Summary
Klinisk oversættelse af exosome afledte biomarkører for syge og maligne celler hæmmes af manglen på hurtige og præcise kvantificeringsmetoder. Denne rapport beskriver brugen af mørke mikroskoper med lav forstørrelse til at kvantificere specifikke exosomvesikler subtyper i små mængder serum-eller plasmaprøver.
Abstract
Inficerede eller maligne celler udskiller ofte flere exosomer, hvilket fører til forhøjede niveauer af sygdoms associerede exosomer i kredsløbet. Disse exosomer har potentialet til at fungere som biomarkører for sygdomsdiagnosticering og til at overvåge sygdomsprogression og behandlingsrespons. Men de fleste exosomvesikler analyseprocedurer kræver exosomvesikler isolation og rensning trin, som normalt er tidskrævende og arbejdskrævende, og dermed af begrænset nytte i kliniske indstillinger. Denne rapport beskriver en hurtig procedure til at analysere specifikke biomarkører på exosomer ydre membran uden at kræve separate isolering og oprensningstrin. I denne metode, er exosomer fanget på overfladen af et dias ved exosome-specifikke antistoffer og derefter hybridiseret med nanopartikel-konjugeret antistof sonder specifikke for en sygdom. Efter hybridisering, er den overflod af målet exosomvesikler befolkning bestemmes ved at analysere lav forstørrelse mørk-felt mikroskop (LMDFM) billeder af de bundne nanopartikler. Denne fremgangsmåde kan nemt anvendes til forskning og klinisk brug til at analysere membran-associerede exosomvesikler biomarkører forbundet med sygdom.
Introduction
Exosomer frigives fra de fleste celletyper og spiller en central rolle i celle-til-celle kommunikation, herunder patofysiologiske processer forbundet med forskellige sygdomme, da de kan være hjemsted for specifikke væv eller celletyper, og indeholder en række nukleinsyrer , proteiner og lipider, der afspejler deres oprindelses celle og kan øve regulerende virkninger på deres recipient celler1,2,3,4. Exosomer er ofte udskilles på forhøjede niveauer i sygdomstilstande, kan interagere med både tilstødende og fjerne celler, og findes på relativt høj koncentration i cirkulation samt de fleste andre kropsvæsker, herunder spyt, urin, bugspytkirtel og galde saft og bronchoalveolær skylning væske5,6,7,8,9,10,11. Denne overflod og stabilitet af exosomer i menneskelige kropsvæsker, kombineret med deres informationsrige natur, gør dem ideelle biomarkører for sygdom diagnose og behandling overvågning.
Dette omfatter tumor-afledte exosomer (TDEs), som indeholder tumor-specifikke eller selektive faktorer, som kan tjene som sygdom biomarkører, herunder tumor-associerede mutante alleler. TDEs kan deltage i remodeling af tumor mikromiljø for at lette tumor udvikling og metastaser, og regulere anti-tumor svar12. Øget TDE sekretion er en fælles fænotype af de fleste kræftformer og flere funktioner i tumor mikromiljø, herunder hypoxi, sure pH, og betændelse, er kendt for at fremme exosomvesikler sekretion. Overraskende, i betragtning af antallet af celler, der udskiller exosomer, en stigning i det totale exosomvesikler niveau kan, selv, fungere som en kræft biomarkør. For eksempel, en nylig undersøgelse fandt, at den samlede EV koncentration i galde juice diskriminerer maligne og nonmaligne i fælles galde Duct stenose patienter med 100% nøjagtighed7. Lignende resultater er blevet fundet med undersøgelser ved hjælp af andre kropsvæsker, herunder plasma. Men på grund af potentialet for emne variation og andre forstyrrende faktorer har de fleste undersøgelser, der undersøger exosomer som sygdoms biomarkører, fokuseret på påvisning af biomarkør, der er selektivt forbundet med TDEs i stedet for total exosomvesikler Numre.
Det er dog stadig en udfordring at oversætte exosomvesikler biomarkører til klinisk praksis, da de fleste rapporterede exosomvesikler assay tilgange kræver tidskrævende og arbejdskraftintensive isolations procedurer 13. I øjeblikket populære exosomvesikler isolation metoder omfatter ultracentrifugering, tæthed gradienter, størrelse-udelukkelse, co-nedbør, affinitet fange, og mikrofluidisk kapllærelektroforese isolation tilgange. Ultracentrifugering er "Gold standard" metode, og er mest almindeligt anvendt til exosomvesikler isoleringer, men denne procedure er tidskrævende og resulterer i exosomvesikler skader og exosomvesikler membran klyngedannelse, og producerer exosomvesikler prøver, der er forurenet med proteiner, lipoproteiner og andre faktorer, der kan påvirke efterfølgende analyser14. De fleste exosomvesikler isolations metoder, herunder ultracentrifugering, kan ikke adskille exosomer (30 – 150 nm) fra mikro-vesikler (100 – 1.000 nm) og apoptotiske organer (100 – 5000 nm), som opstår gennem forskellige mekanismer og har forskellige funktioner, på grund af størrelsen overlapning mellem disse grupper, og mangfoldigheden af exosomvesikler populationer15. Nye tilgange er nødvendige for at forbedre følsomheden og reproducerbarhed af exosomvesikler analyser ved at forbedre exosomvesikler opsving samtidig reducere exosomvesikler skader og forurening, selv om enhver analyser baseret på sådanne metoder vil også nødt til at være optimeret til at gøre dem egnet til oversættelse til applikationer i kliniske indstillinger.
Flere nylige undersøgelser har foreslået at ansætte integrerede platforme til at indfange og analysere exosomer direkte fra kropsvæsker. Disse metoder anvender microfluidic, elektro kinetisk, affinitet Capture, og forskellige andre metoder til exosomvesikler isolation, og elektrokemi, overflade Plasmon resonans, og andre metoder til at detektere erobrede exosomer. Det er ikke klart, hvor muligt mange af disse tilgange vil være i kliniske indstillinger, på grund af deres kompleksitet, udgifter, lav-gennemløb eller andre spørgsmål.
Vi har udviklet en hurtig og billig analyse, der kan anvendes til følsom og specifik kvantificering af totale exosomer og specifikke exosomvesikler subtyper, herunder sygdoms associerede exosomer, såsom TDEs, som kun kræver en lille mængde prøve, og som anvender et strømlinet workflow, der er velegnet til kliniske miljøer. I denne analyse er et lysbillede belagt med antistoffer, der binder enten en exospecifik eller sygdomsspecifik markør, der udtrykkes på exosomvesikler overfladen, med henblik på direkte at indfange målexosomer til stede i små plasma-eller serumprøver, der påføres brønde på Dias. Erobrede exosomer er derefter hybridiseret med en antistof-konjugeret nanopartikel, der genkender biomarkør af interesse på disse exosomer, som kan være enten en generel exosomvesikler markør eller en faktor specifik for en exosomvesikler under type af interesse. Billeder af disse prøve brønde opsamles derefter ved hjælp af et mørkt felt mikroskop (DFM) og analyseres for at måle lyset spredt fra nanopartikler bundet til exosomer af interesse fanget i hver prøve godt6,16,17. Især Imaging en hel prøve godt ved lav forstørrelse DFM (LMDFM) undgår en udvælgelse bias stødt med høj forstørrelse DFM analyser, når brugerne skal direkte vælge, hvilke felter til at fange for efterfølgende billedanalyse. LMDFM billedanalyse er underlagt lys spredning artefakter fra overflade uregelmæssigheder, herunder ridser og prøve snavs, men denne baggrund kan reduceres ved hjælp af en simpel støjreduktion algoritme vi udviklet til at køre på NIH billedanalyse program, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Denne algoritme anvender først en input kontur tærskel, der bruges til at registrere afgrænsningen af prøvebrønden for at definere billedets område til efterfølgende analyse. Det område, der er defineret af dette kontur område, opdeles derefter til separat signal til stede i de røde, blå og grønne kanaler i billedet, og den blå kanal trækkes fra den røde kanal for at fjerne signalet fra overflade artefakter og ujævn belysning fra nanorod Signal.
Denne artikel beskriver, hvordan du bruger denne analyse til hurtigt at kvantificere enten totale eller specifikke exosomvesikler niveauer i plasma eller serumprøver.
Protocol
1. klargøring af nanopartikel sonder
Bemærk: denne analyse udnytter Funktionaliserede guld Nanorods (AuNRs; 25 Nm diameter x 71 nm længde), der er kovalent konjugeret med neutravidin polymerer (AV) og har en overflade Plasmon resonans peak, der producerer et rødt (641 nm peak) spredning signal på DFM Belysning.
- Der vaskes 40 μL AuNR-AV (2,56 x 1011 partikler) tre gange med 200 μl PBS (pH 7,0) ved centrifugering og aspiration (8.500 x g ved 4 °c i 10 minutter) efterfulgt af et endeligt Centrifugerings-og Aspirations trin, hvorefter aunr-AV-pillen suspenderes i 40 μL PBS.
- Denne AuNR-AV-suspension blandes med 10 μL biotinyleret antistof (0,5 mg/mL), der er specifikt for et antigen på overfladen af den exosomvesikler subtype af interesse og 150 μL PBS og derefter blandes ved 4 °C i 2 timer ved hjælp af en mixer til at tillade neutravidin-biotin binding til at nå færdig.
- De resulterende antistof-konjugeret AuNRs (AuNR-IgG) vaskes tre gange ved centrifugering og aspiration (6.500 x g ved 4 °c i 10 minutter), hvorefter de stoppes i 200 μl PBS og opbevares ved 4 °c indtil brug.
Bemærk: steril teknik og korte opbevaringstider skal anvendes for at undgå kontaminering og nedbrydning af AuNR-IgG. Det er bedst at bruge antistof-konjugeret Aunr inden for 24 timer efter konjugering.
2. klargøring af EV-opsamlings glas
- De udvalgte exosomvesikler-antistoffer fortyndes til 0,025 mg/mL i PBS, og der tilsættes 1 μL/brønd af denne fortynding til et multi-Well-protein A/G-dias, og dette dias inkuperes ved 37 °C i 1 time i et befugtede kammer for at tillade optagelse af antistof binding til protein A/G i immobiliseret på på diaset.
- Der aspireres brønde til at fjerne ubundne antistoffer, og der skylles tre gange med tilsætning og aspiration på 1 μL/brønd af PBS, og derefter indlæses hver brønd med 1 μL blokerende buffer (Se tabel over materialer), og sliden i 2 timer ved 37 °c i et befuret kammer til b at låse eventuelle resterende protein bindingssteder.
- Aspirer brønde til at fjerne blokerende buffer, vask brønde tre gange ved tilsætning og aspiration af 1 μL/brønd af PBS, og brug straks de blokerede dias til exosomvesikler opsamling og analyse.
3. standard kurve klargøring
- For præcist at kvantificere den absolutte eller relative overflod af en specifik exosomvesikler subtype, skal brugeren generere en standardkurve med en ren exosomvesikler befolkning, der ensartet udtrykker exosomvesikler overflade biomarkør af interesse. Denne undersøgelse analyserer den overflod af exosomer, der udtrykker en metastase-associeret membran protein, ephrin a2 receptor, som har en rapporteret forhold til pancreascancer fase og prognose6,18.
Bemærk: den menneskelige bugspytkirtel Cancer cellelinje PANC-1 og dens exosomer er kendt for at udtrykke dette protein og isolerede exosomer fra denne cellelinje blev brugt til at generere en standardkurve til at kvantificere antallet af exosomer, der udtrykker dette protein i komplekse exosomvesikler Prøver. - Kultur celler i 48 timer ved 37 °c i serum frie dyrkningsmedier for at tillade exosomvesikler akkumulering i medierne, isoleres cellekultur supernatanter ved centrifugering af ophængs kulturer eller direkte aspiration af kultur medier fra vedhæng ende cellekulturer.
- Centrifuger de indsamlede medier ved 2000 x g i 30 min. for at fjerne snavs og genvinde supernatanten.
- Den afklarede dyrknings supernatanten filtreres gennem en 0,45 μm lav proteinbindende filterenhed med passende kapacitet (f. eks. en 250 mL polyethersulfon vakuum filtreringsenhed).
- Det resulterende filtrat koncentreres ved centrifugering ved 3200 x g ved hjælp af et 100.000 nominelt molekylvægt grænseværdi filter system til en 250 μl slutvolumen. Saml den tilbageholdte mængde fra dette filter, vask filteret med 200 μL PBS, og Kombiner dette vaske volumen med den indsamlede exosomvesikler prøvevolumen.
- Denne prøve centrifugeres ved 21.000 x g i 45 minutter, og supernatanten opsamles forsigtigt, idet der udvises omhu for ikke at indsamle udfældede materialer.
- Den genvundne supernatanten centrifugeres ved 100.000 x g i 3 timer for at fremskynde exosomerne. Aspirer væk supernatanten og saml exosomvesikler pellet i 100 μL PBS.
- Opbevar de resulterende exosomvesikler suspensioner ved 4 °C, hvis de anvendes inden for 24 timer eller ved-80 °C ved langtidsopbevaring.
Bemærk: Undlad at underkaste exosomvesikler prøver at gentage fryse-tø cyklusser. - Kvantificere en alikvot af exosomvesikler suspension efter blanding ved direkte måling af exosomvesikler tal (f. eks ved nanopartikel tracking analyse eller justerbare resistive puls sensing eller ved at måle proteinkoncentrationen af exosomvesikler lysaterne af mikro-bicinchoninic syre analyse, eller en tilsvarende metode, som et middel til at tilnærme exosomvesikler mængde)16,19.
- Generer et sæt af serielle fortyndinger af exosomvesikler suspension til at tillade sammenligning af nanopartikel signal til input exosomvesikler antal eller proteinindhold.
- Der overføres 1 μL af hver exosomvesikler standard til hver af dens replikat brønde på analyse pladen.
Bemærk: standard kurver kan bruges til at beregne hældningen af korrelations linjen mellem nanopartikel signal og exosomvesikler koncentration til (1) evaluere analysens ydeevne og (2) bestemme den relative koncentration af Target exosomer i eksperimentelle prøver.
4. behandling af humane plasma-eller serumprøver
- Indsaml plasma-eller serumprøver ved standardmetoder og opbevar ved-80 °C, indtil det er nødvendigt for exosomvesikler analyse. Hurtigt tø prøver i en stuetemperatur vandbad. Gentagne gange blandes optøede prøver ved inversion at fremme homogen suspension.
Bemærk: resultater fra serum-og plasmaprøver må ikke være ækvivalente, da der er en signifikant frigivelse af exosomer under koagulations reaktionen. - Centrifuge plasma eller serumprøver ved 500 x g i 15 minutter for at udfælde protein aggregater og andet snavs. En alikvot plasma-eller serum prøve overføres til et frisk rør, og der tilsættes PBS for at generere en 1:1-fortynding. Den fortyndede prøve blandes med blid vortexning eller inversion efter behov. Der overføres 1 μL af hver plasma-eller serum suspension til hver af dens replikat brønde på analyse pladen.
5. exosome optagelse og afsløring
- Last brønde på et blokeret EV-indfangnings dias med 1 μL/brønd af exosomvesikler prøve ved hjælp af 8 replikater pr. prøve og inkuperer diaset natten over ved 4 °C i et befurede kammer. Aspirerer alle prøve brønde, og tilsæt derefter 1 μL/brønd af PBS til at vaske brønde og fjerne ubundne exosomer og andre kontaminanter fra den ilagte exosomvesikler prøve.
- Stikprøve brønde med 1 μL/brønd af en tidligere tilberedt AuNR-IgG suspension (se punkt 1 ovenfor) og inkuperer sliden i 2 timer ved 37 °C i et befurede kammer. Udstræb nanopartikel opløsningen og vask sliden i PBS suppleret med 0,01% Tween-20 (PBST) i 10 minutter ved hjælp af en mixer, derefter Aspirer og vask alle prøve brønde med deioniseret vand i 10 minutter ved hjælp af en roterende mixer, og luft-tør for efterfølgende LMDFM billeder.
Bemærk: Inter-assay koefficienter for variation (CV'er) vurderes ud fra otte replikater af samme prøve. Prøver, der udviser CVs > 20%, betragtes som ikke-informative og bør gentages, hvis der er tilstrækkelig prøve.
6. hentning af DFM-afbildning
- Capture billeder til exosomvesikler kvantificering under konsekvent belysning ved hjælp af et digitalt kamera, der er tilsluttet et mikroskop udstyret med en mørk-felt kondensator (1,2 < NA < 1,4) og en 4X mål beskæftiger en 1/220 s eksponeringstid.
- Åbn softwaren til billedoptagelse.
Bemærk: vi bruger NIS-Elements mikroskop billedbehandlingssoftware (Se tabel over materialer) til den protokol, der er beskrevet nedenfor, men det er muligt at bruge en anden software, der kan matche dens billed optagelses parametre. NIS-Elements Viewer imaging software er en gratis standalone program til at se billedfiler og datasæt, der indeholder analyse, visualisering og arkivering værktøjer. Parametrene nedenfor er også for et mikroskop med autofokus og en automatiseret fase, der tillader flere billeder til automatisk at blive fanget og syet ind i et enkelt billede. - Anbring glide hovedet på mikroskop scenen, Juster glide positionen og Påfør en lille dråbe fordybning olie på bagsiden af sliden, hvor kondensatoren linsen kontakter diaset.
- Klik på Live -knappen i softwaregrænsefladen, og Juster eksponeringstid mod en høj koncentrations standard godt for at sikre, at billedet ikke er mættet.
- Åbn vinduet Scan stort billede fra fanen Hent , og Angiv parametrene for softwaregrænsefladen på følgende måde: makro billede optisk conf = Current; Mål: 2:10x, scanning optisk conf = nuværende, mål: 2:10x; Syning overlap = 20%; Syning via = optimal sti.
- Vælg Opret stort billede, Luk aktiv lukker under scenen bevægelse, vent før hver fange: 20 MS, fokus manuelt ved start, og Brug trin-for-trin fokus hver 20 felt. Disse indstillinger vil blive gemt med de scannede billeder.
- Flyt mikroskopet for at definere venstre øverste højre nederste grænse for målscannings feltet. Juster fokus for at opnå et klart billede på skærmen og justere kondensatoren indstillinger og miljømæssig belysning efter behov for at minimere eventuelle belysning uregelmæssigheder i det fokuserede billede.
- Navngiv billed outputfilen i softwaren. Klik på Scan -knappen og lad mikroskopet scanne og oprette og gemme et syet billede af hele diaset.
- Åbn det gemte billede med den billed optagelses software, du bruger, og Gem det på 1/8-skalaen til efterfølgende analyse af DSM-pluginet i ImageJ.
7. DFM-billedanalyse
- Download ImageJ programmet (https://imagej.nih.gov/ij/). Installer DSM-algoritme-pluginet i ImageJ ved hjælp af de instruktioner, der er angivet på https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.
- Åbn ImageJ-softwaren, og angiv derefter følgende inputparametre inden for DSM-algoritmen: kontur tærskel (CT) = 253,020, type = rød, midterskala (r) = 0,8, lav (lt)/høj (HT) kvantificeringsgrænse = 0/62.
- Åbn det gemte billede fra afsnit 6,8 med ImageJ. Vælg DSM-scannings knappen fra fanen plugins , og definer derefter antallet af kolonner og rækker i henhold til det åbne billede. Programmet kan genkende afsløre områder og analyse scatter intensitet af nanopartikel i overensstemmelse områder automatisk. Angiv følgende inputparametre i DSM- scannings vinduet: Tilpas procent = 25, spot diameter (i pixels) = 190 – 200, diameter Range = 32, tilvækst diameter (i pixels) = 8, DSM-konfiguration-lav Limit = 0, høj grænse = 62, tilstødende afstand = 100, subtrahere bias = 0.
Bemærk: resultaterne af scatter-intensiteten af nanopartikler afspejler mængden af bundne exosomer på diaset.
Representative Results
Multi-Well protein A/G belagte slides (figur 1a) blev funktionaliseret med anti-EphA2 antistof og blev derefter brugt til specifikt at indfange EphA2-positive exosomer fra serumprøver af patienter med og uden kræft i bugspytkirtlen (1 μl/brønd) og inkuerede med guld nanoroer konjugeret med et anti-CD9 antistof (figur 1b). DFM-billeder af lys spredt fra disse nanopartikler blev analyseret ved hjælp af DSM-pluginet i ImageJ software til at kvantificere de bundne EphA-2 positive exosomer i hver brønd. DSM-algoritmen definerer automatisk grænsen for en prøvebrønd, filtrerer støjen fra artefakter, beregner det spredte signal fra hver brønd og udsender disse oplysninger (figur 2). DSM-algoritmen dæmper kraftigt lysspredning artefakter fra ridser eller snavs til stede i prøven og forbedrer følsomheden og reproducerbarhed af nanopartikel detektion og kan automatisk behandle en serie af slide billeder for høj gennemløb Bruge. Denne algoritme bruger ImageJ kommandoer og parametre input af brugeren til at trække billede baggrund, beregne spredningen signal fra hver brønd, og output en data og billedfil (figur 3). Regioner af interesse defineres af de høje intensitets grænser i Capture-billedet ved hjælp af kontur tærskel funktionen i ImageJ-makro programmet. Billedanalyser bruger en foruddefineret kontur tærskel og billedparametre til at beregne intensiteten af nanopartikler spredt for hver brønd.
Som rapporteret i vores tidligere arbejde (supplerende oplysninger om Liang et al.6), exosomer isoleret fra Panc-1 cellekulturer karakteriseret ved transmission elektronmikroskopi og Western blot udstillet størrelsesintervallet, morfologi, og protein markør udtryk, der er i overensstemmelse med en høj renhed exosomvesikler prøve. PANC-1 exosomer, tilberedt med samme procedure som vores tidligere arbejde, blev brugt her til at validere vores nPES-assay for exosomvesikler kvantificering. Denne analyse anvendte et anti-EphA2-antistof til at indfange en stor population af exosomer fra den totale exosomvesikler population og et antistof mod det generelle exosomvesikler protein CD9 til at detektere erobrede exosomer. Resultater opnået ved hjælp af serielt fortyndede PANC-1 exosomvesikler prøver, med proteinkoncentrationer fra 0,24 til 1,2 μg/μL, viste god reproducerbarhed i replikat brønde (figur 4a) og en stærk lineær korrelation mellem scatter respons og exosomvesikler proteinkoncentration (figur 4b).
For at demonstrere den potentielle anvendelse af denne metode, blev serumprøver fra patienter med og uden kræft i bugspytkirtlen analyseret for at detektere den overflod af serum exosomer, der udtrykker den kræft associerede biomarkør EphA2, ved hjælp af et anti-EphA2 antistof til direkte fange målexosomer fra serum og nanopartikler konjugeret med et anti-CD9 antistof for at detektere bundne exosomer. Denne analyse afslørede, at serumprøver fra kræftpatienter i bugspytkirtlen havde signifikant højere niveauer af EphA2 + exosomer (figur 5) end deres kontrol.
Figur 1: exosome kvantificerings ordning. (A) skematisk af multi-Well-protein A/G-dias (192 brønde), der anvendes i denne analyse. (B) Target exosomer opsamles direkte fra prøver, herunder serum og plasma, ved overflade immobilisering på Capture-antistoffet (f. eks. anti-EphA2-antistof), der er bundet til diaset, og derefter inkuruteret med guld nanoroer konjugeret med en detekterings anti-CD9-antistoffer) før analyse af DFM-billedanalyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: exosome kvantificering ved at anvende DSM-algoritmen på LMDFM-billeder. Billeder med lav forstørrelse behandles med DSM-algoritmen for at eliminere baggrunds signal og signal artefakter, der kan opstå som følge af ridser, blande hulrum, snavs og ujævn prøve belysning for at give mulighed for robust detektering af guld-nanorod-signal, som korrelerer med exosomvesikler koncentration. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Sun, D. et al. støjreduktion metode til kvantificering af nanopartikel lys spredning i lav forstørrelse mørk-felt mikroskop far-Feltbilleder. Analytisk kemi. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk af DSM-algoritme kommandoer og-udgange. Angivne trin bruger indfødte kommandoer fra ImageJ og alle inputparametre er valgt i henhold til kravene i eksperimenter via grafisk brugergrænseflade. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Sun, D. et al. støjreduktion metode til kvantificering af nanopartikel lys spredning i lav forstørrelse mørk-felt mikroskop far-Feltbilleder. Analytisk kemi. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative nPES LMDFM-billeder og DSM-outputdata. A) lmdfm-billede af en npes-analyse, der analyserer en koncentrations gradient af Panc-1 exosomer og (B) den lineære korrelation af det optiske signal og exosomvesikler koncentration fra dette dias (venstre til højre: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 μg/μl henholdsvis for hver kolonne). Data præsenteres som middel ± SE, n = 6, med en Pearson korrelationskoefficient R2 = 0,99 og variationskoefficient for replikaterne for hver koncentration < 0,2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: LMDFM- signalet fra EphA2 + exosomer er forskelligt fra serum fra patienter med og uden kræft i bugspytkirtlen. Serumprøver analyseret af nPES ved hjælp af et anti-EphA2 Capture antistof (Cancer associeret) og et anti-CD9 detektionsanti stof (generel exosomvesikler markør) udviste en signifikant forskel i koncentrationen af EphA2 + exosomer i serumprøver af patienter med og uden kræft i bugspytkirtlen (N = 7/gruppe). Resultaterne præsenteres som middel ± SE. * *p = 0,002 af Mann-Whitney U-test (tosidet). Dette tal er blevet ændret fra [Sun, D. et al. støjreduktion metode til kvantificering af nanopartikel lys spredning i lav forstørrelse mørk-felt mikroskop far-Feltbilleder. Analytisk kemi. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Exosomer stammer fra regulerede invagler af den ydre endosome membran, der producerer multi vesikulære organer, en specialiseret delmængde af endosomer, der indeholder et stort antal intraluminale vesikler, der gennemgår fusion med plasma membranen for at frigive modne exosomer i det ekstracellulære rum. På grund af denne Biogenese pathway, kan exosomer bære membran bundne faktorer forbundet med membran fraktioner, der omfatter eller smelter sammen med den endosome membran, samt flere forskellige typer af cytosoliske komponenter, og dermed indeholder ladninger af proteiner, DNA og forskellige RNA-undertyper (mRNAs, microRNAs, lange ikke-kodende RNA'er), der kan afspejle Fænotypen af deres oprindelses celle20. Da exosomer udskilles af de fleste, hvis ikke alle celletyper, kan udstille øget sekretion fra syge eller maligne celler, og ophobes i de fleste kropsvæsker, exosomer er genstand for omfattende og systematisk undersøgelse som en lovende minimalt invasive midler til at påvise specifikke sygdomstilstande og overvåge deres respons på behandling21.
Exosomvesikler isolation, som er nødvendig for de fleste aktuelle exosomvesikler analyser, er en langvarig og arbejdskrævende procedure, der begrænser den kliniske oversættelse af exosomvesikler-associerede biomarkører med potentiel medicinsk relevans. Mange almindelige isolations metoder (ultracentrifugering, size-udelukkelse, nedbør osv.) skelner ofte ikke tilstrækkeligt mellem exosomer (30 – 100 nm) fra mikro-vesikler (100 – 1.000 nm) og apoptotiske organer (100 – 5000 nm) på grund af overlapninger i deres størrelsesintervaller eller fysiske egenskaber eller kan beskadige exosomvesikler integritet15. Nye tilgange er under udvikling, der kan give mulighed for hurtigere exosomvesikler analyser, men det er ikke klart, hvor muligt det kan være at gennemføre mange af disse platforme i kliniske indstillinger på grund.
I denne rapport præsenterer vi en roman tilgang, der tillader nanopartikel-baseret høj-gennemløb exosomvesikler kvantificering ved hjælp af lav forstørrelse mørke felt mikroskop billeder. Denne metode kræver ikke exosomvesikler rensning, dyrt dedikeret udstyr, eller ny teknisk ekspertise og bør derfor være muligt at hurtig oversættelse i de fleste forskning og kliniske indstillinger. Vores analyse kan anvendes til præcist at kvantificere koncentrationen af et mål exosomvesikler befolkning bærer en specifik biomarkør, når analysen resultater er sammenlignet med en standardkurve, da vores resultater udviser der er en stærk lineær korrelation (R2 = 0,99) mellem optisk respons og exosomvesikler koncentration. For at demonstrere den virkelige verden potentialet i denne tilgang, vi har tilvejebragt data, hvor vi anvendte denne metode til at kvantificere koncentrationen af en exosomvesikler biomarkør forbundet med kræft i bugspytkirtlen i serumprøver opnået fra patienter med og uden kræft i bugspytkirtlen.
I LMDFM afbildes hele prøvebrønden for at undgå den selektions skævhed, der findes i DFM-analyser med høj forstørrelse, hvor brugerne direkte skal vælge de eksempelfelter, der skal tages til efterfølgende billedanalyse, men er underlagt synlige artefakter fra overfladen uregelmæssigheder, herunder ridser og prøve affald. Denne baggrund kan reduceres til at detektere målet exosome-afledt signal ved hjælp af vores DSM støjreduktion algoritme, der kører på NIH billedanalyse program, ImageJ, men pleje skal stadig træffes for at undgå at indføre sådanne artefakter, som kan reducere det dynamiske område af analysen.
Materialer, der anvendes i denne analyse:
Multi-Well SuperProtein A/G-dias med 1 μL/brønd blev købt hos Arrayit Corporation (AGMSM192BC). Nanopartikler blev fremstillet af Nanopartz (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 1012/ml). DFM-billeder blev taget med et Nikon DiR2 digital kamera fastgjort til et Nikon ti-Eclipse mikroskop, med konsistent belysning og en 1/220 s eksponeringstid. PANC-1-celle linjen, der blev brugt i dette studie, blev købt fra American type Culture Collection.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Arbejdet blev primært støttet af forskningsmidler fra NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 og R21Al126361-01), den unge investigator-pris, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
| Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
| Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
| Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
| NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
| Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
| Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
| TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |
References
- Andaloussi S, E. L., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Choi, D. S., Kim, D. K., Kim, Y. K., Gho, Y. S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes. Proteomics. 13 (10-11), 1554-1571 (2013).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Liang, K., et al. Nanoplasmonic Quantification of Tumor-derived Extracellular Vesicles in Plasma Microsamples for Diagnosis and Treatment Monitoring. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
- Severino, V., et al. Extracellular Vesicles in Bile as Markers of Malignant Biliary Stenoses. Gastroenterology. 153 (2), e498 495-504 (2017).
- Osteikoetxea, X., et al. Detection and proteomic characterization of extracellular vesicles in human pancreatic juice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 499 (1), 37-43 (2018).
- Bulacio, R. P., Nosetto, E. C., Brandoni, A., Torres, A. M. Novel finding of caveolin-2 in apical membranes of proximal tubule and first detection of caveolin-2 in urine: A promising biomarker of renal disease. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
- Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncology. 84, 31-40 (2018).
- Kim, J. E., et al. Diagnostic value of microRNAs derived from exosomes in bronchoalveolar lavage fluid of early-stage lung adenocarcinoma: A pilot study. Thoracic Cancer. 9 (8), 911-915 (2018).
- Boussadia, Z., et al. Acidic microenvironment plays a key role in human melanoma progression through a sustained exosome mediated transfer of clinically relevant metastatic molecules. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 245 (2018).
- An, M., Wu, J., Zhu, J., Lubman, D. M. Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum. Journal of Proteome Research. , (2018).
- Brenner, A. W., Su, G. H., Momen-Heravi, F. Isolation of Extracellular Vesicles for Cancer Diagnosis and Functional Studies. Methods in Molecular Biology. 1882, 229-237 (2019).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Sun, D., et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016).
- Sun, D., Hu, T. Y. A low cost mobile phone dark-field microscope for nanoparticle-based quantitative studies. Biosensors and Bioelectronics. 99, 513-518 (2018).
- Koshikawa, N., Minegishi, T., Kiyokawa, H., Seiki, M. Specific detection of soluble EphA2 fragments in blood as a new biomarker for pancreatic cancer. Cell Death & Disease. 8 (10), e3134 (2017).
- Clayton, A., Turkes, A., Navabi, H., Mason, M. D., Tabi, Z. Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes. Journal of Cell Science. 118 (Pt 16), 3631-3638 (2005).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Developmental Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Panagiotara, A., Markou, A., Lianidou, E. S., Patrinos, G. P., Katsila, T. Exosomes: a cancer theranostics road map. Public Health Genomics. 20 (2), 116-125 (2017).
