Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーニング興味の人間 DNA 領域にバインドできる転写因子 (TFs) を識別するためにプロトコルを紹介します。このメソッドのバインディングを問い合わせたりすることができます高速スクリーニング パイプラインを使用して > 単一の実験で 1,000 TFs。

Abstract

各人間の遺伝子を調節する転写因子 (TFs) のセットを識別するは、多数の実験と計算のアプローチの統合を必要とする困難な作業です。このような 1 つの方法は、酵母 1 ハイブリッド (Y1H) 試金、TFs と DNA の相互作用の領域、レポーター遺伝子を用いた酵母核の環境でテストします。Y1H アッセイを含む 2 つのコンポーネント: 'DNA-餌' (例えば.、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等) と ' TF-犠牲、' レポーター遺伝子の活性化のため上映することができます。Y1H 画面を実行する最も公開されたプロトコルは DNA 餌酵母に TF 獲物ライブラリまたは配列の変換に基づいています。ここでは、パイプラインについて述べる、強化された Y1H と呼ばれる (eY1H) 試金、TF 獲物系統高密度配列を使用して配列コレクションを持つ DNA 餌株を交配による TF DNA の相互作用を尋問するところ、1,536 のスクリーニングができる (HDA) ロボットプラット フォームコロニーの形式です。これにより、スループットが劇的に増加 (60 DNA 餌系列 > 1,000 TFs 研究員あたり 2 週間はかかる) と再現性。画面とそれらの解決方法の中に発生する問題の例と同様、1,086 人間 TFs の配列に対してヒトプロモーター配列をテストすることによって期待される結果の種類を示しています。

Introduction

バイオメディカル分野で中心的な問題は、各人間の遺伝子を調整するメカニズムを決定します。転写は遺伝子発現を制御する最初のステップと対象の各遺伝子は、転写因子 (TFs) の規制を受けます。人間はエンコードのことを考える > 1,500 TFs1、2、各遺伝子の発現を制御する TFs の完全なセットを識別する開かれた挑戦に残る。

TF DNA の相互作用をマップする 2 種類の方法を使用できます: TF 中心と DNA の方法3 (図 1 a)。TF を中心とした方法でまたは DNA 結合特異性を決定するゲノム DNA 領域にバインドするための関心の TF がプローブされます。これらのメソッドには、クロマチン免疫沈降 (チップ) 続いて高スループット シーケンス、タンパク質結合マイクロ アレイと SELEX4,5,6が含まれます。DNA を中心とした方法では、DNA 配列に結合する TFs のセットを決定する興味の DNA シーケンスがプローブされます。このようなメソッドの中で最も広く応用イースト 1 ハイブリッド (Y1H) 試金、TFs と DNA の相互作用の地域、レポーター遺伝子7,8,9を使用して酵母核の環境でテスト済みです。

Y1H アッセイを含む 2 つのコンポーネント: 'DNA-餌' (例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等) と ' TF-犠牲、' レポーター遺伝子活性化9,10 (図 1 b) を上映することができます。DNA の餌は上流のクローン作成 2 つのレポーターの遺伝子 (LacZおよびHIS3) および両方の DNA bait::reporter 構造、chromatinized 'DNA 餌系統 ' を生成する酵母ゲノムに統合されて。TF DNA の相互作用のために採取する DNA 餌ひずみに TF 獲物、Gal4 TF、酵母の活性化ドメイン (AD) 融合した TF を表現するプラスミッドで符号化を導入します。TF 獲物は餌 DNA シーケンスにバインドされた場合 TF 獲物で存在の広告は、この両方のレポーターの遺伝子の活性化に します。その結果、肯定的な相互作用を持つ細胞をプレート 3-アミノ-1,2,4-トリアゾール (3 AT)、競争の阻害剤を克服し同様、ヒスチジンに欠けている成長のための選択および X gal の存在下で青いコロニーとして視覚化できます。強力な酵母 Gal4 AD を使用すると、Y1H のアッセイは、リプレッサーと同様に、転写活性化因子の相互作用を検出できます。さらに、TF-犠牲が強い酵母プロモーター (ADH1) から出されることを考えるは、TFs 低内因性発現レベルが、チップ11,12の検出に挑戦しているのも相互作用を検出できます。

Y1H アッセイを行うため最も公開プロトコル選択、ピッキング、コロニーおよび相互作用の TF を識別するために配列することによって続いてプールの TF 獲物ライブラリを変換することによって酵母 DNA 餌に TF-犠牲を導入することに基づいています。個々 の変換8,9のクローンを作成します。これらは、時間のかかるプロトコル、研究員あたりテストすることができます DNA シーケンスの数を制限することです。呼ばれる、Y1H のアッセイの最近の改善強化 Y1H (eY1H) が DNA 餌酵母酵母のコレクションにそれぞれ異なる表現をチームメイトに高密度配列 (HDA の) ロボット プラットフォームを用いたスクリーニングのスループットを大幅に増加TF 獲物10,13 (図 1)。これらの画面は、唯一の 3 つのプレートを使用して 4 連で最も人間 TFs をテストするを許可する 1,536 コロニー形式を採用しています。さらに、TF DNA の相互作用は一対にテスト、ことを考えるこのアプローチ (2 つの非翻訳一塩変形) など DNA 餌とは別の TFs の間の相互作用を比較することができますまたは TF バリエーション11,12。 ,14。

EY1H の試金を使用して、最大の人間と DNA を中心とした TF DNA 相互作用ネットワークに日の線虫を線引きが。特に、246 人間発生エンハンサーと 283 の TFs122,230 相互作用を同定しました。さらに、109 単一のヌクレオチド非コード バリエーション発達奇形、がん、神経疾患などの遺伝病に関連付けられている変更した TF バインディングを明らかにする eY1H のアッセイを採用しました。もっと最近、2,576 c. の elegans遺伝子プロモーターと 366 の TFs1121,714 相互作用で構成されるネットワークを記述する eY1H を使用しました。このネットワークはc. の elegans TFs の数十の機能的役割を明らかにするため尽力しました。

DNA の餌の汚れを生成、バック グラウンド レポーターの活動のレベルを評価するプロトコルがされている15,16,17は別途報告します。ここでは、1,086 人間 TFs の配列に対して任意の人間ゲノム DNA の領域を画面に使用することができます eY1H パイプラインについて述べる。一度酵母 DNA 餌ひずみが生成され、対応するプレートの上に TF 獲物配列を発見、プロトコル全体は 2 週間 (表 1) で実行できます。もっと重要なは、単一の研究者は同時に 60 餌 DNA シーケンスを選別できるようにプロトコルを並列化できます。プロトコルを示すためには、我々 は CCL15 と IL17F の 2 つのサイトカイン遺伝子のプロモーターを上映しました。さらに、eY1H 試金およびそれらの解決方法を実行する場合に発生する可能性のある問題の種類を説明するために失敗した画面からの結果を示す.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 準備

  1. Sc −U アリルメ プレート (150 mm ペトリ皿)
    注:これらのプレートは、DNA 餌酵母菌の成長のために使用されます。
    1. ドロップ アウト ミックス、イースト窒素ベース (YNB)、アデニン hemisulfate 920 mL の水、5.9 (メディアのリットル当たり 1 mL; 構成の表 2を参照してください約) 5 M NaOH で pH のアンモニウムの硫酸塩を溶解します。2 L フラスコに注ぎ、攪拌棒を追加します。
    2. 2 番目の 2 L フラスコで 950 mL の水に寒天を追加 (オートクレーブで沸騰して寒天が発生するので攪拌棒を追加しないでください)。
    3. 液体のサイクルで 15 psi で 40 分間オートクレーブします。
    4. すぐにフラスコを含む寒天培地に攪拌棒を含む最初のフラスコの中身を注ぐ。グルコースを追加撹拌プレートによく混合し、55 ° C の水浴中にクールします。
    5. ロイシンとトリプトファンをメディアに追加します。撹拌プレートによく混ぜ、150 mm 滅菌シャーレ (一皿 〜 80 mL) に注ぐ。室温で 3-5 日間の乾燥、ポリ袋でラップし、常温で 6 ヶ月保存します。
  2. YAPD 長方形プレート
    注:これらのプレートは、DNA 餌ひずみと配列のコレクションに TF と交尾のための芝生の成長のために使用されます。
    1. 粉末 (組成は表 3を参照)、寒天を除いて 2 L フラスコに水 950 mL に溶解し、攪拌棒を追加します。
    2. 2 番目の 2 L フラスコで 950 mL の水に寒天を追加 (オートクレーブで沸騰して寒天が発生するので攪拌棒を追加しないでください)。
    3. 液体のサイクルで 15 psi で 40 分間オートクレーブします。
    4. すぐにフラスコを含む寒天培地に攪拌棒を含む最初のフラスコの中身を注ぐ。
    5. グルコースを追加撹拌プレートと 55 ° C にクール ミックス長方形の板にメディアを注ぐ (材料の表を参照してください; プレートごと 〜 70 mL) 蠕動ポンプ (5 mL/秒) と 6 mm のチューブを使用して。常温で 1 日乾燥、ポリ袋でラップし、6 ヶ月、冷蔵室で保存します。
      注: 推奨メディア ボリュームは、プレートごと 70 mL は、プレートごとの 50-80 mL を使用できます。注いで板の 1 時を考慮する 3 つの重要な問題) 寒天メディア プレート全体で同じ厚さになるよう、平準化する (プレート注ぐため平準化されたテーブルまたはサーフェスを使用して、7 つ以上のプレートのスタックに注がないこと)、2) 寒天中の気泡のないことを保証するメディア (泡をポップする滅菌針を使用して)、および 3) 1 日のみのプレートを乾燥し、酵母を固定での失敗を避けるためにビニール袋にプレートをラップします。
  3. Sc −Trp と Sc −U −Trp 長方形プレート
    注:これらのプレートは、TF 配列コレクション (Sc −Trp) の成長のためと交尾 (Sc −U −Trp) 後の二倍体酵母の選択に使用されます。
    1. ドロップ アウト ミックス、YNB、アデニン hemisulfate、水・ NaOH 5 M (メディアの 1 リットル当たり約 1 mL) で 5.9 pH 920 mL に硫酸アンモニウムを解散 (組成は表 4を参照)。2 L フラスコに注ぎ、攪拌棒を追加します。
    2. 2 番目の 2 L フラスコで 950 mL の水に寒天を追加 (オートクレーブで沸騰して寒天が発生するので攪拌棒を追加しないでください)。
    3. 液体のサイクルで 15 psi で 40 分間オートクレーブします。
    4. すぐにフラスコを含む寒天培地に攪拌棒を含む最初のフラスコの中身を注ぐ。グルコースを追加撹拌プレートによく混合し、55 ° C に冷却
    5. ロイシン、ヒスチジン、およびウラシル (Sc −U −Trp プレートのウラシルの省略) を追加します。
    6. 撹拌プレートによく混ぜ、長方形プレート (プレートごと 〜 70 mL) に注ぐ蠕動ポンプ (5 mL/秒) と 6 mm のチューブを使用しています。室温で 1 日乾燥、ビニール袋でプレートをラップし、3 ヶ月の冷蔵室で保存します。
  4. Sc −U アリルメ −Trp + 3AT + X gal 長方形プレート
    注:    これらのプレートは eY1H の試金のための読み出しプレートとして使用されます。
    1. ドロップ アウト ミックス、YNB、アデニン hemisulfate、850 mL の水に硫酸アンモニウムを解散 (構成の表 5を参照)。PH ではないか。2 L フラスコに注ぎ、攪拌棒を追加します。
    2. 2 番目の 2 L フラスコで 850 mL の水に寒天を追加 (オートクレーブで沸騰して寒天が発生するので攪拌棒を追加しないでください)。
    3. 液体のサイクルで 15 psi で 40 分間オートクレーブします。
    4. 900 mL の水、Na2HPO4∙7H2O の 70 g、34.5 g NaH2PO4∙H2O. ミックス粉末を溶解し、5 M NaOH を使用して 7.0 に pH を合わせなさい攪拌棒を使用してを組み合わせることにより府塩 (1 L) × 10 を準備します。1 L とオートクレーブにもたらすための水を追加します。
    5. 42.5 mL ジメチル ホルムアミドを含む 50 mL プラスチック チューブに X gal パウダー 3.5 g を追加して X gal ソリューションを準備します。簡単に解散するジメチル ホルムアミドに X gal 粉末を追加 (これは 30 分かかります)。(使用不透明な 50 ml のチューブやアルミホイルでカバー) 暗闇の中で原液を維持します。-20 ° C にてストア
    6. すぐにフラスコを含む寒天培地に攪拌棒を含む最初のフラスコの中身を注ぐ。ブドウ糖を追加 BU 塩 (構成の表 5を参照)、x 10 撹拌プレートによくミックス 55 ° C に冷却し、
    7. ロイシン、3AT と X gal (構成の表 5を参照) を追加します。
    8. 撹拌プレートによく混ぜ、長方形プレート (プレートごと 〜 70 mL) に注ぐ蠕動ポンプ (5 mL/秒) と 6 mm のチューブを使用しています。室温で 1 日乾燥ビニール袋、ラップやアルミホイルで覆われた冷蔵室で保存 (3AT と X gal が光に敏感) まで 1 ヶ月。

2. TF 配列のスポッティング

  1. TF 獲物配列を融解
    1. 雪解けの氷に TF 獲物配列を持つ酵母グリセロール ストック プレート。
      注:以前に発行された10,12,13,18として TF 獲物配列を生成できます。
    2. 次のステップの前に 1-3 分以内で 12 チャンネル ピペットを使用して酵母を再懸濁します。
  2. 長方形板の Sc −Trp に酵母をスポッティング
    1. HDA ロボット (材料の表を参照)、選択 96 ウェルプレート ソース、ターゲット、および 96 長期ピンパッドと 96 の寒天。
      注:Pin パッドは、再利用可能なない、破棄する必要があります。
    2. 96 ウェル プレートあたりの 2 つのコピーを作成する多くの複製プログラムを選択します。ごみ箱を使用しない、またはフリーズされた在庫のバックの汚染を避けるためにオプションを再訪します。
    3. 酵母を混ぜてソースに、上下に旋回するためのオプションを選択します。
    4. 斑点を付けられた配列をバッグし、インキュベート寒天側を 30 ° C で 2-3 日。
  3. Sc −Trp 長方形板で 384 のコロニーの配列を生成します。
    1. ロボットのソース、ターゲットとして寒天培地 384 と 96 の短い pin パッドとして 96 寒天を選択します。
    2. 1:4 配列のプログラムを選択します。この方法で (別の TF をそれぞれ含む) 4 96 コロニー プレートは 1 384 植民地板に統合されます。ごみ箱を使用しない、または異なるプレートの間の汚染を防止するためのオプションを再訪します。
    3. バッグ プレートとインキュベートする斑点を付けられた 384 コロニー アレイ寒天側を 30 ° C で 2 日間。
  4. Sc −Trp 長方形板で 1,536 コロニーの配列を生成します。
    注:これは各 TF 獲物の 4 つの植民地を含む配列になります。
    1. ロボットのソース、ターゲットとして 1,536 寒天 384 短い pin パッドと 384 寒天を選択します。
    2. 1:4 の試金の単一のソース プログラムを選択します。目標は、quadruplicates を取得する 4 つのコロニーに各コロニーをコピーします。ごみ箱を使用し、4 回各植民地のコピーを行うとオプションを再訪します。
    3. バッグ プレートとインキュベートする斑点を付けられた 1536 コロニー アレイ寒天側を 30 ° C で 3 日間。
  5. Sc −Trp 長方形板で 1,536 コロニー配列を増幅
    1. ロボットのソース、ターゲットとして 1,536 寒天、1,536 短い pin パッドとして 1,536 寒天を選択します。
    2. 3-4 のコピーを複製する複製の多くのプログラムを選択します。ごみ箱を使用してオプションを再訪、交差汚染を避けるために配列の異なるプレートへの切り替え時にパッドを捨てます。
    3. バッグ プレートと手順 (下記参照) を交配に使用する 3 日間の 30 ° c を斑点を付けられた 1536 コロニー アレイ寒天側を孵化させなさい。その後、スクリーニングの新しいラウンドの 7 日後に再び常温、コピー版を維持します。

3. eY1H 画面

  1. 交配のため DNA 餌ひずみの芝生を準備します。
    1. Sc −U アリルメ プレートに DNA 餌株酵母を発見し、30 ° C で 3 日間の成長
    2. 各プレートは、12-16 異なる系統を収まるように、生殖不能のつまようじを使用して Sc −U アリルメ プレート 15 cm に酵母を連勝します。1 日 30 ° c. で孵化させなさい
    3. 各プレートは、4 の異なる系統を収まるように、生殖不能のつまようじを使用して Sc −U アリルメ プレート 15 cm に酵母を連勝します。30 ° C で 1 日間インキュベートします。
    4. ない任意の寒天をこすりし、1.5 管 500 μ L の滅菌水に追加に確かめる生殖不能のつまようじを使用して酵母をこすり。
    5. YAPD 長方形板に 10-15 滅菌ガラス ビーズを追加します。プレートの上に酵母液を追加し、徹底的に酵母をすべてのプレートを介して広がるように 1 分のすべての方向に振る。
    6. すぐに板を反転し、ビーズが蓋に行くようにするをタップします。削除し、ビーズをリサイクルします。
    7. プレートの袋し、30 ° C で 1-2 日間ダウン寒天側をインキュベート交配の手順に進みます。
  2. 酵母 DNA 餌と TF 配列の系統の交配
    1. YAPD 長方形プレートにロボットと TF の配列を転送します。ソースとターゲット、1,536 短い pin パッドと 1,536 寒天プレートを選択します。多くの複製プログラムを選択します。配列にある各 TF のプレートは、(配列の枚数) に応じて 3-4 YAPD プレートに転送する使用できます。交配用 TF 配列板は生後 2-3 日をする必要がありますが、もっと交配としては効率的かもしれません。
    2. DNA の餌ひずみの芝生をすでにロボットと TF 配列を含む YAPD プレートに転送します。ソースとターゲット、1,536 短い pin パッドと 1,536 寒天プレートを選択します。多くの複製プログラムを選択します。~0.6 mm の半径を持つソースにランダムなオフセットを使用して、同じ場所から酵母の服用を避けるし、酵母菌との間の接触を容易にターゲット上でミックスします。ソースとターゲットとして 3.2.1 のステップで発見 TF 配列を含む YAPD プレートとして DNA 餌系統 (セクション 3.1) を含む芝生を使用します。
    3. バッグ プレートとインキュベート寒天側を 30 ° C で 1 日。
  3. 二倍体酵母の選択
    1. YAPD プレートから嵌合酵母を転送すると、ロボットと Sc −U −Trp プレート。ソースとターゲット、1,536 短い pin パッドと 1,536 寒天プレートを選択します。複製プログラムを選択します。ソースとターゲットをミックスします。
    2. バッグ プレートとインキュベート寒天側を 30 ° C で 2-3 日 (長い潜伏は高いバック グラウンド レポーターの活動につながる)。
  4. 転送読み出しプレート
    1. Sc −U −Trp プレートから読み出し長方形板 Sc −U アリルメ −Trp + 5 mM 3AT 0.4 mM X gal のロボットを使用してに二倍体酵母を転送します。ソースとターゲット、1,536 短い pin パッドと 1,536 寒天を選択します。複製プログラムを選択します。
    2. バッグ プレートとインキュベート寒天側を 30 ° C で 7 日前まで。
  5. 読み出しプレートのイメージング
    1. DNA の餌の高いバック グラウンド レポーターの活動と、2、3、および 4 の日に写真を撮る。そうしないと、4 と 7 日間で写真を撮る。肯定的な相互作用イースト コロニーの成長とブルーの色によって識別され、手動で決定することができます。 またはイメージ解析ソフトウェアを使用して決定できます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EY1H 試金から結果の分析と 3 つの主な要因を考慮すべき: DNA 餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動、TF DNA の相互作用、および肯定的なコロニーの数に対応するレポーターの活動の強さ。DNA の餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動 (すなわち、autoactivity) は、全体的な成長と TF 獲物がない場合でも、読み出しプレートの酵母コロニーの色を指します。理想的には、非 autoactive 系統表示背景白または茶色色、肯定的な相互作用のための植民地とされている大きくて青い。Autoactive DNA 餌系統はヒスチジンと X gal の存在下で DNA 餌8酵母転写活性化因子の結合に関連している可能性が高い板のすべてのコロニーのための青の色に欠けているメディアで酵母の増殖を示します。検出された TF DNA の相互作用に対応する記者活動 (すなわち、コロニーのサイズ) と青色の強度の強度親和性、酵母で TF の発現レベル、サイトとの距離をバインドの数などの多くのパラメーターに依存します。ある酵母の最小プロモーター レポーター遺伝子と DNA 餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動の上流。たとえば、弱い相互作用は低バック グラウンドの餌で簡単に検出がありますが、autoactive の背景ムラ餌を検出することは困難があります。重要なは、そのレポーターの活動に注意する酵母のレベルは必ずしも相関がないクロマチン構造とひと細胞の規制活動とヌクレオソームの配置、および距離のエフェクトが異なる酵母と人間がいます。さらに、人間の相互作用は他の TFs と補因子の結合によって影響を受ける可能性が高いまたは機能的冗長 TFs8によってマスク可能性があります。最後に、相互作用は、バック グラウンド レベルを超える記者式を表示 4 つの植民地の少なくとも 2 つ、eY1H の試金で正と見なされます。しかし、我々 は相互作用の ~ 90% 識別いる肯定的な10,12,19TF に対応するすべての 4 つのコロニーからの結果であることを観察しました。

EY1H の試金を使用して得ることができる結果の種類を説明するために我々 は 1,086 人間 TFs (図 2) の配列に対して、CCL15 と IL17F 遺伝子のプロモーター領域 (転写開始点の上流 2 kb) を上映しました。CCL15 プロモーターは例の相互作用がも非 autoactive DNA 餌の弱いものを簡単にすることができます (図 2 a) を検出します。IL17F プロモーターは、複数の TFs のだがあるレポーターの活動が背景 (図 2 b) よりも高いかどうかいくつかの相互作用を検出できる背景ムラ記者活動と、autoactive DNA 餌の例です。

EY1H 試金を実行するときに発生する可能性のある問題

ただし、スクリーニング eY1H プロトコル、まっすぐ進むと堅牢な画面中にいくつかの問題が発生することができます。

1) 植民地が小さすぎると (図 3 a) の転送に失敗する: 通常 TF 獲物コロニーの ~ 95% 表示通常酵母遺伝子の発現が調節不全かもしれないことを考えるに、外因性 TFs を表現するいくつかの酵母が低成長を表示ことがあります、予想されていますが、成長。植民地の 10% 以上が成長する場合は、最も頻繁な原因はメディアや酵母の転送の問題です。最適成長の多く新鮮な在庫ソリューションと新鮮なメディアを準備することによって解決することができます (例えば、ウラシル、ヒスチジン、またはロイシン) 活動を失うメディア コンポーネントの 1 つに関連です。また、これはまたコロニーの転送に影響を与える固定オフセットに関連する可能性があります。この場合、ソース プレートの酵母コロニーの中心を 1,536 のパッドにピンを確認します。

プレート (図 3 b) の部分に 2) の酵母の成長: 1,536 pin パッドに失敗した場合、この問題は交尾のステップで障害が発生して関連一般的に酵母 DNA 餌ひずみ芝生、TF 配列または相手の板との接触。ほぼすべてのケースでこれが注ぐプレート中に不均一な寒天メディア レベル又は過度により乾燥プレートの。

3) は、(図 3およびD) 相互作用は検出された: 特定 LacZ (図 3) で、レポーター遺伝子のどちらかの意図しない不活性変異またはマスクの相互作用 (図高 autoactivity、この問題はしばしば関連3 D). この問題をトラブルシューティングする、同じ DNA 餌に対応する別の独立に与えられたひずみの画面をお勧めします。

4) プレート プレゼント ランダムに青点 (図 3E): この問題細菌汚染に関連する多くの場合。この問題を解決するために個々 のコロニーを得るには、酵母を連勝し、画面を繰り返します。

上記 eY1H の試金を実行するとき最も頻繁に問題であります。他の問題が発生する必要があります、新しいメディアの準備、HDA ロボットに対する適切な設定を用いて、DNA 餌あたり複数系統をテストしても、ほとんどの問題は解決だろう可能性が高いことを確認します。

Figure 1
図 1: EY1H 分析画面の概要。(A) 蛋白質 DNA の相互作用を識別するために TF 中心と DNA の方法比較(B) eY1H 試金の概略図。上流の (プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等) の興味の DNA シーケンスをクローン作成 HIS3 と LacZ レポーターの遺伝子は酵母ゲノムに統合されています。結果として得られる DNA 餌ひずみ Gal4 活性化ドメイン (AD) 融合した TFs をかくまっている酵母のコレクションに合致しています。肯定的な相互作用は 3 AT、ヒスチジンと競合阻害を克服せずに成長する酵母の機能によって決定され、X gal の存在下で青色に変わります。(C) eY1H 画面のパイプライン。酵母 DNA 餌ひずみ YAPD プレートで栽培の芝生 TFs Sc −Trp プレート上に成長した AD に融合を表現する 1,536 コロニー配列に YAPD プレートに合致しています。1 日後、酵母は、二倍体酵母の選択する Sc −U −Trp に転送されます。2-3 日培養後、酵母は Sc −U アリルメ −Trp + 3AT 蛋白質 DNA の相互作用を識別するために X ギャル板 (読み出し板) に転送されます。各相互作用は、4 連でテストされます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: EY1H 読み出しプレートの例。(A) 相互作用 CCL15、非 autoactive 餌のプロモーターを含みます。この餌のバック グラウンド レポーターの活動が低い (TFs の非相互作用のヒスチジンと青い色の不在の不在の成長減少)。(B) 相互作用 IL17F、autoactive 餌のプロモーターを含みます。この餌のバック グラウンド レポーターの活動が高い (ヒスチジンと背景の不在の成長青プレートを通して色) および不均等なそれに蛋白質 DNA の相互作用を識別するために挑戦します。強い、中、弱い相互作用が乗の赤く、オレンジ、および黄色、それぞれ。相互作用する TFs の HGNC の名前が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: EY1H 画面の問題。(A) TF-犠牲配列複数のコロニーが成長できませんでした。(B) 読み出しプレート、左下隅の植民地を転送に失敗しています。(C) 肯定的な相互作用を表示しない非 autoactive DNA 餌ひずみ。(D) 肯定的な相互作用は表示されません autoactive DNA 餌ひずみ高。(E) 汚染による複数の青いコロニーを表示するリードアウト プレート。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

TF 配列をスポッティング
日 1 96 コロニー形式 (2.1と2.2) で Sc-Trp プレートに酵母をスポットします。
日 4 384 コロニー TF 配列 (2.3) を生成します。
日 6 1,536 コロニー TF 配列 (2.4) を生成します。
日 9 1,536 コロニー TF 配列 (2.5) を増幅します。
交配のため DNA 餌ひずみの芝生を準備します。
日 6 スポット酵母 DNA 餌系統 (3.1.1)
日 9 ストリーク酵母、プレート (3.1.2) ごと 12-16 系統
日 10 ストリーク酵母、プレート (3.1.3) あたり 4 株
日 11 DNA の餌芝生 (3.1.4と3.1.5) を準備します。
酵母 DNA 餌と TF 配列の系統の交配
日 12 YAPD プレート (3.2) で交尾
二倍体酵母の選択
日 13 Sc-U-Trp プレート (3.3) の二倍体酵母の選択
転送読み出しプレート
日 15 転送二倍体酵母の読み出しプレート (3.4)
読み出しプレートのイメージング
17-22 日 背景 (3.5) に応じて読み出し板の画像集録

表 1: TFF の配列。

試薬 (2 L) の数量
ドロップ アウト ミックス マイナスのヒスチジン、ロイシン、トリプトファンとウラシル、アデニン、豊富な合成 (2 g) 酵母窒素ベースなし 2.6 g
酵母窒素ベースのアミノ酸とアンモニウムの硫酸塩 (YNB) なし 3.4 g
アデニン hemisulfate 二水和物 160 mg
アンモニウムの硫酸塩 10 g
寒天培地 35 g
滅菌水にブドウ糖 40% (w/v) 100 mL
ロイシン (100 mM)、滅菌フィルター 16 mL
トリプトファン (40 mM)、滅菌フィルター 16 mL

表 2: 試薬リストします。

試薬 (2 L) の数量
ペプトン 40 g
酵母エキス 20 g
アデニン hemisulfate 二水和物 0.32 g
滅菌水にブドウ糖 40% (w/v) 100 mL
寒天培地 35 g

テーブル 3:試薬リスト II.

試薬 (2 L) の数量
ドロップ アウト ミックス ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、ウラシル、アデニン リッチ (2 g) 酵母窒素ベース w/o マイナス合成 2.6 g
酵母窒素ベースのアミノ酸とアンモニウムの硫酸塩 (YNB) なし 3.4 g
アデニン hemisulfate 二水和物 160 mg
アンモニウムの硫酸塩 10 g
寒天培地 35 g
滅菌水にブドウ糖 40% (w/v) 100 mL
ロイシン (100 mM)、滅菌フィルター 16 mL
ヒスチジン (100 mM)、滅菌フィルター 16 mL
ウラシル (20 mM)、滅菌フィルター (Sc – U – Trp 板の省略) 16 mL

表 4:試薬リスト III.

試薬 (2 L) の数量
ドロップ アウト ミックス ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、ウラシル、アデニン リッチ (2 g) 酵母窒素ベース w/o マイナス合成 2.6 g
酵母窒素ベースのアミノ酸とアンモニウムの硫酸塩 (YNB) なし 3.4 g
アデニン hemisulfate 二水和物 160 mg
アンモニウムの硫酸塩 10 g
寒天培地 35 g
滅菌水にブドウ糖 40% (w/v) 100 mL
BU 塩 × 10 200 mL
ロイシン (100 mM)、滅菌フィルター 16 mL
3AT (2 M)、滅菌フィルター 5 mL
DMF の X-ガロン (80 mg/mL) 4 mL

表 5:試薬リスト IV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ここで大きく説明ロボット eY1H 交尾スクリーニング アプローチは、以前のライブラリ スクリーニングと比較して興味や変換に基づく配列スクリーニング アプローチの DNA 領域にバインド TFs のセットを識別するためにスループットを向上します。アッセイは、TF ごとにテストしたすべての 4 つの植民地のために積極的、相互作用の 90% は同じ酵母 DNA 餌ひずみ10の独立した画面で再テストの相互作用の 90% が検出された再現性の高い eY1H によって検出された TF DNA 相互作用さらに、,12,19しますさらに重要なのは、eY1H によって検出された TF DNA の相互作用は人間レポーターの試金12,20、ひと初代細胞 (未発表結果)、およびc. の elegansノックアウト動物をテストしたときの 40-70% 率で検証。11. チップ seq データ21の観察された同じような検証率です。

同じ酵母 DNA 餌ひずみを再テストするとき eY1H で識別される相互作用が再現性が高い、同じ異なる酵母菌株をテスト DNA 餌と、ときどき異なる、重複、TF DNA の相互作用のセットが。これは通常バック グラウンド レポーターの活動の違いから系統です。さらに、重複フラグメントをテストするときに特に完全な系列をテストよりもより多くの TF DNA 相互作用の検出の結果、dna の断片をテストします。これは、記者の最小プロモーターに近い相互作用を識別するのに効率分析と関連しているかもしれないし、フラグメントが結合部位とされる可能性を低減テストして重なっているので酵母ヌクレオソームでふさがれます。したがって、小規模なプロジェクトのお勧めその重なり合う 0.5-1 kb フラグメントを規制地域がテストされ、2 つの独立した系統が各 DNA 餌シーケンス8のスクリーニングは。

図 3に示すような問題のいくつかを避けるためにプロトコルをスクリーニング、eY1H でいくつかの重要な手順があります。まず、ほとんどの媒体成分安定 (3AT と X gal) を除く数カ月、適切なコロニー成長可能性の欠如を示すことが成分の少なくとも 1 つが活性を失っている可能性があり、置き換える必要があります。第二に、寒天を平準化、ので、彼らはロボットのプラットフォームを使用する場合の固定で失敗しないために 1 日以上の乾燥しないでください、長方形の板を準備することが重要です。最後に、それは効率的であることと酵母クローン間のクロス汚染を避けるために交配のために効果的に、転送する酵母のプロトコル (再訪、リサイクル、ミキシング、等) に記載されているロボットプラット フォーム プログラムを使用するキーです。

EY1H 画面の使い方を説明するよう選択した例は、人間の遺伝子のプロモーターに対応します。ただし、その他の規定する領域もテストできますエンハンサー、サイレンサーなど。たとえば、人間の発生エンハンサー、線虫最初イントロン12,22TF バインディングを評価する eY1H の試金を使いました。さらに、相互作用は一対にテストが、ことを考える eY1H の試金は非コーディングの亜種と TF コーディング シーケンス バリアント間の相互作用を比較する使用できます。たとえば、TF 109 非コード バリエーション別の遺伝病とも 58 TF ミスセンス変異12,14の差分の相互作用プロファイルに関連付けられているバインディングを変更我々 が識別される eY1H の試金を使用しています。このプロトコルは、人間の規定する領域に TF バインディングの評価に焦点を当て、他の種からの DNA 領域もテストできますされる TF 獲物が使用または生成することができます。確かに、TF 獲物配列生成されているシロイヌナズナ25,26,ハツカネズミ24,キイロショウジョウバエ23 c. の elegans10とトウモロコシ27します。 したがって、ますます利用可能なリソース、に、eY1H の試金を追加システムに適用する可能性があります。

EY1H 試金は人間および他の種で異なる規制領域にバインド TFs のレパートリーを識別するために尽力している、注意事項8,11,12,19 の無料ではありません。、20,25。制限の 1 つはイースト菌核の環境の相互作用をテストし、酵母におけるクロマチン構造が DNA 餌の発祥から種のクロマチン構造を表さない場合があります DNA 餌は chromatinized が、体内観察セル型の相違を反映しません。したがって、eY1H の試金によって識別される相互作用は、記者や他の機能の試金の検証をする必要があります。注、我々、および他の機能アッセイ11,12,20,2340-70% のレートで eY1H によって検出された TF DNA の相互作用を検証するを発見しました。EY1H 試金のもう一つの制限は、DNA、酵母、AD に融合したときに正しく折り返されていない TFs および配列から欠落している TFs にバインドする酵母の存在しないポスト翻訳の修正を必要とする TFs の相互作用を検出できません。8します。 さらに、現在の形式で eY1H の試金を検出しない、TFs のヘテロ二量体の相互作用 TF 配列の各酵母コロニー表現単一 TF-犠牲。したがって、さらには、アッセイの改善でテストすることができます、新しい TF DNA の相互作用を識別するために eY1H の試金の機能を拡張を TFs の範囲を広げます

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

この作品は、健康の国民の協会 [J.I.F.B. に R35-GM128625] によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Tags

遺伝学、問題 144 イースト 1 ハイブリッド、Y1H、トランスクリプション要因、人間、遺伝子 DNA、規制 eY1H
人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter