bærer en bestemt biomarkør når analysen resultatene er sammenlignet med en standard kurve, siden våre resultater viser det er en sterk lineær korrelasjon (R2 = 0,99) mellom optisk respons og exosome konsentrasjon. For å demonstrere den virkelige verden potensialet i denne tilnærmingen, har vi gitt data der vi ansatt denne metoden for å kvantifisere konsentrasjonen av en exosome biomarkør assosiert med kreft i bukspyttkjertelen i serumprøver innhentet fra pasienter med og uten kreft i bukspyttkjertelen.
I LMDFM, hele prøven brønnen er avbildet for å unngå utvalget bias funnet i høy forstørrelse DFM analyser, der brukerne må direkte velge eksempel felt for å fange for påfølgende bildeanalyse, men er gjenstand for lysspredning gjenstander fra overflaten uregelmessigheter, inkludert riper og prøve rusk. Denne bakgrunnen kan bli redusert til å oppdage målet exosome-avledet signal ved hjelp av vår DSM støy-reduksjon algoritme som kjører på NIH bildeanalyse programmet, ImageJ, men forsiktighet må likevel tas for å unngå å innføre slike gjenstander som kan redusere det dynamiske spekteret av analysen.
Materialer som brukes i denne analysen:
Multi-Well SuperProtein A/G-lysbilder som holder 1 μL/brønn ble kjøpt fra Arrayit Corporation (AGMSM192BC). Nanopartikler ble innhentet fra Nanopartz (C12-25 -650-TN-di-50-1, 6,4 x 1012/ml). DFM bilder ble tatt med et Nikon DiR2 digitalkamera festet til et Nikon ti-Eclipse mikroskop, med konsistent belysning og en 1/220 s eksponeringstid. Den PANC-1 cellelinje som brukes i denne studien ble kjøpt fra American type Culture Collection.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Arbeidet ble først og fremst støttet av forskningsmidler levert av NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 og R21Al126361-01), Arizona Biomedical Research Commission (ABRC) unge etterforsker prisen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
| Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
| Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
| Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
| NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
| Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
| Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
| TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |
References
- Andaloussi S, E. L., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Choi, D. S., Kim, D. K., Kim, Y. K., Gho, Y. S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes. Proteomics. 13 (10-11), 1554-1571 (2013).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Liang, K., et al. Nanoplasmonic Quantification of Tumor-derived Extracellular Vesicles in Plasma Microsamples for Diagnosis and Treatment Monitoring. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
- Severino, V., et al. Extracellular Vesicles in Bile as Markers of Malignant Biliary Stenoses. Gastroenterology. 153 (2), e498 495-504 (2017).
- Osteikoetxea, X., et al. Detection and proteomic characterization of extracellular vesicles in human pancreatic juice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 499 (1), 37-43 (2018).
- Bulacio, R. P., Nosetto, E. C., Brandoni, A., Torres, A. M. Novel finding of caveolin-2 in apical membranes of proximal tubule and first detection of caveolin-2 in urine: A promising biomarker of renal disease. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
- Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncology. 84, 31-40 (2018).
- Kim, J. E., et al. Diagnostic value of microRNAs derived from exosomes in bronchoalveolar lavage fluid of early-stage lung adenocarcinoma: A pilot study. Thoracic Cancer. 9 (8), 911-915 (2018).
- Boussadia, Z., et al. Acidic microenvironment plays a key role in human melanoma progression through a sustained exosome mediated transfer of clinically relevant metastatic molecules. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 245 (2018).
- An, M., Wu, J., Zhu, J., Lubman, D. M. Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum. Journal of Proteome Research. , (2018).
- Brenner, A. W., Su, G. H., Momen-Heravi, F. Isolation of Extracellular Vesicles for Cancer Diagnosis and Functional Studies. Methods in Molecular Biology. 1882, 229-237 (2019).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Sun, D., et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016).
- Sun, D., Hu, T. Y. A low cost mobile phone dark-field microscope for nanoparticle-based quantitative studies. Biosensors and Bioelectronics. 99, 513-518 (2018).
- Koshikawa, N., Minegishi, T., Kiyokawa, H., Seiki, M. Specific detection of soluble EphA2 fragments in blood as a new biomarker for pancreatic cancer. Cell Death & Disease. 8 (10), e3134 (2017).
- Clayton, A., Turkes, A., Navabi, H., Mason, M. D., Tabi, Z. Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes. Journal of Cell Science. 118 (Pt 16), 3631-3638 (2005).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Developmental Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Panagiotara, A., Markou, A., Lianidou, E. S., Patrinos, G. P., Katsila, T. Exosomes: a cancer theranostics road map. Public Health Genomics. 20 (2), 116-125 (2017).
