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Genetics

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen eine erweiterte Hefe One-Hybrid screening Protokoll um den Transkriptionsfaktoren (TFs) zu identifizieren, die an einer menschlichen DNA-Region of Interest binden können. Diese Methode nutzt eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die die Bindung von Verhören kann > 1.000 TFs in einem einzigen Experiment.

Abstract

Die Sätze von Transkriptionsfaktoren (TFs), die jedem menschlichen Gens regulieren zu identifizieren, ist eine schwierige Aufgabe, die erfordert zahlreiche experimentelle und rechnerische Ansätze zu integrieren. Eine solche Methode ist die Hefe ein-Hybrid (Y1H) Assay, in welche, die Wechselwirkungen zwischen TFs und DNA-Regionen im Milieu der Nucleus Hefe mit Reporter-Gene getestet werden. Y1H-Assays umfassen zwei Komponenten: als "DNA-Köder" (z.B.., Promotoren, Enhancer, Schalldämpfer, etc.) und eine "TF-Beute," die auf Reporter Genaktivierung untersucht werden kann. Die meisten veröffentlichten Protokolle für die Durchführung von Y1H-Bildschirme basieren auf TF-Beute Bibliotheken oder Arrays in DNA-Köder Hefestämme zu verwandeln. Hier beschreiben wir eine Pipeline, verbesserte Y1H genannt (eY1H) Tests, wo TF-DNA-Wechselwirkungen verhört werden, bei der Paarung DNA-Köder-Stämme mit einer angeordneten Sammlung von TF-Beute Stämme mit einem high-Density-Array (HDA) Roboter-Plattform, mit der Vorführung in einem 1.536 Kolonie-Format. Dies ermöglicht eine drastische Zunahme der Durchsatz (60 DNA-Köder-Sequenzen gegen > 1.000 TFs dauert zwei Wochen pro Forscher) und Reproduzierbarkeit. Wir illustrieren die verschiedenen Arten von erwarteten Ergebnissen von Tests menschlichen Promotorsequenzen gegen eine Reihe von 1.086 menschlichen TFs, sowie Beispiele für Probleme, die während der Bildschirme und wie man sie beheben können.

Introduction

Ein zentrales Problem im Bereich Biomedizin ist die Mechanismen Bestimmung jedes menschliche gen geregelt. Transkription ist der erste Schritt bei der Kontrolle der gen-Expression-Ebenen, und es wird durch Sätze von Transkriptionsfaktoren (TFs), die einzigartig für jedes Gen reguliert. Angesichts der Tatsache, dass Menschen für kodieren > 1.500 TFs1,2, Ermittlung des vollständigen Satzes von TFs, die der Tätigkeit des einzelnen Gens Steuern bleibt eine offene Herausforderung.

Zwei Arten von Methoden können verwendet werden, um TF-DNA-Wechselwirkungen Karte: TF-zentriert und DNA-zentrierten Methoden3 (Abbildung 1A). In TF-zentrierten Methoden ist eine TF von Interesse für die Bindung genomische DNA-Regionen oder seine DNA-Bindung Spezifität zu ermitteln sondiert. Diese Methoden umfassen Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung, Protein Bindung Microarrays und SELEX4,5,6. In DNA-zentrierten Methoden ist eine DNA-Sequenz des Interesses sondiert, um den Satz von TFs zu bestimmen, die an der DNA-Sequenz binden. Die am häufigsten angewandte solcher Methoden ist Hefe One-Hybrid (Y1H) Tests, in denen, die Interaktionen zwischen TFs und DNA-Regionen im Milieu der Nucleus Hefe mit Reporter Gene7,8,9getestet werden.

Y1H-Assays umfassen zwei Komponenten: als "DNA-Köder" (z.B., Promotoren, Enhancer, Schalldämpfer, etc.) und eine "TF-Beute," die Reporter-Gen Aktivierung9,10 (Abbildung 1 b) gezeigt werden kann. Der DNA-Köder wird geklont, stromaufwärts von zwei Reporter Gene (LacZ und HIS3) und beide DNA-bait::reporter-Konstrukte sind integriert Hefegenoms generieren chromatinized "DNA-Köder Stämme." Die TF-Beute, codiert in ein Plasmid, das einen TF verschmolzen mit der Aktivierungsdomäne (AD) der Hefe Gal4 TF ausdrückt wird in die DNA-Köder Sorte Fisch für TF-DNA-Wechselwirkungen eingeführt. Wenn die TF-Beute an die DNA-Köder-Sequenz bindet, wird die Anzeige in der TF-Beute vorhanden zur Aktivierung der beiden Reporter-Gene führen. Infolgedessen, können Zellen mit einem positiven Interaktion für Wachstum auf Tellern Histidin fehlt, als auch als kompetitiver Inhibitor, 3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT) die Überwindung ausgewählt und als blauen Kolonien im Beisein von X-gal visualisiert werden. Weil die potente Hefe Gal4 AD dient, Y1H Assays können Interaktionen mit transcriptional Aktivatoren sowie Repressoren erkennen. Darüber hinaus angesichts der Tatsache, dass TF-Beute aus einem starken Hefe-Promotor (ADH1) ausgedrückt werden, können Wechselwirkungen auch für TFs erkannt werden, die geringe endogene Expression Ebenen, die herausfordern, um von ChIP11,12zu erkennen.

Die meisten veröffentlichten Protokolle für die Durchführung von Y1H Assays basieren auf DNA-Köder Hefestämme TF-Beute einzuführen, durch die Umwandlung von gepoolter TF-Beute-Bibliotheken, gefolgt von Auswahl, Kolonie, die Kommissionierung und Sequenzierung den interagierenden TF identifizieren, oder durch Umwandlung einzelner klont8,9. Dies sind zeitraubende Protokolle, Beschränkung der Anzahl von DNA-Sequenzen, die pro Forscher getestet werden können. Eine jüngste Verbesserung der Y1H-Assays, genannt verstärkt Y1H (eY1H), die Screening-Durchsatz mit einer high-Density Arrays (HDA) Roboterplattform Hefestämme DNA-Köder mit einer Sammlung von Hefestämme jeweils mit dem Ausdruck einer anderen Paaren sprunghaft angestiegen TF-Beute10,13 (Abbildung 1). Diese Bildschirme beschäftigen ein 1.536 Kolonie Format erlaubt, die meisten menschlichen TFs in vervierfacht mit nur drei Platten zu testen. Weiter, angesichts der Tatsache, dass TF-DNA-Wechselwirkungen in gewissem Sinne paarweise getestet werden, ermöglicht dieser Ansatz für den Vergleich von Interaktionen zwischen DNA-Köder (z. B. zwei forensisches Einzel-Nukleotid-Varianten) und zwischen verschiedenen TFs oder TF Varianten11,12 ,14.

Mit eY1H-Assays, haben wir den größten menschlichen und Caenorhabditis Elegans DNA-zentrierten TF-DNA-Wechselwirkungen Netzwerke bis dato abgegrenzt. Insbesondere haben wir 2.230 Interaktionen zwischen 246 menschlichen Entwicklungs-Enhancer und 283 TFs12gekennzeichnet. Darüber hinaus haben wir eY1H Assays aufzudecken veränderten TF Bindung an 109 Einzel-Nukleotid forensisches Varianten zugeordnet Erbkrankheiten wie Entwicklungsstörungen Fehlbildungen, Krebs und neurologische Erkrankungen eingesetzt. Vor kurzem haben wir eY1H ein Netzwerk bestehend aus 21.714 Interaktionen zwischen 2.576 C. Elegans gen Promotoren und 366 TFs11abzugrenzen. Dieses Netzwerk wurde die funktionale Rolle der Dutzende von C. Elegans TFs aufzudecken.

Die Protokolle zum DNA-Köder Flecken zu generieren und die Ebenen der Reporter Hintergrundaktivitäten zu bewerten gewesen berichtet an anderer Stelle15,16,17. Hier beschreiben wir eine eY1H-Pipeline, die verwendet werden kann, menschlichen genomische DNA-Region gegen eine Reihe von 1.086 menschlichen TFs auf den Bildschirm. Sobald eine Hefe DNA-Köder Belastung entsteht und eine TF-Beute-Array wird auf die entsprechenden Platten entdeckt, kann das gesamte Protokoll innerhalb von zwei Wochen (Tabelle 1) durchgeführt werden. Noch wichtiger ist, kann das Protokoll parallelisiert werden, so dass ein einzelner Forscher 60 DNA-Köder-Sequenzen gleichzeitig Bildschirm kann. Um das Protokoll zu demonstrieren, haben wir die Veranstalter der beiden Zytokin-Gene CCL15 und IL17F überprüft. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse aus gescheiterten Bildschirme zu veranschaulichen die Arten von Problemen, die auftreten können, bei der eY1H-Assays und wie sie zu beheben.

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Protocol

1. Vorbereitungen

  1. SC −U −H Platten (150 mm Petrischalen)
    Hinweis: Diese Platten werden für den Anbau von DNA-Köder-Hefestämme verwendet werden.
    1. Auflösen der Drop-out-Mix, Hefe-Stickstoff-Basis (YNB), Adenin Hemisulfate und Ammoniumsulfat in 920 mL Wasser und pH 5.9 mit 5 M NaOH (ca. 1 mL pro Liter Medien; siehe Tabelle 2 für Komposition). Gießen Sie in eine 2 L Flasche und fügen Sie eine Stir Bar.
    2. In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 950 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).
    3. Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.
    4. Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar. Fügen Sie die Glukose, auch auf einem Teller rühren mischen und auf 55 ° C im Wasserbad abkühlen lassen.
    5. Fügen Sie das Leucin und Tryptophan zu den Medien. Gut auf einem Teller rühren mischen Sie und gießen Sie in sterile Petrischalen 150 mm (~ 80 mL pro Teller). Für 3 – 5 Tage bei Raumtemperatur, trocken in Plastiktüten wickeln und für bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur lagern.
  2. YAPD rechteckigen Platten
    Hinweis: Diese Platten werden für den Anbau des Rasens für die DNA-Köder-Belastung und für die Paarung mit der TF-Array-Kollektion verwendet.
    1. Pulver (siehe Tabelle 3 für Komposition), mit Ausnahme von Agar, in 950 mL Wasser in eine 2 L Flasche auflösen und eine Bar unter Rühren hinzufügen.
    2. In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 950 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).
    3. Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.
    4. Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar.
    5. Fügen Sie die Glukose Mischung gut auf einen rühren Teller und Cool bis 55 ° C. Gießen Sie Medien in die rechteckigen Platten (siehe Tabelle der Materialien; ~ 70 mL pro Teller) mit einer peristaltischen Pumpe (5 mL/sec) und einen 6 mm Schlauch. Für 1 Tag bei Zimmertemperatur trocken in Plastiktüten wickeln und in den kalten Raum für bis zu 6 Monate zu speichern.
      Hinweis: Obwohl die vorgeschlagenen Medienlautstärke 70 mL pro Platte ist, kann 50-80 mL pro Platte verwendet werden. Die drei kritische Punkte zu beachten, wann Gießen Platten 1 sind), dass sie abgeglichen werden, so dass die Agar-Medien die gleiche Dicke in der Platte hat (ein flacher Tisch oder eine Oberfläche für Teller gießen und nicht im Stapel von mehr als sieben Platten Gießen) 2) Sicherstellung der Abwesenheit von Luftblasen im Agar Medien (Bläschen sollte sein tauchte mit einer sterilen Nadel) und 3) die Platten nur für einen Tag trocknen und verpacken die Platten in Plastiktüten zur Fehlervermeidung in Hefe anheften.
  3. SC −Trp und Sc −U −Trp rechteckigen Platten
    Hinweis: Diese Platten werden für den Anbau der TF-Array-Sammlung (Sc −Trp) und diploiden Hefe wählen nach der Paarung (Sc −U −Trp) verwendet werden.
    1. Auflösen der Drop-out-Mix, YNB, Adenin Hemisulfate und Ammoniumsulfat in 920 mL Wasser und pH 5.9 mit NaOH 5M (ca. 1 mL pro Liter Medien) (Zusammensetzung siehe Tabelle 4 ). Gießen Sie in eine 2 L Flasche und fügen Sie eine Stir Bar.
    2. In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 950 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).
    3. Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.
    4. Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar. Fügen Sie die Glukose, mischen und auf einem Teller rühren und kühlen bis 55 ° C.
    5. Fügen Sie das Leucin, Histidin und Uracil (weglassen der Uracil für den Sc −U −Trp Platten).
    6. Auch auf einem Teller rühren mischen und gießen Sie in rechteckigen Platten (~ 70 mL pro Teller) mit einer peristaltischen Pumpe (5 mL/sec) und 6 mm Schlauch. Für 1 Tag bei Raumtemperatur trocknen, die Platten in Plastiktüten wickeln und in den kalten Raum für bis zu 3 Monaten zu speichern.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal rechteckigen Platten
    Hinweis:     diese Platten dienen als Anzeige Platten eY1H Assays.
    1. Die Drop-out-Mix, YNB, Adenin Hemisulfate und Ammoniumsulfat in 850 mL Wasser auflösen (Zusammensetzung siehe Tabelle 5 ). Tun Sie nicht pH. Gießen Sie in eine 2 L Flasche und fügen Sie eine Stir Bar.
    2. In einem zweiten 2 L Kolben Agar zu 850 mL Wasser hinzufügen (fügen Sie eine Stir Bar Agar in den Autoklaven Überkochen führen wird).
    3. Autoklaven für 40 min bei 15 Psi auf einem flüssigen Zyklus.
    4. Bereiten Sie 10 x BU Salze (1L vor) durch die Kombination von 900 mL Wasser, 70 g Na2HPO4∙7H2O und 34,5 g NaH2PO4∙H2O. Mix mit einer Rühren auflösen Pulver und passen den pH-Wert auf 7,0 mit 5 M NaOH. Fügen Sie Wasser, 1 L und Autoklaven zu bringen.
    5. Bereiten Sie die X-gal-Lösung durch eine 50 mL-Kunststoff-Rohr mit 42,5 mL Dimethyl Formamid 3,5 g X-gal-Pulver hinzufügen. Dimethyl Formamid, leichter aufzulösen X-gal-Pulver hinzufügen (Dies dauert 30 min). Halten Sie Stammlösung in der Dunkelheit (Verwendung opak 50 ml-Tube oder Abdeckung in Folie). Shop bei-20 ° C.
    6. Gießen Sie sofort den Inhalt der ersten Flasche, einschließlich der Stir Bar in die Küvette mit Agar. Fügen Sie die Glukose und 10 x BU Salze (siehe Tabelle 5 für Komposition), mischen und auf einem Teller rühren und kühlen bis 55 ° C.
    7. Fügen Sie das Leucin, 3AT und X-gal (Zusammensetzung siehe Tabelle 5 ).
    8. Nun auf einem Teller rühren mischen und gießen Sie die rechteckigen Platten (~ 70 mL pro Teller) mit einer peristaltischen Pumpe (5 mL/sec) und einen 6 mm Schlauch. Für 1 Tag bei Zimmertemperatur trocken in Plastiktüten wickeln, und speichern Sie in den kalten Raum in Alu-Folie abgedeckt (3AT und X-gal sind lichtempfindlich) für bis zu 1 Monat.

(2) Schmierblutungen ein TF-array

  1. Auftauen der TF-Beute-array
    1. Die Hefe Glycerin Lager Platten mit dem TF-Beute-Array auf Eis auftauen.
      Hinweis: TF-Beute-Arrays können als zuvor veröffentlichten10,12,13,18generiert werden.
    2. Aufzuwirbeln Sie die Hefe mit einer 12-Kanal-Pipette innerhalb von 1 – 3 min. vor dem nächsten Schritt.
  2. Entdecken die Hefe in Sc −Trp rechteckige Platten
    1. Im HDA-Roboter (siehe Tabelle der Materialien), wählen Sie Multi-well-96-Platten als Quelle, 96 Agarplatten als Ziel und 96 lange Pin-Pads.
      Hinweis: PIN-Pads sind nicht wiederverwendbar und müssen verworfen werden.
    2. Wählen Sie das Replizieren viele Programm, zwei Kopien pro 96-Well-Platte zu machen. Verwenden Sie den Papierkorb nicht oder überdenken Sie Optionen zur Vermeidung von hinteren Kontaminationen der gefrorenen Bestände zu.
    3. Wählen Sie die Option nach oben und unten in der Quelle, die Hefe mischen wirbeln.
    4. Das gefleckte Array Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für 2 – 3 Tage.
  3. Erzeugung von 384 Kolonie Arrays in Sc −Trp rechteckigen Platten
    1. Wählen Sie in der Roboter 96 Agarplatten als Quelle, 384 Nährbodenplatte als Ziel und 96 kurze Pin-Pads.
    2. Wählen Sie die 1:4-Array -Programm. Auf diese Weise werden die vier 96 Kolonie Platten (jeweils eine unterschiedliche TF) in eine 384 Kolonie Platte konsolidiert. Verwenden Sie den Papierkorb nicht oder überdenken Sie Optionen zur Vermeidung von Kontaminationen zwischen verschiedenen Platten zu.
    3. Die Platten Tasche und inkubieren Sie die gefleckte 384-Kolonie Array Agar-Seite bei 30 ° C für 2 Tage.
  4. Erzeugung von 1.536 Kolonie Arrays in Sc −Trp rechteckigen Platten
    Hinweis: Dadurch werden Arrays enthalten vier Kolonien für jedes TF-Beute.
    1. Wählen Sie in der Roboter 384 Agarplatten als Quelle, 1.536 Agarplatten als Ziel und 384 kurze Pin-Pads.
    2. Wählen Sie das 1:4 Assay single-Source-Programm. Ziel ist es, jede Kolonie in vier Kolonien Quadruplicates zu kopieren. Verwenden Sie den Papierkorb und überdenken Sie Optionen zu, da es beinhaltet vier Mal jede Kolonie zu kopieren.
    3. Die Platten Tasche und inkubieren Sie die gefleckte 1536-Kolonie Array Agar-Seite bei 30 ° C für 3 Tage.
  5. Verstärkung der 1.536 Kolonie Array in Sc −Trp rechteckigen Platten
    1. Wählen Sie in der Roboter 1.536 Agarplatten als Quelle, 1.536 Agarplatten als Ziel und 1.536 kurze Pin-Pads.
    2. Wählen Sie das Replizieren viele Programm, 3 – 4 Kopien zu replizieren. Verwenden Sie den Papierkorb und überdenken Sie Möglichkeit zu, aber werfen Sie das Pad beim Umschalten auf eine andere Platte des Arrays um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
    3. Die Platten Tasche und inkubieren der gefleckte 1536-Kolonie Array Agar-Seite sich bei 30 ° C für 3 Tage bis zur Paarung Schritte (siehe unten) verwenden. Danach halten Sie die Platten bei Raumtemperatur und Kopie wieder nach 7 Tagen für eine neue Runde des Screenings.

3. eY1H Bildschirm

  1. DNA-Köder Sorte Rasen vorbereiten, Paarung
    1. Vor Ort die Hefe DNA-Köder-Stämme auf einer Sc −U −H Platte und wachsen für 3 Tage bei 30 ° C.
    2. Streifen Sie die Hefe in einem 15 cm Sc −U −H Platte mit einem sterilen Zahnstocher, so, dass jede Platte 12 – 16 verschiedene Stämme passt. Inkubieren Sie eines Tages bei 30 ° C.
    3. Streifen Sie die Hefe in einem 15 cm Sc −U −H Platte mit einem sterilen Zahnstocher, so, dass jede Platte 4 verschiedene Stämme passt. Eines Tages bei 30 ° c inkubieren
    4. Kratzen Sie die Hefe mit einem sterilen Zahnstocher, und achten Sie nicht auf Schaben Agar und in ein 1,5 Rohr mit 500 µL steriles Wasser.
    5. Fügen Sie 10 – 15 sterile Glasperlen auf einer rechteckigen Platte YAPD. Fügen Sie die Hefesuspension auf den Teller und kräftig schütteln Sie, in alle Richtungen für 1 min um sicherzustellen, dass die Hefe durch die Platte verteilt ist.
    6. Umkehren Sie die Platte sofort und tippen Sie auf, so dass die Perlen in den Deckel gehen. Entfernen und die Perlen zu recyceln.
    7. Die Platten Tasche und inkubieren Agar-Seite nach unten für 1 – 2 Tage bei 30 ° C. Dann fahren Sie mit der Paarung Schritt.
  2. Paarung von Hefe DNA-Köder und TF-Array-Stämme
    1. Übertragen Sie das TF-Array zu einer rechteckigen Platte YAPD mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatte als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Replizieren viele Programm. Jeder TF-Array-Platte lässt sich auf 3 – 4 YAPD Platten (abhängig von der Anzahl der Platten in dem Array) zu übertragen. Die TF-Array-Platten verwendet für die Paarung müssen 2 – 3 Tage alt sein, aber nicht mehr als Paarung möglicherweise ineffizient.
    2. Übertragen Sie den Rasen eines DNA-Köder-Stamm auf die YAPD-Platten bereits mit dem TF-Array mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatte als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Replizieren viele Programm. Verwenden Sie einen zufälligen Offset in der Quelle mit einem Radius von ~0.6 mm um zu vermeiden, Hefe von der gleichen Stelle und mischen auf Ziel Kontakt zwischen Hefestämme zu erleichtern. Verwenden Sie den Rasen mit den DNA-Köder-Stämme (Abschnitt 3.1) als Quelle und die YAPD-Platten mit der TF-Array in Schritt 3.2.1 als Ziel gesichtet.
    3. Die Platten Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für 1 Tag.
  3. Auswahl der diploiden Hefe
    1. Übertragen Sie die begatteten Hefe aus den YAPD Platten auf Sc −U −Trp Platten mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatte als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Programm zu replizieren . Mischen Sie auf Quelle und Ziel.
    2. Die Platten Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für 2 – 3 Tage (längere Inkubationszeit führt zu hohen Hintergrundaktivität Reporter).
  4. Transfer zum Auslesen Platten
    1. Übertragen Sie die diploide Hefe aus den Sc −U −Trp Platten auf Auslesen rechteckigen Platten Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal mit dem Roboter. Wählen Sie die 1.536 Agarplatten als Quelle und Ziel und 1.536 kurze Pin-Pad. Wählen Sie das Programm zu replizieren .
    2. Die Platten Tasche und inkubieren Sie Agar-Seite bei 30 ° C für bis zu 7 Tage.
  5. Darstellung der Anzeige Platten
    1. Fotografieren Sie für DNA-Köder-Sorten mit hoher Hintergrundaktivität Reporter an den Tagen 2, 3 und 4. Andernfalls nehmen Sie Bilder bei Tag 4 und 7. Positive Interaktionen werden durch Wachstum und blaue Farbe der Hefe Kolonien identifiziert und manuell ermittelt werden, oder es kann ermittelt werden, mit Bildanalyse-Software.

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Representative Results

Drei wesentliche Faktoren berücksichtigt werden, wenn Analyse ergibt sich aus eY1H Assays: Reporter Hintergrundaktivität des DNA-Köder-Stammes, die Stärke der Reporter Aktivität entsprechend TF-DNA-Wechselwirkungen und die Anzahl der positiven Kolonien. Der Reporter Hintergrundaktivität (d. h. Autoactivity) der DNA-Köder Belastung bezieht sich auf das Wachstum und die Farbe der Hefe Kolonien auf der Platte auslesen, auch in Abwesenheit des TF-Beute. Im Idealfall nicht Autoactive Stämme zeigen eine weiße oder helle braune Hintergrundfarbe, Kolonien für positive Interaktionen, wobei größere und blau. Autoactive DNA-Köder-Stämme zeigen Hefe Wachstum in den Medien fehlt es an Histidin und eine blaue Farbe in Anwesenheit von X-gal für alle Kolonien in der Platte, was wahrscheinlich auf die Bindung von Hefe transcriptional Aktivatoren, die DNA-Köder-8zusammenhängt. Der Reporter Aktivität entspricht der TF-DNA-Wechselwirkungen erkannt (d. h. die Größe der Kolonie) und Intensität der blau richtet sich nach vielen Parametern wie die Affinität, die TF-Expression in der Hefe, die Anzahl der verbindliche Sites und Entfernung zum die Hefe minimal Promotoren befindet sich oberhalb des Reporter-Gene und Reporter Hintergrundaktivität des DNA-Köder-Stammes. Zum Beispiel kann eine schwache Wechselwirkung kann leicht erkannt werden, in einem niedrigen Hintergrund Köder jedoch schwer zu erkennen, in einem Autoactive oder unebenem Hintergrund Köder. Es ist auch wichtig um zu beachten, dass Reporter Aktivität Ebenen in der Hefe nicht unbedingt korrelieren mit der Regulierungstätigkeit in menschlichen Zellen als die Chromatinstruktur Nukleosom Positionierung, und Entfernung Effekte unterscheiden sich zwischen Hefe und menschlich. Weiter, Interaktionen in der menschlichen geeignet sind, durch die Bindung von anderen TFs und Cofaktoren beeinflusst werden oder können durch funktional redundanten TFs8maskiert werden. Schließlich sind Interaktionen als positiv in eY1H-Assays, wenn mindestens zwei der vier Kolonien Reporter Ausdruck über Hintergrund-Niveaus zeigen. Allerdings haben wir festgestellt, dass ca. 90 % der Interaktionen ergeben sich aus allen vier Kolonien entspricht einer positiven10,12,19TF identifiziert.

Zur Veranschaulichung der Ergebnisse, die mit eY1H Assays gewonnen werden kann haben wir überprüft, die Projektträger Regionen (2 kb stromaufwärts der Transkription Start Seiten) der CCL15 und IL17F Gene, gegen eine Reihe von 1.086 menschlichen TFs (Abbildung 2). Der CCL15-Promoter ist ein Beispiel von nicht-Autoactive DNA-Köder Interaktionen, wo sogar schwachen, lässt sich leicht erkannt (Abb. 2A). Der IL17F-Promoter ist ein Beispiel für ein Autoactive DNA-Köder mit unebenen Hintergrundaktivität Reporter, wo sind einige Interaktionen erkennbar, während für mehrere TFs es ungewiss ist, ob die Reporter Aktivität höher als Hintergrund (Abb. 2 b).

Probleme, die auftreten können, wenn eY1H Tests durchführen

Obwohl das Screening eY1H Protokoll ist geradlinig und robust, mehrere Probleme während des Bildschirms:

(1) Kolonien sind zu klein und nicht zu übertragen (Abbildung 3A): auch wenn davon ausgegangen wird, dass etwas Hefe mit dem Ausdruck exogene TFs langsames Wachstum anzeigen kann, da die Hefe Genexpression Dysregulated sein kann, in der Regel ~ 95 % der TF-Beute Kolonien anzeigen normal Wachstum. Wenn mehr als 10 % der Kolonien nicht wachsen, sind die häufigsten Ursachen Probleme mit den Medien oder mit der Hefe-Übertragung. Suboptimale Wachstum bezieht sich häufig auf eines der Medienkomponenten verlieren Tätigkeit (z. B. Uracil, Histidin oder Leucin), die durch die Vorbereitung Frische Medien mit frischen Stammlösungen gelöst werden können. Alternativ kann dies auch zu einem anheften Offset zusammenhängen, die Kolonie Transfer betrifft. In diesem Fall überprüfen Sie, ob die 1.536 Pads, das Zentrum der Hefe Kolonien in den Quelle-Platten anheften.

(2) kein Wachstum der Hefe in einem Teil der Platte (Abb. 3 b): dieses Problem ist in der Regel im Zusammenhang mit einen Fehler in der Paarung Schritt unterlässt die 1.536 Pin-Pad Kontakt mit der Hefe in den DNA-Köder Sorte Rasen, das TF-Array oder in der Paarungszeit Platte. In fast allen Fällen ist dies aufgrund unebenen Agar Medien Ebene während der Platte Gießen oder übermäßige der Platte trocknen.

(3) keine Wechselwirkungen erkannt (Abbildung 3 und D): dieses Problem wird oft im Zusammenhang mit entweder unbeabsichtigten inactivating Mutationen in den Genen der Reporter, in bestimmten LacZ (Abbildung 3), oder hohe Autoactivity, die Interaktionen (Abbildung Maske 3D). um dieses Problem zu beheben, es wird empfohlen, eine andere unabhängig erhaltenen Belastung entspricht des gleichen DNA-Köders auf den Bildschirm.

(4) die Platte zeigt zufällige blaue Flecken (Abbildung 3E): dieses Problem wird oft im Zusammenhang mit bakteriellen Kontamination. Um dieses Problem zu lösen, Streifen Sie die Hefe um einzelne Kolonien zu erhalten, und wiederholen Sie den Bildschirm.

Die oben genannten sind die häufigsten Probleme bei der eY1H Tests durchführen. Weitere Probleme sollten entstehen, neue Medien vorbereiten, bestätigen, dass die entsprechende Einstellungen für den HDA-Roboter verwendet wurden, und mehrere Stämme pro DNA-Köder testen würde wahrscheinlich die meisten Probleme lösen.

Figure 1
Abbildung 1 : Gliederung der eY1H Assay Bildschirme. (A) Vergleich zwischen TF-zentriert und DNA-zentrierten Methoden, Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren. (B) Schaltpläne von eY1H Assays. Eine DNA-Sequenz von Interesse (Veranstalter, Enhancer, Schalldämpfer, etc.) geklont stromaufwärts von der HIS3 und LacZ Reporter Gene Hefegenoms integriert ist. Die daraus resultierende DNA-Köder-Belastung ist eine Sammlung von Hefestämme beherbergen TFs verschmolzen mit der Gal4-Aktivierung-Domäne (AD) gedeckt. Positive Interaktionen werden bestimmt durch die Hefe Fähigkeit zu wachsen, ohne Histidin und Überwindung kompetitiver Inhibitor 3-AT, und blau, in Anwesenheit von X-gal. (C) Pipeline für eY1H-Bildschirme. Eine Rasenfläche von einer Hefe DNA-Köder Belastung gewachsen in einer YAPD-Platte ist in einem YAPD Teller auf ein 1.536 Kolonie-Array mit dem Ausdruck TFs mit AD gewachsen auf einer Sc-−Trp-Platte verschmolzen gedeckt. Nach einem Tag wird die Hefe in eine Sc −U −Trp für diploiden Hefe auswählen übertragen. Nach einer Inkubationszeit von 2 – 3 Tage wird die Hefe in eine Sc −U −H −Trp 3AT ++ X-gal-Platte (Auslesen Platte) Protein-DNA-Wechselwirkungen identifizieren übertragen. Jede Interaktion wird in Vierfachbestimmungen getestet.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Beispiele für eY1H Auslesen Platten. (A) Interaktionen mit den Promotor des CCL15, nicht Autoactive Köder. Hintergrundaktivität Reporter für diese Köder ist niedrig (weniger Wachstum in Ermangelung von Histidin und Abwesenheit der blauen Farbe für nicht-wechselwirkenden TFs). (B) Interaktionen mit den Promotor des IL17F, ein Autoactive Köder. Hintergrundaktivität Reporter für diese Köder ist hoch (Wachstum in Ermangelung von Histidin und Hintergrund blaue Farbe in der Platte) und uneben, so dass es schwierig um zu Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren. Stark, sind "Mittel" und schwachen Wechselwirkungen in rot, Orange und gelb, beziehungsweise im Quadrat. Die HGNC Namen der interagierenden TFs werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Probleme in eY1H Bildschirmen. (A) TF-Beute array wo mehrere Kolonien wachsen konnte. (B) auslesen Platte wo Kolonien in der linken unteren Ecke gescheitert sind, übertragen. (C) Non-Autoactive DNA-Köder-Sorte, die keine positive Interaktionen angezeigt werden. (D) hoch Autoactive DNA-Köder-Sorte, die keine positive Interaktionen angezeigt werden. (E) auslesen Platte Anzeigen von mehreren blauen Kolonien wegen der Verschmutzung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Spotting ein TF-array
Tag1 Vor Ort Hefe in Sc-Trp-Platte im Format 96 Kolonie (2.1 und 2.2)
Tag 4 Generieren von 384 Kolonie TF Array (2.3)
Tag 6 Generieren von 1.536 Kolonie TF Array (2.4)
Tag 9 Verstärken Sie 1.536 Kolonie TF Array (2,5)
DNA-Köder Sorte Rasen vorbereiten, Paarung
Tag 6 Vor Ort die Hefe DNA-Köder-Stämme (3.1.1)
Tag 9 Streak Hefe, 12-16 Stämme pro Platte (3.1.2)
Tag 10 Streak Hefe, 4 Sorten pro Platte (3.1.3)
Tag 11 Bereiten Sie DNA-Köder Rasen (3.1.4 und 3.1.5)
Paarung von Hefe DNA-Köder und TF-Array-Stämme
12. Tag Paarung im YAPD Platten (3.2)
Auswahl der diploiden Hefe
Tag 13 Auswahl der diploiden Hefe im Sc-U-Trp Platten (3.3)
Transfer zum Auslesen Platten
Tag 15 Transfer von diploiden Hefe zum Auslesen Platten (3.4)
Darstellung der Anzeige Platten
17-22 Tage Bildaufnahme von Auslesen Platten je nach Hintergrund (3,5)

Tabelle 1: TFF Array.

REAGENZ Menge (für 2 L)
Drop-out-Mischung synthetische minus Histidin, Leucin, Tryptophan und Uracil, Adenin, reich (2 g) w/o Basis Hefe Stickstoff 2,6 g
Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat (YNB) 3,4 g
Adenin Hemisulfate Dihydrat 160 mg
Ammoniumsulfat 10 g
Agar 35 g
Glukose (40 %, w/V) im Wasser, steril 100 mL
Leucin (100 mM), steril gefiltert 16 mL
Tryptophan (40 mM), steril gefiltert 16 mL

Tabelle 2: Reagenz Liste I.

REAGENZ Menge (für 2 L)
Pepton 40 g
Hefeextrakt 20 g
Adenin Hemisulfate Dihydrat 0,32 g
Glukose (40 %, w/V) im Wasser, steril 100 mL
Agar 35 g

Tabelle 3: Reagenz Liste II.

REAGENZ Menge (für 2 L)
Drop-out-Mischung synthetische minus Histidin, Leucin, Tryptophan und Uracil, Adenin reichen (2 g) w/o Basis Hefe Stickstoff 2,6 g
Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat (YNB) 3,4 g
Adenin Hemisulfate Dihydrat 160 mg
Ammoniumsulfat 10 g
Agar 35 g
Glukose (40 %, w/V) im Wasser, steril 100 mL
Leucin (100 mM), steril gefiltert 16 mL
Histidin (100 mM), steril gefiltert 16 mL
Uracil (20 mM), steril filtriert (für Sc – U – Trp Platten weglassen) 16 mL

Tabelle 4: Reagenz Liste III.

REAGENZ Menge (für 2 L)
Drop-out-Mischung synthetische minus Histidin, Leucin, Tryptophan und Uracil, Adenin reichen (2 g) w/o Basis Hefe Stickstoff 2,6 g
Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat (YNB) 3,4 g
Adenin Hemisulfate Dihydrat 160 mg
Ammoniumsulfat 10 g
Agar 35 g
Glukose (40 %, w/V) im Wasser, steril 100 mL
10 x BU Salze 200 mL
Leucin (100 mM), steril gefiltert 16 mL
3at (2 M), steril gefiltert 5 mL
X-gal (80 mg/mL) in DMF 4 mL

Tabelle 5: Reagenz Liste IV.

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Discussion

Der hier beschriebene stark Roboter eY1H Paarung Screening Ansatz erhöht den Durchsatz um den Satz von TFs zu identifizieren, die an eine DNA-Region, im Vergleich zu früheren Bibliothek Screening oder angeordneten Screening Ansätze beruhen auf Umwandlung zu binden. Weiter, die TF-DNA-Wechselwirkungen von eY1H, die Tests sehr reproduzierbar sind, da 90 % der Interaktionen erkannt sind positiv für alle vier Kolonien pro TF getestet, und 90 % der Interaktionen testen in einem unabhängigen Bildschirm des gleichen Hefe DNA-Köder Belastung10 erkannt , 12 , 19. TF-DNA-Wechselwirkungen von eY1H erkannt noch wichtiger ist, zu überprüfen, mit einer 40 %-70 % Rate als in menschlichen Reporter Assays12,20, in primären humanen Zellen (unveröffentlichte Ergebnisse) und in C. Elegans Knockout Tieren getestet 11. Dies ist eine ähnliche Validierung sollte möglichst mit derjenigen für ChIP-Seq Daten21beobachtet.

Obwohl Wechselwirkungen von eY1H identifiziert hoch reproduzierbar sind, wenn die gleichen Hefe DNA-Köder-Stamm die Wiederholung der Prüfungen, produziert testen verschiedene Hefestämme für die gleiche DNA-Köder manchmal anders, obwohl überlappend, Sätze von TF-DNA-Wechselwirkungen. Dies ist normalerweise aufgrund von Unterschieden in Reporter Hintergrundaktivität zwischen den Stämmen. Darüber hinaus führt die Tests Fragmente einer DNA-Sequenz in der Erkennung von mehr TF-DNA-Wechselwirkungen als Tests die vollständige Sequenz, insbesondere, wenn überlappende Fragmente getestet werden. Dies kann mit dem Assay effizienter bei der Identifizierung von Interaktionen, die in der Nähe der Reporter minimal Promotoren sind bezogen werden, und weil überlappende Prüfung Fragmente reduziert die Chancen, die eine Bindungsstelle möglicherweise verdeckt durch Hefe Nukleosomen. Also für kleinere Projekte, es wird empfohlen, dass überlappende 0,5 – 1 kb Fragmente einer regulatorischen Region getestet und, die zwei unabhängige Stämme sind für jede DNA-Köder-Sequenz8gezeigt.

Es gibt mehrere wichtige Schritte in der eY1H screening Protokoll um einige der in Abbildung 3dargestellten Probleme zu vermeiden. Zunächst, obwohl die meisten Medien Zutaten für mehrere Monate (außer 3AT und X-gal) stabil sind, zeigt einen Mangel an richtigen Koloniewachstum wahrscheinlich, dass mindestens eine der Zutaten Aktivität verloren haben kann und ersetzt werden sollte. Zweitens ist es wichtig, die rechteckigen Platten vorzubereiten, so dass der Agar abgeglichen wird und, dass sie nicht mehr als einen Tag zu vermeiden Fehler in anheften, wenn die Roboterplattform mit trocken. Schließlich ist es Schlüssel zur Nutzung der Roboterplattform Programme gemäß dem Protokoll (Revisit, Recycling, mischen, etc.) für die Hefe effektiv, zur Paarung, effizient zu sein und zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen zwischen Hefe Klone übertragen werden.

Beispiele, die wir ausgewählt, um die Verwendung von eY1H Bildschirme veranschaulichen entsprechen menschlichen Gens Förderer. Jedoch können andere regulatorischen Regionen einschließlich Enhancer und Schalldämpfer auch getestet werden. Zum Beispiel haben wir eY1H Assays verwendet, um TF Bindung an menschliche Entwicklung Enhancer und C. Elegans erste Introns12,22zu bewerten. Angesichts der Tatsache, dass Interaktionen in gewissem Sinne paarweise getestet werden, können darüber hinaus eY1H Assays verwendet werden Interaktionen zwischen nicht-codierenden Varianten sowie zwischen TF kodierenden Sequenzvarianten zu vergleichen. Mit eY1H-Assays, die wir identifiziert verändert zum Beispiel TF Bindung an 109 forensisches Varianten mit verschiedenen Erbkrankheiten und auch unterschiedliche Interaktionen Profile für 58 TF Missense-Mutationen12,14verbunden. Obwohl dieses Protokoll konzentriert sich auf die Bewertung TF Bindung an menschliche regulatorischen Regionen, können DNA-Regionen von anderen Tierarten auch getestet werden, vorausgesetzt, dass eine TF-Beute verfügbar ist oder erzeugt werden kann. In der Tat, TF-Beute-Arrays für C. Elegans10, Drosophila Melanogaster23, Mus Musculus24, Arabidopsis Thaliana25,26, erzeugt wurden und Zea mays 27. so mit zunehmend verfügbaren Ressourcen eY1H Assays auf zusätzliche Systeme angewendet werden können.

Obwohl eY1H Assays maßgeblich dazu beigetragen haben, das Repertoire der TFs identifizieren, die an unterschiedlichen regulatorischen Regionen bei Menschen und anderen Spezies zu binden, sind sie nicht frei von Einschränkungen8,11,12,19 ,20,25. Eine Einschränkung ist, dass Interaktionen im Milieu der Nucleus Hefe getestet werden und obwohl die DNA-Köder chromatinized sind, die Chromatinstruktur in der Hefe nicht der Chromatinstruktur in den Arten unbedingt von DNA-Köder Ursprung und Zelle Typ Unterschiede in vivo reflektiert nicht. So müssen Interaktionen festgelegten eY1H Assays im Reporter oder anderen funktionellen Assays validiert werden. Beachten Sie, wir und andere haben herausgefunden, TF-DNA-Wechselwirkungen erkannt durch eY1H mit einer Rate von 40 % – 70 % in funktionelle Assays11,12,20,23zu validieren. Eine weitere Einschränkung der eY1H-Assays ist, dass es nicht, dass Interaktionen mit TFs, die post-translationalen Modifikationen abwesend in der Hefe erkennt Bindung an DNA, TFs, die nicht ordnungsgemäß in der Hefe bei der Anzeige verschmolzen gefaltet werden und TFs, die aus dem Array fehlen erfordern 8. Darüber hinaus in das aktuelle Format eY1H Assays erkennen keine Interaktionen mit heterodimerisierenden TFs, wie jede Hefe-Kolonie im TF-Array eine einzige TF-Beute ausdrückt. So weitere erhöht Verbesserungen in der Probe die Breite der TFs, die getestet werden können und erweitern die Fähigkeiten von eY1H Assays, neuartige TF-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health [R35-GM128625, J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

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References

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Genetik Ausgabe 144 Hefe One-Hybrid Y1H Transkriptionsfaktor Mensch gen Verordnung DNA eY1H
Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren
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Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

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