Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Förbättrad jäst en-hybrid skärmar att identifiera transkriptionsfaktor som binder till humant DNA sekvenser

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi en förbättrad jäst en-hybrid screening protokoll för att identifiera de transkriptionsfaktorer (TFs) som kan binda till en mänsklig DNA-region av intresse. Denna metod använder en hög genomströmning screening pipeline som kan förhöra bindningen av > 1 000 TFs i ett enda experiment.

Abstract

Identifiera uppsättningarna av transkriptionsfaktorer (TFs) som reglerar varje mänsklig gen är en svår uppgift som kräver att integrera ett flertal experimentella och kalkylmässiga metoder. En sådan metod är den jäst en-hybrid (Y1H) analys, i vilken interaktioner mellan TFs och DNA testas regioner i miljön av jäst kärnan med hjälp av reporter gener. Y1H analyser innebär två komponenter: ett 'DNA-bete' (e.g., initiativtagare, smakförstärkare, ljuddämpare, etc.) och en 'TF-byte' vilket kan undersökas för reporter gen aktivering. Mest publicerade protokoll för att utföra Y1H skärmar är baserade på omvandla TF-prey bibliotek eller matriser till DNA-bete jäststammar. Här beskriver vi en rörledning, kallas utökade Y1H (eY1H)-analyser, där TF-DNA interaktioner är under parning DNA-bete stammar med en klädd samling av TF-prey stammar med en hög densitet matris (HDA) robotic plattform som tillåter screening i en 1,536 koloni-format. Detta ger en dramatisk ökning genomströmning (60 DNA-bete sekvenser mot > 1000 TFs tar två veckor per forskare) och reproducerbarhet. Vi illustrerar de olika typerna av förväntade resultat av provning mänskliga arrangören sekvenser mot en rad 1 086 mänskliga TFs, samt exempel på problem som kan uppstå under skärmar och felsökning av dem.

Introduction

Ett centralt problem i det biomedicinska fältet är att fastställa de mekanismer genom vilka varje mänsklig gen regleras. Transkription är det första steget i Kontrollera gen uttryck nivåer, och det är reglerat av uppsättningar av transkriptionsfaktorer (TFs) som är unika för varje gen. Med tanke på att människor koda för > 1 500 TFs1,2, identifiera komplett uppsättning av TFs som styr uttrycket av varje gen fortfarande en öppen utmaning.

Två typer av metoder kan användas för att mappa TF-DNA interaktioner: TF-centrerad och DNA-centrerad metoder3 (figur 1A). I TF-centrerad metoder, är en TF sevärdheter utforskad för bindning till genomisk DNA regioner eller för att avgöra dess DNA bindande särart. Dessa metoder inkluderar kromatin immunoprecipitation (ChIP) följt av hög genomströmning sekvensering, protein bindande microarrays och SELEX4,5,6. I DNA-centrerad metoder, är en DNA-sekvens av intresse utforskad för att avgöra uppsättningen TFs som binder till DNA-sekvensen. Den mest allmänt tillämpad av sådana metoder är jäst en-hybrid (Y1H) analyser, i vilka interaktioner mellan TFs och DNA testas regioner i miljön av jäst kärnan med reporter gener7,8,9.

Y1H analyser innebär två komponenter: ett 'DNA-bete' (t.ex. initiativtagare, smakförstärkare, ljuddämpare, etc.) och en 'TF-byte' vilket kan undersökas för reporter gen aktiveringen9,10 (figur 1B). DNA-betet är klonade uppströms av två reporter gener (Lindholm och HIS3) och båda DNA-bait::reporter konstruktioner är integrerade i jäst genomet att generera chromatinized 'DNA-bete stammar.' TF-bytet, kodade i en plasmid som uttrycker en TF smält till domänen aktivering (AD) av jäst Gal4 TF, införs i den DNA-bete stammen att fiska för TF-DNA interaktioner. Om TF-bytet binder till DNA-bete sekvensen, kommer då annonsen i TF-bytet leda till aktivering av både reporter gener. Celler med en positiv interaktion kan därför väljas för tillväxt på plattor saknar histidin, samt övervinna en kompetitiv hämmare, 3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT), och visualiseras som blå kolonier i närvaro av X-gal. Eftersom den potenta jästen Gal4 AD används, Y1H analyser kan upptäcka interaktioner mellan transkriptionell aktivatorer samt kvinnoförtryckarna. Dessutom, med tanke på att TF-bytesorganismer uttrycks från en stark jäst promotor (ADH1), kan interaktioner upptäckas även för TFs som har låga endogena uttryck nivåer, vilket är en utmaning för att upptäcka av ChIP11,12.

Mest publicerade protokoll för att utföra Y1H analyser bygger på att införa TF-bytesorganismer i de DNA-bete jäststammar genom att omvandla poolade TF-prey bibliotek följt av urval, koloni plocka och sekvensering att identifiera samverkande TF, eller omvandla enskilda kloner8,9. Detta är tidskrävande protokoll, begränsning av antalet DNA-sekvenser som kan testas per forskare. En nyligen förbättring av Y1H analyser, kallas enhanced Y1H (eY1H), har dramatiskt ökat dataflödet som screening med en hög densitet matris (HDA) robotic platform för att para jäststammar DNA-bete med en samling av jäststammar varje uttrycker en annan TF-byte10,13 (figur 1 c). Dessa skärmar anställa en 1 536 kolonin format gör det möjligt att testa de flesta mänskliga TFs i fyra exemplar med endast tre plåtar. Vidare, med tanke på att TF-DNA interaktioner är testade på parvisa sätt, detta tillvägagångssätt möjliggör jämföra interaktioner mellan DNA-beten (såsom två kodande enda nukleotid varianter) och mellan olika TFs eller TF varianter11,12 ,14.

Använder eY1H analyser, har vi beskrivit de största mänskliga och Caenorhabditis elegans DNA-centrerad TF-DNA interaktioner nätverk till-datum. I synnerhet har vi identifierat 2.230 interaktioner mellan 246 mänskliga utvecklingsmässiga smakförstärkare och 283 TFs12. Vidare har vi anställt eY1H analyser att avslöja förändrad TF bindning till 109 enda nukleotid kodande varianter associerade med genetiska sjukdomar såsom utvecklingsmässiga missbildningar, cancer och neurologiska sjukdomar. Mer nyligen, vi brukade eY1H avgränsa ett nätverk bestående av 21,714 interaktioner mellan 2 576 C. elegans gen promotorer och 366 TFs11. Detta nätverk bidrog till att avslöja den funktionella rollen av dussintals C. elegans TFs.

Protokollen till generera DNA-bete fläckar och utvärdera av bakgrunden reporter verksamhet har varit rapporterade någon annanstans15,16,17. Här beskriver vi ett eY1H pipeline som kan användas till skärmen någon mänsklig genomisk DNA regionen mot en rad 1 086 mänskliga TFs. När en jäst DNA-bete stam genereras och en TF-byte-matris är fläckig på motsvarande plattorna, kan hela protokollet utföras i två veckor (tabell 1). Viktigare, kan protokollet vara parallelized så att en enskild forskare kan skärmen 60 DNA-bete sekvenser samtidigt. För att demonstrera protokollet, vi initiativtagarna till två cytokingener CCL15 och IL17F. Dessutom visar vi resultat från misslyckade skärmar för att illustrera vilka typer av problem som kan uppstå när du utför eY1H analyser och felsökning av dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. förberedelser

  1. SC −U −H plattor (150 mm petriskålar)
    Obs: Dessa plattor kommer att användas för att odla de DNA-bete jäststammar.
    1. Lös den avhopp mix, jäst kväve bas (YNB), adenin hemisulfate och ammoniumsulfat i 920 mL vatten och pH till 5,9 med 5 M NaOH (ca 1 mL per liter media, se tabell 2 för sammansättning). Häll i en 2 L mätkolv och tillsätt en uppståndelse bar.
    2. I en andra 2 L mätkolv, tillsätt ägarn till 950 mL vatten (Lägg inte en uppståndelse bar eftersom det kommer att orsaka ägarn koka i autoklav).
    3. Autoklav under 40 minuter vid 15 psi på en flytande cykel.
    4. Omedelbart Häll innehållet i första kolven, inklusive baren uppståndelse, i ägarn innehållande kolv. Lägg till glukos, blanda väl på en uppståndelse tallrik och kyl till 55 ° C i ett vattenbad.
    5. Lägg till leucin och tryptofan till media. Blanda väl på en uppståndelse tallrik och häll i 150 mm steril petriskålar (~ 80 mL per maträtt). Torka i 3 – 5 dagar vid rumstemperatur, Linda in i plastpåsar och förvara i rumstemperatur i upp till 6 månader.
  2. YAPD rektangulära plattor
    Obs: Dessa plattor kommer att användas för växande gräsmattan för DNA-bete stammen och för parning med samlingen TF array.
    1. Lös puder (se tabell 3 för sammansättning), förutom agar, i 950 mL vatten i en 2 L mätkolv och tillsätt en uppståndelse bar.
    2. I en andra 2 L mätkolv, tillsätt ägarn till 950 mL vatten (Lägg inte en uppståndelse bar eftersom det kommer att orsaka ägarn koka i autoklav).
    3. Autoklav under 40 minuter vid 15 psi på en flytande cykel.
    4. Omedelbart Häll innehållet i första kolven, inklusive baren uppståndelse, i ägarn innehållande kolv.
    5. Lägg till glukos, blanda väl på en uppståndelse plattan och cool till 55 ° C. Häll media i de rektangulära plattorna (se Tabell för material; ~ 70 mL per platta) med en Peristaltisk pump (5 mL per sekund) och en 6 mm slang. Torka i 1 dag vid rumstemperatur, Linda in i plastpåsar och förvara i kallt rum för upp till 6 månader.
      Obs: Även om den föreslagna media är 70 mL per platta, användas 50 – 80 mL per platta. De tre kritiska frågorna att överväga när hälla plattorna är 1) att de utjämnas så att agar media har samma tjocklek i hela plattan (Använd en planat bord eller yta för plattan hälla och häll inte i högar av fler än sju plattor) 2) att säkerställa frånvaro av bubblor i ägarn media (det bör vara dök bubblor med hjälp av en steril nål) och 3) torka plattorna bara en dag och inslagning plattorna i plastpåsar för att undvika misslyckanden i fästa jäst.
  3. SC −Trp och Sc −U −Trp rektangulära plattor
    Obs: Dessa plattor kommer att användas för växande samlingen TF array (Sc −Trp) och att välja diploida jäst efter parning (Sc −U −Trp).
    1. Upplösa den avhopp mix, YNB, adenin hemisulfate och ammoniumsulfat i 920 mL vatten och pH till 5,9 med NaOH 5M (ca 1 mL per liter media) (se tabell 4 för sammansättning). Häll i en 2 L mätkolv och tillsätt en uppståndelse bar.
    2. I en andra 2 L mätkolv, tillsätt ägarn till 950 mL vatten (Lägg inte en uppståndelse bar eftersom det kommer att orsaka ägarn koka i autoklav).
    3. Autoklav under 40 minuter vid 15 psi på en flytande cykel.
    4. Omedelbart Häll innehållet i första kolven, inklusive baren uppståndelse, i ägarn innehållande kolv. Lägg till glukos, blanda väl på en uppståndelse tallrik och kyl till 55 ° C.
    5. Tillsätt leucin, histidin och uracil (utelämna uracilen för Sc −U −Trp pläterar).
    6. Blanda väl på en uppståndelse tallrik och häll i rektangulära plattor (~ 70 mL per platta) använder en Peristaltisk pump (5 mL per sekund) och 6 mm slang. Torka 1 dygn i rumstemperatur, Linda in plattorna i plastpåsar och förvara i kylrummet för upp till 3 månader.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal rektangulära plattor
    Obs:     dessa plåtar används som avläsning plattor för eY1H analyser.
    1. Upplösa den avhopp mix, YNB, adenin hemisulfate och ammoniumsulfat i 850 mL vatten (se tabell 5 för sammansättning). Gör inte pH. Häll i en 2 L mätkolv och tillsätt en uppståndelse bar.
    2. I en andra 2 L mätkolv, tillsätt ägarn till 850 mL vatten (Lägg inte en uppståndelse bar eftersom det kommer att orsaka ägarn koka i autoklav).
    3. Autoklav under 40 minuter vid 15 psi på en flytande cykel.
    4. Förbereda 10 x BU salter (1L) genom att kombinera 900 mL vatten och 70 g av Na2HPO4∙7H2O 34,5 g NaH2PO4∙H2O. Mix med en uppståndelse bar att upplösa pulver och justera pH till 7,0 med 5 M NaOH. Tillsätt vatten att föra till 1 L och autoklav.
    5. Bereda X-gal-lösning genom att tillsätta 3,5 g X-gal pulver till en 50 mL plaströr som innehåller 42,5 mL dimetylformamid. Lägga till X-gal pulver i dimetylformamid att upplösa lättare (detta tar 30 min). Hålla stamlösning i mörkret (Använd ogenomskinlig 50 ml tub eller luckan i folie). Förvaras vid-20 ° C.
    6. Omedelbart Häll innehållet i första kolven, inklusive baren uppståndelse, i ägarn innehållande kolv. Tillsätt glukos och 10 x BU salter (se tabell 5 för sammansättning), blanda väl på en uppståndelse tallrik och kyl till 55 ° C.
    7. Tillsätt leucin, 3AT och X-gal (se tabell 5 för sammansättning).
    8. Blanda väl på en uppståndelse tallrik och häll i de rektangulära plattorna (~ 70 mL per platta) med en Peristaltisk pump (5 mL per sekund) och en 6 mm slang. Torka i 1 dag vid rumstemperatur, Linda in i plastpåsar och förvara i kylrummet omfattas i aluminiumfolie (3AT och X-gal är ljuskänsligt) för upp till 1 månad.

2. spotting en TF-matris

  1. Upptining arrayen TF-byte
    1. Tina de jäst glycerol lager plattorna med arrayen TF-byte på is.
      Obs: TF-prey matriser kan genereras som tidigare publicerade10,12,13,18.
    2. Återsuspendera jästen med 12-kanals pipett inom 1 – 3 min innan nästa steg.
  2. Spotting jästen i Sc −Trp rektangulära plattor
    1. I HDA roboten (se Tabell för material), Välj 96 plattor med flera som källa, 96 agarplattor som målet och 96 lång pin pads.
      Obs: PIN-pads är inte återanvändbara och ska kasseras.
    2. Välj det Replikera många programmet för att göra två kopior per plattan med 96 brunnar. Använd inte återvinna eller återbesök alternativ att undvika tillbaka kontaminering av frysta bestånden.
    3. Välj alternativet att snurra upp och ner i källan att blanda jästen.
    4. Väska prickig matrisen och inkubera agar-sida upp vid 30 ° C i 2 – 3 dagar.
  3. Generera 384 kolonin matriser i Sc −Trp rektangulära plattor
    1. I roboten, Välj 96 agarplattor som källa, 384 agarplatta som mål och 96 kort pin pads.
    2. Välj 1:4 Array programmet. På detta sätt konsolideras fyra 96 kolonin plattor (som var och en innehåller en olika TF) i en 384 kolonin plattan. Använd inte återvinna eller återbesök alternativ för att undvika kontaminering mellan olika plattor.
    3. Väska plattorna och inkubera fläckig 384-koloni array agar-Sidan upp vid 30 ° C i 2 dagar.
  4. Generera 1 536 kolonin matriser i Sc −Trp rektangulära plattor
    Obs: Detta kommer att resultera i matriser som innehåller fyra kolonier för varje TF-byten.
    1. I roboten, Välj 384 agarplattor som källa, de 1 536 agarplattor som mål och 384 kort pin pads.
    2. Välj 1:4 assay enda källprogrammet. Målet är att kopiera varje koloni till fyra kolonier att erhålla quadruplicates. Använd återvinna och återbesök alternativ som det innebär att kopiera fyra gånger varje koloni.
    3. Väska plattorna och inkubera fläckig 1536-koloni array agar-Sidan upp vid 30 ° C i 3 dagar.
  5. Förstärka matrisen 1 536 koloni i Sc −Trp rektangulära plattor
    1. I roboten, väljer du 1 536 agarplattor som källa, 1 536 agarplattor som mål och 1 536 kort pin pads.
    2. Välj Replikera många program att replikera 3 – 4 kopior. Använda återvinna och återkomma alternativet, men kasta ut pad när du byter till en annan platta av matrisen att undvika korskontaminering.
    3. Väska plattorna och inkubera fläckig 1536-koloni array agar-Sidan upp vid 30 ° C i 3 dagar för parning steg (se nedan). Efter det, hålla plattorna med rumstemperatur och kopiera igen efter 7 dagar för en ny omgång av screening.

3. eY1H skärm

  1. Förbereda DNA-bete stam gräsmattor för parning
    1. Spot jästen DNA-bete stammar på en Sc −U −H platta och växa i 3 dagar vid 30 ° C.
    2. Strimma jästen i en 15 cm Sc −U −H plattan med hjälp av en steril tandpetare, så att varje platta passar 12 – 16 olika stammar. Inkubera en dag vid 30 ° C.
    3. Strimma jästen i en 15 cm Sc −U −H plattan med hjälp av en steril tandpetare, så att varje platta passar 4 olika stammar. Inkubera i en dag vid 30 ° C.
    4. Skrapa jästen med hjälp av en steril tandpetare, se till att inte skrapa någon agar och lägga till en 1,5 rör med 500 µL sterilt vatten.
    5. Lägga till 10 – 15 sterila glaspärlor på YAPD rektangulär plåt. Tillsätt jästsuspensionen på plattan och skaka noggrant i alla riktningar för 1 min att säkerställa jästen sprids genom alla plattan.
    6. Vänd på plattan omedelbart och tryck så att pärlorna gå till locket. Ta bort och återanvända pärlorna.
    7. Väska plattorna och inkubera agar-sida ner i 1 – 2 dagar vid 30 ° C. Fortsätt sedan till parning steg.
  2. Parning av jäst DNA-bete och TF array stammar
    1. Överföra TF matrisen till en YAPD rektangulär platta med roboten. Välj den 1 536 agarplattan som källa och mål, och 1 536 kort PIN-pad. Välj Replikera många program. Varje TF array platta kan användas för att överföra till 3 – 4 YAPD plattor (beroende på antalet plattor i matrisen). TF array plattorna används för parning måste vara 2 – 3 dagar gammal men inte mer som parning kan vara ineffektiva.
    2. Överföra gräsmattan av en DNA-bete stam till YAPD pläterar redan innehåller arrayen TF med roboten. Välj den 1 536 agarplattan som källa och mål, och 1 536 kort PIN-pad. Välj Replikera många program. Använd en slumpmässig förskjutning i källan med en radie av ~0.6 mm för att undvika att ta jäst från samma plats, och blanda på målet att underlätta kontakten mellan jäststammar. Använd gräsmattan som innehåller DNA-bete stammar (avsnitt 3.1) som källa och YAPD plattorna som innehåller arrayen TF fläckig i steg 3.2.1 som mål.
    3. Väska plattorna och inkubera agar-sida upp vid 30 ° C i 1 dag.
  3. Urval av diploida jäst
    1. Överföra Parade jästen från YAPD plattorna till Sc −U −Trp plattor med roboten. Välj den 1 536 agarplattan som källa och mål, och 1 536 kort PIN-pad. Välj programmet Replikera . Blanda på källa och mål.
    2. Väska plattorna och inkubera agar-sida upp vid 30 ° C i 2 – 3 dagar (längre inkubation leder till hög bakgrund reporter aktivitet).
  4. Överföra till avläsning plattor
    1. Överföra diploida jästen från Sc −U −Trp plattorna till avläsning rektangulära plattor Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal använda roboten. Välj de 1 536 agarplattor som källa och mål, och 1 536 kort PIN-pad. Välj programmet Replikera .
    2. Väska plattorna och inkubera agar-sida upp vid 30 ° C i upp till 7 dagar.
  5. Avbildning av avläsning plattor
    1. För DNA-bete stammar med hög bakgrund reporter verksamhet, ta bilder på dagar 2, 3 och 4. Annars, ta bilder på dagar 4 och 7. Positiva interaktioner identifieras av tillväxt och blå färg av jäst kolonierna och manuellt kan bestämmas, eller det kan bestämmas med hjälp av bild analys programvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre huvudsakliga faktorer övervägas när analysera resultat från eY1H analyser: bakgrunden reporter aktiviteten av DNA-bete stammen, styrkan i aktiviteten reporter motsvarar TF-DNA interaktioner och antalet positiva kolonier. Bakgrunden reporter verksamhet (dvs. autoactivity) DNA-bete stammen avser den totala tillväxt och färg av jäst kolonierna i avläsning plattan, även i avsaknad av ett TF-byte. Helst icke-autoactive stammar visar en vit eller ljus brun bakgrundsfärg, med kolonier för positiva interaktioner är större och blå. Autoactive DNA-bete stammar Visa jäst tillväxt i media saknar histidin och en blå färg i närvaro av X-gal för alla kolonier i plattan, vilket är sannolikt relaterat till bindningen av jäst transkriptionell aktivatorer till DNA-bete8. Reporter aktiviteten motsvarar TF-DNA interaktionen upptäcks (dvs. storleken av kolonin) och intensiteten av blå styrka beror på många parametrar såsom affinitet, TF uttryck nivån i jäst, antalet bindande platser och avstånd till jästen minimal initiativtagarna ligger uppströms reporter generna och aktiviteten bakgrund reporter DNA-bete stam. Exempelvis en svag växelverkan enkelt kan upptäckas i ett låg bakgrund bete men kan vara svåra att upptäcka i en autoactive eller ojämn bakgrund bete. Det är också viktigt för att notera att reportern aktivitet nivåer i jäst inte nödvändigtvis korrelerar med lagstiftningsverksamhet i mänskliga celler, som kromatinstruktur, nukleosomens positionering, och avstånd effekterna är olika mellan jäst och mänskliga. Vidare har interaktioner i mänskliga sannolikt kommer att påverkas av bindningen av andra TFs och kofaktorer eller kan maskeras av funktionellt överflödig TFs8. Slutligen, interaktioner anses positiva eY1H analyser när minst två av de fyra kolonierna visar reporter uttrycket ovan bakgrundsnivåerna. Dock har vi observerat att ~ 90% av interaktioner identifieras resultatet från alla fyra kolonier motsvarar en TF positiva10,12,19.

För att illustrera vilken typ av resultat som kan erhållas med hjälp av eY1H analyser vi arrangören regionerna (2 kb uppströms transkription start platser) CCL15 och IL17F generna, mot en rad 1 086 mänskliga TFs (figur 2). CCL15 arrangören är ett exempel av ett icke-autoactive DNA-bete där interaktioner, även svaga, lätt kan identifieras (figur 2A). IL17F arrangören är ett exempel på en autoactive DNA-bete med ojämn bakgrund reporter aktivitet, där vissa interaktioner kan upptäckas medan för flera TFs är det osäkert huruvida aktiviteten reporter är högre än bakgrunden (figur 2B).

Problem som kan uppstå när du utför eY1H analyser

Även om screening eY1H protokoll är rättfram och robust, flera problem kan uppstå under skärmen:

(1) kolonier är för liten och inte överföring (figur 3A): även om det förväntas att några jäst uttrycker exogena TFs kan visa långsam tillväxt med tanke på att jäst genuttryck kan vara dysreglerad, ~ 95% av TF-prey kolonier visas normalt normala tillväxt. Om mer än 10% av kolonierna inte växa, är mest frekventerar orsakar problem med media eller med jäst överföringen. Suboptimal tillväxt är ofta relaterad till en av mediekomponenter förlorar aktivitet (t.ex. uracil, histidin, eller leucin), som kan lösas genom att förbereda färska media med färska stamlösningar. Alternativt kan detta också vara relaterade till en anslå förskjutning som påverkar kolonin överföring. I det här fallet verifiera att 1 536 kuddar fästa mitten av jäst kolonierna i källa tallrikar.

(2) ingen jäst tillväxt i en del av plattan (figur 3B): problemet är generellt relaterade med ett misslyckande i parning steg om 1 536 PIN-pad misslyckas att göra kontakt med jästen i DNA-bete stam gräsmattan, TF matrisen, eller parning plattan. I nästan samtliga fall detta på grund av ojämn agar media nivå under plattan hälla eller på grund av överdriven torkning dig av plattan.

(3) inga interaktioner identifieras (figur 3 c och D): denna fråga är ofta relaterade till antingen oavsiktliga inactivating mutationer i generna som reporter, i synnerhet Lindholm (figur 3 c), eller hög autoactivity som maskera interaktioner (figur 3D). för att felsöka problemet, det rekommenderas att skärmen ett annat självständigt erhållna stam motsvarar samma DNA-betet.

(4) plattan presenterar slumpmässigt blå fläckar (figur 3E): denna fråga är ofta relaterade till bakteriell kontamination. För att lösa problemet, streak jästen för att få enskilda kolonier, och upprepa skärmen.

Ovanstående är de vanligaste problemen när du utför eY1H analyser. Andra problem bör uppstå, förbereda nya medier, bekräftar att lämpliga inställningar för HDA robot användes, och testa flera stammar per DNA-bete skulle sannolikt lösa de flesta problem.

Figure 1
Figur 1 : Skissera av eY1H assay skärmar. (A) jämförelse mellan TF-centrerad och DNA-centrerad metoder att identifiera protein-DNA interaktioner. (B) scheman över eY1H analyser. En DNA-sekvens av intresse (promotorn, enhancer, ljuddämpare, etc.) klonade uppströms av HIS3 och Lindholm reporter gener är integrerad i jäst genomet. Den resulterande DNA-bete stammen är parad med en samling av jäststammar som härbärgerat TFs smält till domänen Gal4 aktivering (AD). Positiva interaktioner bestäms av jästens förmåga att växa utan histidin och övervinna kompetitiv hämmare 3-AT och slå blå i närvaro av X-gal. (C) rörledningen för eY1H skärmar. En gräsmatta en jäst DNA-bete stam odlas i en YAPD platta är parad i en YAPD tallrik 1 536 koloni av faciliteter att uttrycka TFs smält till AD vuxit på en Sc −Trp tallrik. Efter en dag överförs jästen till en Sc −U −Trp att välja för diploida jäst. Efter en 2 – 3 dagars inkubation överförs jästen till en Sc −U −H −Trp + 3AT + X-gal plattan (avläsning plattan) att identifiera protein-DNA interaktioner. Varje interaktion testas i fyra exemplar.  Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Exempel på eY1H avläsning plattor. (A) interaktioner som främjare av CCL15, ett icke-autoactive-bete. Bakgrunden reporter aktivitet för detta bete är låg (lägre tillväxt i avsaknad av histidin och avsaknad av blå färg för icke-interagera TFs). (B) interaktioner som främjare av IL17F, en autoactive-bete. Bakgrunden reporter aktivitet för detta bete är hög (tillväxt i avsaknad av histidin och bakgrunden blå färg hela plattan) och ojämn, vilket gör det svårt för att identifiera protein-DNA interaktioner. Stark, medium och svaga interaktioner är fyrkant i rött, orange och gul, respektive. HGNC namnen på samverkande TFs visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Problem i eY1H skärmar. (A) TF-byte array där flera kolonier misslyckades att växa. (B) avläsning tallrik där kolonier i det nedre vänstra hörnet har misslyckats med att överföra. (C) icke-autoactive DNA-bete stam som inte visar positiva interaktioner. (D) mycket autoactive DNA-bete stam som inte visar positiva interaktioner. (E) avläsning plattan visar flera blå kolonier på grund av kontamination. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Spotting en TF-matris
Dag 1 Spot jäst till Sc – Trp plåt i 96 kolonin format (2.1 och 2.2)
Dag 4 Generera 384 kolonin TF array (2,3)
Dag 6 Generera 1 536 kolonin TF array (2,4)
Dag 9 Förstärka 1 536 kolonin TF array (2,5)
Förbereda DNA-bete stam gräsmattor för parning
Dag 6 Spot jästen DNA-bete stammar (3.1.1)
Dag 9 Strimma jäst, 12-16 stammar per platta (3.1.2)
Dag 10 Strimma jäst, 4 stammar per platta (3.1.3)
Dag 11 Förbereda DNA-bete gräsmattor (3.1.4 och 3.1.5)
Parning av jäst DNA-bete och TF array stammar
Dag 12 Parning i YAPD pläterar (3.2)
Urval av diploida jäst
Dag 13 Urval av diploida jäst i Sc – U – Trp plåt (3.3)
Överföra till avläsning plattor
Dag 15 Överföra diploida jäst till avläsning plattor (3,4)
Avbildning av avläsning plattor
Dagar 17-22 Bild förvärv av avläsning plattor beroende på bakgrunden (3,5)

Tabell 1: TFF matris.

REAGENS KVANTITET (för 2 L)
Drop-out mix syntetiska minus histidin, leucin, tryptofan och uracil adenin, rik (2 g) utan jäst kväve bas 2.6 g
Jästen kväve bas utan aminosyror och ammoniumsulfat (YNB) 3.4 g
Adenin hemisulfate dihydrat 160 mg
Ammoniumsulfat 10 g
Agar 35 g
Glukos (40%, w/v) i vatten, steril 100 mL
Leucin (100 mM), sterila filtreras 16 mL
Tryptofan (40 mM), sterila filtreras 16 mL

Tabell 2: Reagens förteckning I.

REAGENS KVANTITET (för 2 L)
Pepton 40 g
Jästextrakt 20 g
Adenin hemisulfate dihydrat 0,32 g
Glukos (40%, w/v) i vatten, steril 100 mL
Agar 35 g

Tabell 3: Reagent List II.

REAGENS KVANTITET (för 2 L)
Drop-out mix syntetiska minus histidin, leucin, tryptofan och uracil, adenin rich (2 g) utan jäst kväve bas 2.6 g
Jästen kväve bas utan aminosyror och ammoniumsulfat (YNB) 3.4 g
Adenin hemisulfate dihydrat 160 mg
Ammoniumsulfat 10 g
Agar 35 g
Glukos (40%, w/v) i vatten, steril 100 mL
Leucin (100 mM), sterila filtreras 16 mL
Histidin (100 mM), sterila filtreras 16 mL
Uracil (20 mM), sterila filtreras (utelämna för Sc – U – Trp plåt) 16 mL

Tabell 4: Reagent List III.

REAGENS KVANTITET (för 2 L)
Drop-out mix syntetiska minus histidin, leucin, tryptofan och uracil, adenin rich (2 g) utan jäst kväve bas 2.6 g
Jästen kväve bas utan aminosyror och ammoniumsulfat (YNB) 3.4 g
Adenin hemisulfate dihydrat 160 mg
Ammoniumsulfat 10 g
Agar 35 g
Glukos (40%, w/v) i vatten, steril 100 mL
10 x BU salter 200 mL
Leucin (100 mM), sterila filtreras 16 mL
3at (2 M), sterila filtreras 5 mL
X-gal (80 mg/mL) i DMF 4 mL

Tabell 5: Reagens förteckning IV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den robotic eY1H parning screening metod som beskrivs här kraftigt ökar genomflödet för att identifiera uppsättningen av TFs som binder till en DNA-region av intresse, jämfört med tidigare bibliotek screening eller klädd screening metoder som bygger på omvandling. Ytterligare, TF-DNA interaktionen upptäcks av eY1H analyser finns mycket reproducerbara som 90% av interaktioner upptäckt positiva för alla fyra kolonier testas per TF, och 90% av interaktioner testa i en oberoende skärmen i samma jäst DNA-bete stam10 , 12 , 19. viktigare, TF-DNA interaktioner identifieras av eY1H validera i 40 – 70% takt när den testas i mänskliga reporter analyser12,20, i primära mänskliga celler (opublicerade resultat) och i C. elegans knockout djur 11. Detta är en liknande validering takt som observerats för ChIP-seq data21.

Även om interaktioner identifieras av eY1H är mycket reproducerbara när omanalys samma jästen DNA-bete stam, producerar testa olika jäststammar för samma DNA-bete ibland olika, även om, överlappande av TF-DNA interaktioner. Detta beror vanligen på skillnader i bakgrunden reporter aktivitet mellan stammar. Dessutom testar fragment av en DNA-sekvens resulterar i att upptäcka fler TF-DNA interaktioner än testa den fullständiga sekvensen, i synnerhet när överlappande fragment testas. Detta kan vara relaterat med analysen att vara effektivare i att identifiera interaktioner som ligger nära reporter minimal initiativtagarna och eftersom testning överlappande fragment minskar chanserna för att en bindande webbplats kan vara ockluderas av jäst nucleosomes. Således, för småskaliga projekt, det rekommenderas att överlappande 0,5 – 1 kb fragment av en reglerande region är testade och som två oberoende stammar screenas för varje DNA-bete sekvens8.

I området i närheten finns det flera kritiska steg i eY1H screening protokoll för att undvika några av de frågor som presenteras i figur 3. Först, även om de flesta media ingredienser är stabila i flera månader (utom 3AT och X-gal), en brist på ordentlig kolonin tillväxt sannolikt anger att minst en av ingredienserna kan ha förlorat aktivitet och bör ersättas. Andra, det är viktigt att förbereda rektangulära plåtarna så att ägarn är planat och så att de inte torkar för mer än en dag att undvika misslyckande i fästa när du använder robotic plattformen. Slutligen är det för att använda de robotic platform program som anges i protokollet (återbesök, recycle, blandning, etc.) för jästen för att överföras effektivt, för parning vara effektiv, och för att undvika korskontaminering mellan jäst kloner.

De exempel som vi valt för att illustrera användningen av eY1H skärmar motsvarar mänsklig gen promotorer. Andra regulatoriska regioner kan emellertid också testas inklusive smakförstärkare och ljuddämpare. Till exempel har vi använt eY1H analyser för att utvärdera TF bindande mänskliga utvecklingsmässiga smakförstärkare och C. elegans första introner12,22. Dessutom, med tanke på att interaktioner är testade på ett sätt som parvisa, kan eY1H analyser användas att jämföra interaktioner mellan icke-kodande varianter och mellan TF kodande sekvens varianter. Till exempel förändrad använder eY1H analyser vi identifierat TF bindning till 109 kodande varianter associerade med olika genetiska sjukdomar, och även differentiell interaktioner profiler för 58 TF missense mutationer12,14. Även om detta protokoll fokuserar på utvärdering av TF bindande mänskliga regulatoriska regioner, kan DNA-regioner från andra arter också testas under förutsättning att en TF-prey finns eller kan genereras. Faktiskt, TF-prey matriser har genererats för C. elegans10, Drosophila melanogaster23, Mus musculus24, Arabidopsis thaliana25,26, och Zea mays 27. således med alltmer tillgängliga resurser, eY1H analyser kan tillämpas på ytterligare system.

Även om eY1H analyser har varit avgörande för att identifiera repertoaren av TFs som binder till olika regulatoriska regioner i mänskliga och andra arter, är de inte gratis varningar8,11,12,19 ,20,25. En av begränsningarna är att interaktioner testas i miljön av jäst kärnan och, även om de DNA-beten är chromatinized, kromatinstruktur i jäst kanske inte återspeglar kromatinstrukturen arten från där DNA-betet har sitt ursprung i och återspeglar inte cell typ skillnader observerades i vivo. Interaktioner av eY1H analyser måste således valideras i reporter eller andra funktionella analyser. Obs, vi och andra har hittat TF-DNA interaktioner identifieras av eY1H validera i 40 – 70% takt i funktionella analyser11,12,20,23. En annan begränsning av eY1H analyser är att det inte kan upptäcka interaktioner mellan TFs som kräver post-translationella modifieringar frånvarande i jäst att binda till DNA, TFs som inte är ordentligt vikta i jäst när smält till AD och TFs som saknas från array 8. Dessutom i det aktuella formatet, eY1H analyser inte upptäcka interaktioner mellan heterodimeriskt TFs, som varje jäst koloni i matrisen TF uttrycker ett enda TF-byte. Således, ytterligare förbättringar i analysen kommer att öka bredden av TFs som kan testas och utöka kapaciteten hos eY1H analyser att identifiera roman TF-DNA interaktioner

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av National Institutes of Health [R35-GM128625 till J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Tags

Genetik fråga 144 jäst en-hybrid Y1H transkription faktorn människa genen förordning DNA eY1H
Förbättrad jäst en-hybrid skärmar att identifiera transkriptionsfaktor som binder till humant DNA sekvenser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter